Том 89, № 4 (2012)

В статье рассмотрены основные итоги изучения проблемы персистенции микроорга- низмов за последние два десятка лет на 7 Всероссийских конференциях в Оренбурге. Обозначены вехи как фундаментальных исследований, так и работ прикладного значения, оценена роль персистентного потенциала микроорганизмов в инфекционной патологии. Наметившийся поворот исследований от персистенции к симбиозу созвучен идее интер- национального проекта Микробиом человека и позволяет использовать персистентный потенциал микроорганизмов в качестве одного из инструментов решения вопросов ин- фектологии.

Цель. Оценить влияние мутаций в генах Listeria monocytogenes, кодирующих муреин- тетрапептид L,D-карбоксипептидазы Lmo0028 и Lmo1638, на динамику инфекционного процесса и взаимодействие очищенных муропептидов с рецептором NOD1. Материалы и методы. Использованы штамм дикого типа EGDe и рекомбинантные штаммы GIMins1638 и GIMins0028, полученные на его основе методом сайт-специфического мутагенеза. Динамику инфекционного процесса изучали на модели внутривенной инфекции мышей линии BALB/c. Активность лиганд-рецепторного взаимодействия муропептидов, выде- ленных из рекомбинантных и родительского штаммов, проверяли на клетках линии HEK293-hNOD1, экспрессирующие NOD1 рецептор и содержащих в своем геноме ре- портерный ген ƒ-галактозидазы под контролем экспрессии NF-kB зависимого промотера. Результаты. Отсутствие Lmo0028 замедляет размножение листерий в печени животных, начиная с 24 часов и в дальнейшие сроки после заражения, тогда как отсутствие Lmo1638 приводит к увеличению микробной нагрузки через 6 и 24 часа после инфицирования, не оказывая влияния на дальнейшую инфекцию. Различий в активации NOD1 рецептора муропептидами, выделенными из рекомбинантных и родительского штаммов, обнаруже- но не было. Заключение. Несмотря на высокую гомологию, муреин-тетрапептид L,D- карбоксипептидазы Lmo0028 и Lmo1638 вносят различный вклад в развитие инфекцион- ного процесса, вызываемого L. monocytogenes у мышей линии BALB/c. Отсутствие различий в активации NOD1 рецептора может быть связано с компенсацией энзимати- ческих функций в штаммах с мутацией в каждом из генов благодаря наличию гомологич- ного белка.

Цель. Разработать модель in vitro для изучения продукции цитокинов моноцитарными клетками, инфицированными Chlamydia trachomatis, опосредованную системой секреции III типа (ССТТ). Материалы и методы. В экспериментах использовали штамм C.trachomatis L2/434/Bu, которым заражали культуру человеческих моноцитов U-937. Уровень воспалительных цитокинов измеряли на проточном анализаторе Bio-Plex 200 (Bio-Rad Laboratories). В качестве ингибитора ССТТ использовали низкомолекулярное соединение LHC-342, относящееся к классу гетероциклических соединений. Результаты. Через 24 часа после инфицирования культурой C.trachomatis в клетках U-937 индуцируются 8 анализируемых цитокинов (ИЛ-1ƒ, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ГМ-КСФ, ƒ-Инф, ФНО-ƒ). Наиболее выраженное увеличение наблюдали в случае ИЛ-8, ГМ-КСФ и ƒ-Ифн. Внесение ингибитора ССТТ к культуре инфицированных клеток подавляло хламидийный рост, но при добавлении FeSO4 рост хламидий восстанавливался. При этом активность, связанная с транслокацией эффекторного белка CCTT IncA на мембрану включения, была подавлена. В условиях полученной модели ингибирования ССТТ при внутриклеточном развитии C.trachomatis наблюдали значительное снижение уровня 2 провоспалительных цитокинов, ИЛ-6 и ИЛ-1ƒ. Заключение. Цитокиновый ответ играет ключевую роль в протективном иммунном ответе при хламидийной инфекции, но в тоже время, индуцирует иммунопатологические состояния. Полученные данные дают основание предполагать участие ССТТ C.trachomatis в индукции данного звена иммунного ответа, что требует дальнейшего детального изучения.

Цель. Определить видовой состав и персистентные свойства грибов рода Candida, изо- лированных из разных биотопов организма человека при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника. Материалы и методы. Выделено и идентифициро- вано 152 штамма грибов рода Candida от лиц с дисбиозами и больных инфекционно- воспалительными заболеваниями. У изолятов определена антилактоферриновая и sIgA- протеазная активность иммуноферментным анализом. Результаты. Показано, что до- минирующим видом, выделяемом из всех изученных биотопов, явился вид C. albicans. Установлено широкое распространение изученных свойств у грибов рода Candida и их зависимость от видовой принадлежности, биотопа выделения, формы инфекционного процесса, степени дисбиотических нарушений в кишечнике. Заключение. Полученные данные расширяют представление о биологических свойствах грибов рода Candida, спо- собствующих их длительному переживанию в организме хозяина.

Цель. Определение распространенности генетических детерминант вирулентности среди штаммов энтерококков, входящих в состав кишечной микробиоты человека. Материалы и методы. В исследовании использовали 81 штамм энтерококков, выделенных из кишечника людей при обследовании на дисбиоз. Идентификацию штаммов осущест- вляли с помощью мультиплексной ПЦР. Гемолитическую и желатиназную активность определяли чашечным методом; гены, кодирующие синтез факторов вирулентности (gelE, sprE, cylM, cylB, cylA, esp) - с помощью ПЦР. Результаты. Выявлен широкий набор ге- нетических детерминант вирулентности у микроорганизмов вида E. faecalis. Заключение. Штаммы микроорганизмов рода Enterococcus кишечной микробиоты человека, обладаю- щие вирулентным потенциалом, могут стать причиной эндогенной инфекции. Полученные данные могут быть использованы для прогнозирования риска развития эндогенных эн- терококковых инфекций.

Цель. Изучение влияния экзометаболитов B. bifidum на биологические свойства бактерий, представителей нормофлоры, и их способность взаимодействовать с ассоциативными микросимбионтами. Материалы и методы. В исследованиях были использованы штаммы бактерий, представителей нормальной микрофлоры кишечника человека: B. bifidum, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium и Escherichia coli лактозопозитивные негемолитические (lac +/hly -). В качестве условно патогенных микроорганизмов использовали культуры E. coli лактозонегативные гемолитические (lac -/hly +), Kkebsiella pneumoniaе и Staphylococcus aureus. Выделение и идентификацию микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами в соответствии с методическими рекомендациями. В первой серии экспериментов изучали влияние метаболитов B. bifidum на биологические свойства микроорганизмов, представителей нормофлоры. Во второй серии - влияние супернатантов бифидобактерий на взаимоотношения B. bifidum, L. acidophilus, E. faecium и E. coli lac +/hly - с условно патогенными ассоциантами. Ростовые свойства (РС), образование биопленок (БПО) и антилизоцимную активность микроорганизмов исследовали фотометрическим способом. Измерения оптической плотности производили на фотометре ELx808 (BioTek, США). Полученные данные обработали непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни. Результаты. Установлено, что супернатант B. bifidum в 33,3 - 66,7% случаев стимулировал или не изменял рост/размножение, БПО и АЛА микроорганизмов, характерных для эубиоза кишечника и, в том числе, бактерий своего вида, что может иметь значение при реализации бифидобактериями колонизационной резистентности биотопа. Выявлены особенности взаимодействия экзометаболитов бифидобактерий с микроорганизмами, характерными для эубиоза кишечника человека, заключающиеся в усилении или смене эффектов влияния представителей нормофлоры на БПО ассоциантов. Максимальное усиление ингибирующего действия индигенных штаммов под воздействием бифидобактерий отмечено в ассоциациях E. coli lac +/hly - - E. coli lac -/hly +, а также E. faecium - S. аureus. Заключение. Таким образом, полученные данные возможно использовать для выявления механизмов функционирования нормального микросимбиоценоза при ассоциативном симбиозе человека.

Цель. Изучить у бактерий, обитающих в высокоминерализованных водоемах, распространенность и выраженность персистентных свойств и определить их роль при взаимодействии с галофильными гетеротрофными простейшими. Материал и методы. Изучено 300 штаммов бактерий и 3 культуры гетеротрофных простейших, изолированных из водоемов с минерализацией 2 - 350 г/л. Антилизоцимную (АЛА), антигистоновую (АГА) активность бактерий, лизоцим простейших оценивали чашечным и фотометрическим методами. Гистоны простейших определяли цитохимически. Взаимодействие простейших и Escherichia coli оценивали при экспериментальном сокультивировании. Результаты. У галофильных гетеротрофных простейших выявлено присутствие лизоцима и гистонов. Показано, что распространенность АЛА и АГА у бактерий увеличивается по мере снижения минерализации водоема. Установлено, что интенсивность элиминации E. coli из рапы зависит от уровня АЛА бактерий и от фагоцитарной активности простейших. Выявлено участие галотолерантных простейших в формировании гетерогенности популяции бактерий по АЛА. Заключение. В биоценозах высокоминерализованных водоемов выявлено функционирование систем лизоцим-антилизоцим, гистон-антигистон. Бактерии с высоким персистентным потенциалом могут ухудшать санитарные показатели высокоминерализованных водоемов, процессы самоочищения которых напрямую зависят от фагоци тарной активности простейших.

Показано значение симбиотических связей, сформированных по типу ассоциативного симбиоза, для автохтонной и аллохтонной микрофлоры природных водоемов. На ряде примеров доказана общность механизмов симбиотических взаимодействий симбионтов в пресноводных и галофильных сообществах, обеспечиваемых со стороны хозяина секретируемыми факторами естественной резистентности, а со стороны симбионтов - факторами персистенции. Представлены особенности работы функциональных систем лизоцим-антилизоцим, гистон-антигистон, перекись водорода-каталаза в условиях симбиотических взаимодействий автотрофных и гетеротрофных компонентов гидробиоценоза с участием доминантной и ассоциативной микрофлоры. Показано, что ассоциативная микрофлора аллохтонного происхождения активно использует экологически сложившуюся систему взаимоотношений между гидробионтами, что способствует выживанию этих микроорганизмов и сохранению их персистентного потенциала и, как следствие, приводит к нарушению биоценоза. Полученные знания открывают новые возможности и перспективы исследований санитарных и экологических аспектов жизнедеятельности водных биоценозов.

Работа посвящена рассмотрению и анализу материалов о транслокации микрофлоры и ее продуктов из кишечника во внутреннюю среду макроорганизма и персистенции биологически активных веществ микрофлоры в кровотоке. Показана высокая частота транслокациии и персистенции кишечной микрофлоры и ее компонентов в системном кровотоке. Персистирующие биологически активные субстанции эндогенных микроорганизмов принимают участие в физиологии и патологии человека.

Цель. Изучение особенности персистенции бактерий Burkholderia cepacia у больных муковисцидозом. Материалы и методы. За период с 2008 по 2009 год из Российского центра муковисцидоза получено 56 штаммов B.cepacia, выделенных от детей, больных муковисцидозом. Было проанализировано 114 историй болезней детей разных возрастных групп, больных муковисцидозом. Для идентификации бактерий B.cepacia использовали разработанный алгоритм идентификации и типирования, включающий фенотипические и молекулярно-биологические методы. Генотипирование штаммов проводили методом RAPD-ПЦР со случайным олигонуклеотидным праймером, а также методом пульсэлектрофореза. Результаты. Установлено, что особенностью персистентной инфекции при муковисцидозе является персистенция ассоциаций микроорганизмов в 59,4% случаев. Особенностью персистенции штаммов B.cepacia, у пациентов с диагнозом смешанная форма муковисцидоза, тяжелое течение является персистенция в ассоциации с бактериями Pseudomonas aeruginоsa. Бактерии B.cepacia, способные персистировать у больных муковисцидозом, характеризуются устойчивостью ко многим антибиотикам. Доказана длительная (до 1 года 5 мес.) персистенция штаммов B.cepacia, выделенных от одного больного, с помощью мониторинга микрофлоры нижних дыхательных путей. Заключение. Бактерии B.cepacia могут колонизировать нижние дыхательные пути больных муковисцидозом, длительно персистировать и передаваться от пациента к пациенту.

Цель. Изучить неизвестные ранее формы персистенции Mycoplasma hominis в организме хозяина. Материалы и методы. Для выявления микоплазм использовали культуральный метод. Идентификацию проводили серологическими, электронно-микроскопическим методами, классической ПЦР и ПЦР в реальном времени; циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) выделяли преципитацией ПЭГ. Результаты. Выделить из крови классические культуры микоплазм ни разу не удалось. В то же время, из образцов сыворотки крови с высокой частотой выделяли культуры мини-колоний, состоящие из мини-клеток, которые с трудом пассировались, но иногда образовывали сплошной газон из таких же колоний. При пересевах в течение более одного года они никогда не приобретали классическую форму. Показано, что в составе ЦИК присутствуют не только антигены M. hominis, но и ее ДНК. Из циркулирующих иммунных комплексов были выделены жизнеспособные клетки, образующие мини-колонии, идентичные тем, которые выделяли из сыворотки крови. Представлена система доказательств идентичности выделяемых культур M.hominis. Культуры обладали инфекционностью и способностью к персистенции в органах экспериментально инфицированных мышей. Заключение. Выделенные формы являются, по-видимому, результатом адаптации микоплазм к факторам гуморального иммунитета.

Цель. Изучение экспрессии цитокинов вагинальными эпителиоцитами в процессе взаимодействий с доминантными и ассоциативными микросимбионтами. Материалы и методы. Исследована экспрессия IL-8, IL-6, IL-1ƒ и TNFƒ вагинальными эпителиоцитами в ответ на взаимодействие с термоинактивированными Lactobacillus. spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Corynebacterium spp. или их секреторными продуктами в сравнении с базальной экспрессией цитокинов вагинальными эпителиоцитами. Результаты. Показано, что секреторные продукты лактобацилл не оказывали влияния на экспрессию IL-8 и IL-1ƒ и умеренно стимулировали экспрессию IL-6 и TNFƒ. Контакт эпителиоцитов с термоинактивированными лактобациллами усиливал секрецию IL-8, IL-6 и IL-1ƒ и снижал продукцию TNFƒ. Секреторные продукты S.aureus и E.coli вызывали стимуляцию продукции IL-6, IL-1ƒ и практически не изменяли экспрессию IL-8 и TNFƒ. Контакт эпителиоцитов с термоинактивированным S.aureus подавлял продукцию TNFƒ и не влиял на экспрессию IL-8, IL-6 и IL-1ƒ, контакт с E.coli стимулировал экспрессию TNFƒ и IL-1ƒ и подавлял экспрессию IL-6. Изменение экспрессии цитокинов при взаимодействии эпителиоцитов с коринебактериями было во многом аналогично результатам взаимодействия с лактобациллами, за исключением продукции IL-6, которая выраженно стимулировалась секреторными продуктами коринебактерий. Заключение. При эпителиально-бактериальных взаимодействиях доминантные и ассоциативные микроорганизмы оказывают дифференцированное влияние на функциональное состояние мукозальных эпителиоцитов, проявляющееся в изменении продукции цитокинов, что может быть основой регуляции мукозального иммунитета.

Цель. Определить роль возбудителей оппортунистических инфекций в этиологии обструктивных бронхитов и длительных субфебрилитетов у детей. Материалы и методы. Обследованы 56 детей с диагнозом обструктивный бронхит и 46 детей с диагнозом длительный субфебрилитет на наличие герпетической, микоплазменной и пневмоцистной инфекций. Использованы методы ИФА, НРИФ, быстрый культуральный метод (БКМ), ПЦР. Результаты. Наибольшее количество случаев микст-инфекции было выявлено среди детей с ВГЧ-6 инфекцией. В 6 раз чаще у детей с обструктивным бронхитом и в 9 раз у детей с длительным субфебрилитетом диагностировали микст-инфекцию. Количество детей с пневмоцистозом в сочетании с другими инфекциями было в 2,4 и 2 раза больше, чем с моно-инфекцией; с ЦМВ-инфекцией - в 4 и 2 раза; с ВПГ-инфекцией - в 5 и 4 раза; с ВЭБ-инфекцией в 6 и 3,7 раза. Исключение составил только микоплазмоз, выявленный у детей с обструктивным бронхитом, где отличие между числом случаев моно- и микст-инфекций было незначительным. Заключение. Полученные данные свидетельствуют о широком распространении оппортунистических инфекций.