Том 100, № 2 (2023)

Введение. Комплекс антигенов условно-патогенных бактерий (КАУПБ) обладает протективным эффектом в отношении вируса гриппа птиц, вируса герпеса 2-го типа и других вирусов, вызывающих острые респираторные вирусные заболевания. В связи с пандемией COVID-19 актуально выяснить, обладает ли КАУПБ протективным эффектом в отношении коронавируса SARS-CoV-2.

Цель работы — изучить in vitro вирусингибирующую активность КАУПБ в отношении лабораторного штамма коронавируса SARS-CoV-2 Dubrovka.

Материалы и методы. В работе использовали клеточную линию Vero CCL-81, мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК), мышиные моноклональные антиидиотипические антитела, структурно имитирующие биологические эффекты интерферонов (ИФН) человека, лабораторный штамм вируса SARS-CoV-2 Dubrovka. Инфекционную активность вируса определяли двумя методами: титрованием вируса методом предельных разведений на клеточных культурах с оценкой результатов по цитопатическому действию и методом бляшкообразования. Реакция ингибирования вируса поставлена in vitro на клеточной культуре, чувствительной к вирусу SARS-CoV-2, с внесением в клеточную культуру cмеси определённой дозы вируса к двукратным разведениям КАУПБ после предварительного 2-часового взаимодействия препарата с вирусом при 4ºС. Вирусингибирующую активность КАУПБ в отношении SARS-CoV-2 определяли по показателям функциональной активности α/β- и γ-рецепторов ИФН (Р_ИФН) на МКПК человека, индуцированных in vitro КАУПБ и смесью КАУПБ с определённой дозой вируса SARS-CoV-2. Уровень экспрессии Р_ИФН оценивали в реакции непрямой мембранной иммунофлуоресценции.

Результаты. Для выявления ингибирующего белка SARS-CoV-2 поставлена реакция гемагглютинации с эритроцитами кур, мышей, морских свинок и человека. В лизате клеток Vero CCL-81, инфицированных SARS-CoV-2 Dubrovka, обнаружены максимальная гемагглютинирующая активность с эритроцитами морской свинки и низкие титры гемагглютинации в вируссодержащей жидкости. В реакции ингибирования вируса на культуре клеток Vero CCL-81 КАУПБ ингибировал 10 доз SARS-CоV-2 Dubrovka с титром 1 : 32 cо 100% защитой клеточной культуры в течение 8 сут (период наблюдения). КАУПБ индуцировал экспрессию Р_ИФН-α/β и -γ на мембранах МКПК человека при культивировании in vitro и снижал экспрессию Р_ИФН-α/β и -γ при предварительном взаимодействии с SARS-CoV-2 Dubrovka.

Заключение. На основе экспериментальных исследований, включающих реакцию ингибирования вируса на культуре клеток, чувствительных к SARS-CoV-2 Dubrovka, и в реакции непрямой мембранной иммунофлуоресценции с использованием для детекции моноклональных антиидиотипических антител, имитирующих ИФН-подобные свойства, продемонстрировано, что КАУПБ обладает иммуномодулирующей и вирусингибирующей активностью.

Введение. Bacillus anthracis — возбудитель сибирской язвы, патоген, характеризующийся высокой генетической мономорфностью, затрудняющей дифференциацию штаммов, в связи с чем актуальна разработка эффективных методов молекулярного типирования.

Цель исследования. Выбор маркерных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) для типирования генетических групп B. anthracis и разработка метода их лабораторного определения с использованием HRM-ПЦР.

Материалы и методы. Выравнивание корового генома 222 штаммов B. anthracis из базы данных GenBank и 66 штаммов из коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора проводили с использованием программы «Parsnp». Дендрограмму на основе 7242 SNP корового генома построили в программе «MEGA X». Штаммы для валидации метода HRM включали представителей различных генетических групп. Реакцию HRM-ПЦР проводили с использованием наборов «Type-it HRM PCR Kit» и «KAPA HRM FAST qPCR Kit» на амплификаторе ДНК «Rotor Gene» с функцией HRM. Анализ и визуализацию данных выполняли пользовательскими скриптами в среде разработки языка Python и языка R.

Результаты и обсуждение. Определены маркерные SNP для 6 генетических групп B. anthracis, позволяющие определять принадлежность штаммов к одному из 7 новых субкластеров. Подобраны пары праймеров, оптимизированы параметры HRM-ПЦР для дискриминации разных аллелей SNP-локусов и разработана схема анализа.

Заключение. Таким образом, выбраны маркерные SNP для определения генетических субкластеров B. anthracis A.Br.CEA, A.Br.STI, A.Br.Tsiankovskii, B.Br.Europe, B.Br.Sibеria, B.Br.Asia, B.Br.018 и разработан новый лабораторный метод молекулярного субтипирования B. anthracis с использованием HRM-ПЦР.

Введение. Устойчивость к противомикробным препаратам является глобальной проблемой здравоохранения. Salmonella spp., которые могут передаваться человеку через контаминированную пищевую продукцию, признаны важными патогенами пищевого происхождения во всём мире.

Материалы и методы. Исследования противомикробной резистентности 358 изолятов микроорганизмов из пищевых продуктов и воды, изолированных на территории Республики Беларусь в 2018–2021 гг., проводились путём изучения фенотипических и генотипических характеристик антибиотикорезистентности микроорганизмов. Таксономическое положение бактерий было идентифицировано методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Фенотипическую чувствительность бактерий к антимикробным препаратам определяли методом минимальной подавляющей концентрации с помощью автоматизированного бактериологического анализатора «Sensititre» и диско-диффузионным методом к 45 противомикробным препаратам. Гены устойчивости к противомикробным препаратам у мультирезистентных изолятов сальмонелл определяли с помощью полногеномного секвенирования.

Результаты. Анализ фенотипической чувствительности бактерий in vitro показал высокую чувствительность к фторхинолонам (97,2%), цефалоспоринам 3-го поколения (93,9%), карбапенемам (98,0%), ампициллину (81,8%), аминогликозидам (97,5%), тетрациклинам (87,5%), хлорамфениколу (93,8%), триметоприм/сульфаметоксазолу (ко-тримоксазолу) (95,3%) и колистину (85,2%). Показано, что механизм резистентности к антибиотикам у S. enterica был ассоциирован с наличием генов blaTEM-1B (82%), blaTEM-1C (7,7%), blaSHV-12 (2,6%), blaDHA-1 (2,6%), blaCMY-2 (7,7%), qnrB2 (9,1%), qnrB4 (9,1%), qnrB5 (9,1%), qnrB19 (72,7%), aac(6’)-Ib-cr (9,1%), aac(6’)-Iaa (100%), aadA1 (13,2%), aadA2 (8,8%), tetB (74,3%), tetA (25,7%), tetM (2,9%), tetD (28,6%), mcr-9 (1,5%).

Заключение. Все изоляты микроорганизмов были фенотипически высокочувствительны к препаратам 1-й линии в терапии сальмонеллёза: фторхинолонам и цефалоспоринам 3-го поколения. Результаты полногеномного секвенирования мультирезистентных изолятов сальмонелл (19,0%) выявили гены устойчивости к 9 группам антибиотиков: аминогликозидам (100%), бета-лактамам (57,4%), фторхинолонам (16,2%), тетрациклинам (51,5%), макролидам (1,5%), фениколам (30,4%), триметоприму (13,0%), сульфаниламидам (47,8%) и колистину (1,4%). Таким образом, для контроля устойчивости к противомикробным препаратам среди сальмонелл пищевого происхождения решающее значение имеет эпидемиологический надзор за их распространением в цепи пищевых продуктов.

Введение. Основным биологическим сырьём при производстве иммунобиологических препаратов для индикации и идентификации Bacillus anthracis являются специфические антигены — протективный антиген (ПА) и белок ЕА1.

Цель работы — определить антигенную идентичность иммунодоминантных белков, выделенных гель-хроматографией и электрофорезом, различных геновариантов B. anthracis.

Материалы и методы. В работе использованы культуральные фильтраты изогенных вариантов штамма B. anthracis 575/122 (рХО1⁺, рХО2⁺): R01 (pXO1⁺, pXO2^–); R00 (pXO1^–, pXO2^–). Гель-хроматографическое фракционирование и электрофоретическое разделение проведено по стандартным методикам. Антигенные свойства белков, выделенных гель-хроматографией и электрофорезом, изучены в реакции иммунодиффузии с поликлональными моноспецифическими сыворотками к ПА и белку ЕА1 S-слоя.

Результаты. При гель-хроматографическом разделении культуральных фильтратов B. anthracis 575/122: R01 (pXO1⁺, pXO2^–) и R00 (pXO1^–, pXO2^–) получены фракция 1 и фракция 5. Сыворотки к белку ЕА1, а также к фракции 1 культуральных фильтратов штаммов B. anthracis 575/122 R00 и B. anthracis 575/122 R01 выявили идентичные антигены. Сыворотка к антигенам фракции 5 B. anthracis 575/122 R01 содержит антитела к ряду белков, в том числе к ПА, выделенному электрофорезом.

Обсуждение. В ходе работы была установлена антигенная идентичность иммунодоминантных белков, выделенных гель-хроматографией и электрофорезом.

Заключение. Таким образом, нами в электрофорезе и гель-хроматографией выделены белок ЕА1 и ПА, которые могут быть использованы для получения моноклональных и поликлональных моноспецифических антител, пригодных для конструирования диагностических препаратов.

Развитие технологий секвенирования и биоинформатического анализа дало возможность проведения молекулярно-эпидемиологических исследований, в которых нуклеотидные последовательности вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) используются в качестве дополнительной характеристики пациента. При этом наиболее значимым с практической точки зрения направлением работ является изучение распространения лекарственной устойчивости (ЛУ) ВИЧ. В различных странах для организации таких исследований применяются базы данных, являющиеся хранилищами генетической и эпидемиологической информации. Российская база данных устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам (https://hivresist.ru/) была создана в 2009 г. Тем не менее длительное время её применение оставалось ограниченным. С 2021 г. после обновления нормативных документов внесение результатов исследований ЛУ ВИЧ в российскую базу данных устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам стало обязательным. В связи с этим были проведены работы по усовершенствованию базы данных и увеличению её функциональных возможностей. Были разработаны различные способы внесения клинико-эпидемиологических и генетических данных. На момент написания публикации российская база данных ЛУ ВИЧ содержала 10 626 уникальных записей о пациентах и 13 126 нуклеотидных последовательностей, загруженных 10 учреждениями. Для анализа данных были разработаны следующие функции: контроль качества эпидемиологической и клинической информации о пациенте, контроль качества нуклеотидных последовательностей, проверка на контаминацию, субтипирование, выявление мутаций ЛУ, определение вирусного тропизма и генерация стандартизированных отчётов. В планах по дальнейшему развитию российской базы данных ЛУ ВИЧ — разработка инструмента для выявления и анализа молекулярных кластеров и адаптация для рутинного использования в рамках эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

В 2017 г. ВОЗ включила лихорадку Ласса в перечень приоритетных патогенов для разработки вакцин и объявила чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения по вызываемой им инфекции.

Анализ данных литературы по строению генома вируса Ласса и его штаммовому многообразию показал, что молекулярная гетерогенность штаммов существенна при конструировании вакцин и оценке их эффективности, что определено соответствующими рекомендациями ВОЗ. При репродукции вирус Ласса противодействует клеточному иммуногенезу — подавляет экспрессию супрессора сигнальных белков, цитокинов и рецептора RLR, распознающего вирусную двухсегментированную РНК.

Белок GP, определяющий инфекциозность возбудителя и тропизм, должен быть основной мишенью для разрабатываемых вакцин. Другие мишени — процессы синтеза вирусной РНК, определяющие особенности иммуногенеза. Исследование иммуногенеза лихорадки Ласса показывает, что предпочтительным кандидатом была бы реплицирующаяся апатогенная вакцина, способная индуцировать оптимальное сочетание клеточных и гуморальных ответов, т.е. вызывающая высокую активность Т-лимфоцитов и выработку вируснейтрализующих антител. Одной из важнейших характеристик живой кандидатной вакцины должна быть генетическая стабильность для исключения реверсии в направлении к более патогенному генотипу.

Из сконструированных более 130 кандидатных вакцин против лихорадки Ласса лишь две (рекомбинант на платформе вируса кори и ДНК-вакцина) как наиболее перспективные испытаны на иммуногенность и безвредность для людей. Для дальнейшей разработки перспективны рекомбинант вируса Ласса с вирусом везикулярного стоматита и реассортанты вирусов Мопейя (MOPV/LASV — ML29) и Ласса (r3ML29). Перспективна кандидатная вакцина rVSVΔG/LVGPC, аналогичная по конструкции вакцине rVSVΔG-ZEBOV-GP против лихорадки Эбола.