Еffect of the essential oil of Satureja montana L. on the growth of cultures of conditionally pathogenic microorganisms

Full Text

Введение

Современные антимикробные препараты могут вызывать различные побочные эффекты при длительном применении, что ограничивает их использование в медицине. К тому же устойчивость микроорганизмов к синтетическим химиопрепаратам постоянно возрастает [1, 2].

Лекарственные травы и эфирные масла издавна служили в народной медицине для лечения и профилактики различных заболеваний, в том числе инфекционных, в пищевой промышленности, парфюмерии, мыловарении и т.д. [3].

Медицина является важным потребителем эфирных масел [4]. В Регистр лекарственных средств РФ включены около 40 препаратов отечественного производства, содержащих эфирные масла и их компоненты. В основном это средства антисептического, противовоспалительного и ранозаживляющего действия [5, 6]. На протяжении многих лет изучались антимикробные свойства эфирных масел мяты, чабера, орегано, корицы, чайного дерева, гвоздики, эвкалипта и др. Доказано, что мишенями действия компонентов масел являются внутренние структуры микробной клетки [7].

Эфирные масла содержат противомикробные компоненты, которые высокоактивны против широкого спектра микроорганизмов, включая некоторые вирусы, микоплазмы и простейшие [8]. Эфирные масла являются натуральными, экологически безопасными, низкотоксичными веществами, к ним не формируется резистентность микроорганизмов, они обладают минимальным перечнем побочных эффектов [9].

Крым является регионом, в котором традиционно возделываются эфиромасличные и лекарственные растения, поэтому возможно использовать данный потенциал для разработки новых отечественных антимикробных препаратов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний [8, 10].

Чабер горный (Satureja montana L.) используют в кулинарии как пряность и консервант, в косметологии — как очищающее и успокаивающее средство для кожи, а также как средство против алопеции; он оказывает спазмолитическое, болеутоляющее, мочегонное, антидепрессивное, антиоксидантное и ряд других воздействий на организм человека и животных, что нашло применение в медицине и ветеринарии. В состав растения входят карвакрол, цимин, тимол, пинены, лимонен, цинеол, борнеол, терпинеол и ряд минорных компонентов, таких как р-кариофиллен, геранилацетат и др. — всего более 19 веществ, а также витамины А, В₁, В₆, РР, комплекс макро- и микроэлементов. Природные горечи и фитонциды чабера уничтожают патогенные микроорганизмы, а также плесневые грибы и гельминты. При этом эфирное масло чабера горного (МЧГ) обладает гораздо меньшими побочными эффектами, чем противогрибковые препараты группы полиенов: в 6,5 раза менее токсично, чем натриевая соль нистатина, и в 12,9 раза — чем амфотерицин В [8].

Целью исследования было изучение влияния эфирного МЧГ на рост культур условно-патогенных микроорганизмов.

Материалы и методы

Эфирное МЧГ (урожай 2019 г.) получали методом исчерпывающей гидропародистилляции из воздушно-сухого сырья [11]. Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа показали, что в образцах МЧГ содержатся карвакрол (49,88%), пара-цимен (15,76%), γ-терпинен (15,28%), α-пинен (2,52%), α-терпинен (2,07%) и тимол (0,23%).

Изучение антимикробной активности МЧГ проводили на референтных штаммах Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922 и дрожжеподобных грибах Candida albicans ССМ 885 из коллекции живых культур кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Медицинской академии им. С.И. Георгиевского. Для ряда экспериментов также использовали 9 клинических изолятов S. aureus, выделенных из зева давших добровольное информированное согласие пациентов Городской больницы г. Симферополя № 7 с различной ЛОР-патологией (690, 701, 713, 718, 720, 752, 760, 762, 766), и 2 изолята S. aureus, выделенные из морской воды вблизи стока городской канализации г. Судак (М1 и М3).

Протокол исследования одобрен Комитетом по этике Крымского федерального университета им. В.И. Вернадского» (протокол № 12 от 14.12.2021).

Кратковременное действие МЧГ на рост референтных штаммов микроорганизмов исследовали в соответствии с Европейским стандартом определения скорости инактивации микроорганизмов исследуемым веществом [12]. Использовали цельное МЧГ, а также его водные эмульсии в соотношении объёмов (v/v) масло : вода — 1 : 10 и 1 : 100. В контрольных вариантах культуры инкубировали в стерильной дистиллированной воде, в вариантах опыта микроорганизмы вносили в соответствующие разбавления МЧГ. Во всех образцах использовали суспензию суточных культур плотностью 10 ед. мутности для бактерий и 20 ед. мутности для грибов по стандарту Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Пробы перемешивали на лабораторном встряхивателе со скоростью 150 об/мин в течение 10–60 мин. Через 10 мин и 1 ч из контрольного и опытных образцов производили посев на мясо- пептонный агар для бактерий и среду Сабуро для грибов по методу Голда [13]. Результат учитывали через 24 ч роста в термостате при 37°С.

Для изучения длительного воздействия МЧГ на клинические изоляты S. aureus бактерии культивировали в 96-луночном планшете. Из суточных культур бактерий готовили суспензии плотностью 10 ед. мутности по стандарту ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Объём инокулята составлял 20 мкл. Исследовали антибактериальное действие разведений МЧГ 1 : 100 и 1 : 1000 (v/v) в ростовой среде. Контролем служили образцы с культурами без добавления МЧГ. В начале опыта, а затем через каждый час в течение 24 ч роста при 37°С измеряли оптическую плотность суспензий бактерий при длине волны 540 нм с помощью прибора «Multisсan». Оптическая плотность среды при 540 нм составляла 0,267. Подавление роста стафилококков в опытных образцах сравнивали с контрольными, разницу выражали в процентах. Через 24 ч из образцов суспензионных культур производили посев на мясо-пептонный и желточно-солевой агары в чашки Петри для оценки характера подавления роста бактерий МЧГ. Бактерицидным действием считали отсутствие роста бактерий на среде, бактериостатическим — наличие колоний.

Влияние МЧГ на образование биоплёнок клиническими изолятами S. аureus исследовали в 96-луночном планшете по методу [14]. Использовали разведение МЧГ в среде (v/v) 1 : 10. Плотность биоплёнок оценивали через 24 ч при 620 нм по интенсивности окраски экстрагированного этанолом генцианвиолета, связанного бактериями биоплёнки.

Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М) из 8 повторений, ошибку среднего арифметического значения (m), и представляли в виде M ± m. После проведения проверки вариационных рядов на нормальность распределения согласно критерию Шапиро–Уилка различия между контрольными и опытными значениями оптической плотности оценивали при помощи критерия Стьюдента, достоверными считали результаты при р ≤ 0,05.

Результаты

Результаты кратковременного (10–60 мин) действия цельного МЧГ, а также его разведений 1 : 10 и 1 : 100 на рост S. aureus АТСС 25923, E. coli АТСС 25922 и дрожжеподобных грибов C. albicans ССМ 885 представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Число КОЕ/мл культур условно-патогенных микроорганизмов при кратковременном воздействии МЧГ и его разведений / Table 1. The number of CFU/ml of cultures of conditionally pathogenic microorganisms with short-term exposure to savory essential oil and its dilutions

Время воздействия, мин Exposure time, min	S. aureus АТСС 25923, КОЕ/мл | CFU/ml				E. coli АТСС 25922, КОЕ/мл | CFU/ml				C. аlbicans ССМ 885, КОЕ/мл | CFU/ml
	контроль control	1 : 1	1 : 10	1 : 100	контроль control	1 : 1	1 : 10	1 : 100	контроль control	1 : 1	1 : 10	1 : 100
10	105	0	0	0	105	0	0	0	105	0	0	103
60	104	0	0	0	105	0	0	0	5 × 104	0	0	103

 

Как показали проведённые исследования, цельное МЧГ, а также его разведения 1 : 10 и 1 : 100 при кратковременном действии (10–60 мин) полностью подавляли рост референтных штаммов условно-патогенных бактерий; рост штамма C. аlbicans ССМ 885 ингибировался цельным МЧГ и его разведением 1 : 10, а разведение МЧГ 1 : 100 оказывало бактериостатический эффект, снижая количество микроорганизмов в 100 раз.

Результаты длительного (24 ч) действия разведения 1 : 100 МЧГ на суспензионные культуры клинических изолятов S. aureus представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Оптическая плотность биомассы суспензионных культур S. aureus при воздействии разведения МЧГ 1 : 100 (λ = 540 нм) / Table 2. Optical density of biomass suspension cultures S. aureus exposed to a 1:100 dilution of savory essential oil (λ = 540 nm)

Разведение МЧГ Savory oil dilution	Оптическая плотность среды Optical density of medium	Оптическая плотность культур S. aureus* | Optical density of S. aureus cultures*
		АТСС 25923	690	701	713	718	720	752	760	762	766
Контроль Сontrol	0,267	0,610 ± 0,017	0,780 ± 0,020	0,657 ± 0,016	0,770 ± 0,020	0,762 ± 0,022	0,634 ± 0,024	0,862 ± 0,032	0,901 ± 0,024	0,869 ± 0,022	0,783 ± 0,021
1 : 100		0,293 ± 0,013*	0,309 ± 0,012*	0,299 ± 0,012*	0,301 ± 0,011*	0,302 ± 0,012*	0,313 ± 0,014*	0,316 ± 0,015*	0,345 ± 0,012*	0,345 ± 0,014*	0,357 ± 0,013*
% к контролю % to control	–	48,0 ± 4,0	39,6 ± 2,5	45,5 ± 3,0	39,1 ± 2,5	39,6 ± 2,8	49,4 ± 4,1	36,7 ± 3,1	38,3 ± 2,4	39,7 ± 2,6	45,6 ± 3,0
1 : 1000	0,267	0,291 ± 0,013*	0,305 ± 0,016*	0,301 ± 0,015*	0,306 ± 0,017*	0,304 ± 0,014*	0,316 ± 0,017*	0,326 ± 0,015*	0,335 ± 0,016*	0,339 ± 0,020*	0,362 ± 0,018*
% к контролю % to control	–	48,0 ± 3,7	39,1 ± 3,0	45,8 ± 3,5	39,7 ± 3,3	39,9 ± 3,0	49,8 ± 5,0	37,8 ± 3,0	37,2 ± 2,8	39,0 ± 3,3	46,2 ± 3,7
Рост на среде Growth on medium	–	+	–	+	–	–	+	+	+	+	+

Примечание. *р ≤ 0,05 по сравнению с контролем.

Note. *р ≤ 0.05 compared to the control.

 

Показатели оптической плотности культур клинических изолятов и референтного штамма S. aureus в среде с добавлением разведения МЧГ в разведении 1 : 100 незначительно отличались от плотности среды без бактерий (0,267), варьируя от 0,293 до 0,357, в то время как значения плотности при росте тех же культур без МЧГ составляли 0,610–0,901, в зависимости от изолята бактерий. При разведении МЧГ 1 : 1000 показатели роста были схожи с таковыми при разведении 1 : 100. В целом ингибирование роста составляло более 50%. Таким образом, разведения МЧГ 1 : 100 и 1 : 1000 оказывали выраженное антибактериальное действие на культуры золотистого стафилококка, степень которого зависела от изолята бактерий. Для определения характера действия МЧГ после 24 ч культивирования производили высев суспензионной культуры на мясо-пептонный и желточно-солевой агары. Рост колоний бактерий наблюдался у референтного штамма S. aureus АТСС 25923 и изолятов 701, 720, 752, 760, 762, 766, что говорит о бактериостатическом действии эфирного МЧГ на эти культуры. Рост бактерий отсутствовал у изолятов 713, 718, 690, что свидетельствует о бактерицидном эффекте.

Важным показателем антимикробного действия веществ является их способность влиять на биоплёнкообразование микроорганизмов. Воздействие МЧГ в разведении 1 : 10 на способность бактерий образовывать биоплёнки изучали у клинических изолятов, а также у 2 культур S. aureus, выделенных из морской воды вблизи стока городской канализации. Восемь из 9 клинических изолятов и 2 культуры из морской воды были устойчивы к полусинтетическому бета-лактамному антибиотику амоксициллину. Три изолята продемонстрировали устойчивость к 14- и 15-членным макролидам и офлоксацину, 5 культур были умеренно устойчивы к макролидам. Три изолята (752, 762 и 760) были одновременно устойчивыми к препаратам из разных групп (амоксициллину, офлоксацину, макролидам). Оба изолята S. aureus, выделенные из моря вблизи стока городской канализации, были устойчивыми к макролидам и амоксициллину, М1 обладал также резистентностью к гентамицину. Все выделенные культуры относились к фенотипу MSSA. Контролем служил вариант с добавлением масла в среду, без бактерий. Результаты представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Оптическая плотность биоплёнок культур S. aureus при воздействии разведения МЧГ 1 : 10 (λ = 620 нм) / Table 3. Optical density of biofilms of S. aureus cultures exposed to dilution of savory essential oil 1 : 10 (λ = 620 nm)

Оптическая плотность среды Optical density of medium	Плотность биоплёнок культур S. aureus | S. aureus biofilm density
	690	701	713	718	720	752	760	762	766	М1	М3
Контроль Control	0,732 ± 0,018	0,412 ± 0,016	0,532 ± 0,017	0,381 ± 0,014	0,393 ± 0,014	0,365 ± 0,014	0,435 ± 0,015	0,443 ± 0,015	0,434 ± 0,015	0,768 ± 0,019	0,814 ± 0,018
МЧГ Savory oil	0,161 ± 0,011*	0,180 ± 0,012*	0,206 ± 0,012*	0,205 ± 0,013*	0,191 ± 0,012*	0,156 ± 0,011*	0,184 ± 0,012*	0,190 ± 0,013 *	0,189 ± 0,014*	0,205 ± 0,014*	0,207 ± 0,014*
% к контролю % to control	22,0 ± 2,60	43,7 ± 2,81	38,7 ± 3,50	53,8 ± 4,14	48,6 ± 3,59	42,7 ± 2,94	42,3 ± 2,69	42,9 ± 3,08	43,5 ± 3,16	26,7 ± 2,63	25,4 ± 2,14

Примечание. *р ≤ 0,05 по сравнению с контролем.

Note. *р ≤ 0.05 compared to the control.

 

Плотность биоплёнок стафилококков при добавлении МЧГ в разведении 1 : 10 незначительно превышала значение 0,111 в образце среды без бактерий: показатель оптической плотности колебался от 0,156 (изолят 752) до 0,207 (изолят М3). Значения оптической плотности при добавлении МЧГ к культурам стафилококка у всех 11 изолятов было в 2–4 раза меньше, чем в соответствующем контрольном образце. Для большинства изолятов ингибирование роста составляло более 50% от контроля, у культур 690, М1 и М3 оно было примерно 75%. Следовательно, МЧГ подавляло образование биоплёнок 9 клиническими изолятами S. aureus и 2 культурами, выделенными из морской воды.

Обсуждение

При изучении кратковременного действия МЧГ оказывало бактерицидное действие на рост референтных штаммов E. coli АТСС 25922 и S. aureus АТСС 2592. Рост референтного штамма C. аlbicans ССМ 885 ингибировался только цельным МЧГ и разведением 1 : 10, а МЧГ в разведении 1 : 100 оказывало бактериостатический эффект.

Эти результаты коррелируют с данными других авторов, в исследованиях которых добавление эфирного масла чабера садового вдвое усиливало бактериостатический и бактерицидный эффекты 40% этанола по отношению к E. coli [15]. В ряде других исследований показано, что фракция МЧГ обладает мощным фунгицидным действием в отношении грибов C. albicans, C. tropicalis, Aspergillus fumigatus, A. niger, Penicillium sp., Acremonium falciforme, выделенных от больных с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями [8].

Одним из направлений решения проблемы устойчивости клинических штаммов золотистого стафилококка к химиопрепаратам является использование натуральных веществ растительного происхождения, в том числе эфирных масел [16, 17]. Наши исследования показали, что МЧГ в разведениях 1 : 100 и 1 : 1000 оказывает бактериостатический эффект в отношении 70% культур золотистого стафилококка (7 изолятов) и бактерицидный эффект в отношении 30% (3 изолята). При исследованиях свойств эфирных масел растений, принадлежавших к тому же семейству, что и чабер, — душицы и тимьяна, также был выявлен антибактериальный эффект по отношению к клиническим изолятам S. aureus [18].

Важным критерием антимикробного действия различных веществ является не только подавление роста суспензионных культур микроорганизмов, но и воздействие на способность микроорганизма образовывать биоплёнки. В нашем исследовании МЧГ подавляло образование биоплёнки ряда изолятов S. aureus, снижая плотность образования биоплёнки в вариантах с добавлением МЧГ по отношению к контролю в 2–4 раза в зависимости от культуры. Эти результаты коррелируют с данными других авторов, в исследованиях которых показано ингибирование образования биоплёнок клиническими штаммами S. aureus под воздействием эфирных масел душицы обыкновенной, тимьяна обыкновенного и тимьяна даенского (семейство Яснотковые) [8, 19]. Эфирное масло душицы обыкновенной и тимьяна даенского, как и МЧГ, содержат карвакрол — фенольное соединение, обладающее высокой антибактериальной активностью. Кроме того, чабер горный, как и некоторые другие представители семейства Яснотковых (душица, тимьян), содержит тимол и терпинен [19].

Заключение

Эфирное масло чабера горного (Satureja montana L.) проявляет выраженное антимикробное действие в отношении референтных штаммов бактерий S. aureus АТСС 25923, E. coli АТСС 25922 и грибов C. albicans ССМ 885, что делает перспективным дальнейшие исследований данного растительного продукта. Антибактериальное действие МЧГ на клинические изоляты S. aureus позволяет предлагать его в качестве компонента комбинированных препаратов для лечения инфекций, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами стафилококка.

About the authors

Olga N. Postnikova

S.I. Georgievsky Medical Academy, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2113-4107

senior lecturer, Department of microbiology, virology and immunology

Russian Federation, Simferopol

Ludmila A. Shevkoplyas

S.I. Georgievsky Medical Academy, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1166-4585

assistant, Department of microbiology, virology and immunology

Russian Federation, Simferopol

Tatyana A. Kuevda

Research Institute of Agriculture of Crimea

Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0055-8605

junior researcher, Department of field crop

Russian Federation, Simferopol

Tatiana P. Sataieva

S.I. Georgievsky Medical Academy, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Author for correspondence.
Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6451-7285

D. Sci. (Med.), Head, Department of microbiology, virology and immunology

Russian Federation, Simferopol

Marina A. Kirsanova

S.I. Georgievsky Medical Academy, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: tanzcool@mail.ru

Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor, Department of microbiology, virology and immunology

Russian Federation, Simferopol

Tatyana A. Logadyr

S.I. Georgievsky Medical Academy, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2470-5374

Cand. Sci. (Med.), Associate Professor, Department of microbiology, virology and immunology

Russian Federation, Simferopol

References

Supplementary files