Влияние эфирного масла чабера горного на рост культур условно-патогенных микроорганизмов

Полный текст

Введение

Современные антимикробные препараты могут вызывать различные побочные эффекты при длительном применении, что ограничивает их использование в медицине. К тому же устойчивость микроорганизмов к синтетическим химиопрепаратам постоянно возрастает [1, 2].

Лекарственные травы и эфирные масла издавна служили в народной медицине для лечения и профилактики различных заболеваний, в том числе инфекционных, в пищевой промышленности, парфюмерии, мыловарении и т.д. [3].

Медицина является важным потребителем эфирных масел [4]. В Регистр лекарственных средств РФ включены около 40 препаратов отечественного производства, содержащих эфирные масла и их компоненты. В основном это средства антисептического, противовоспалительного и ранозаживляющего действия [5, 6]. На протяжении многих лет изучались антимикробные свойства эфирных масел мяты, чабера, орегано, корицы, чайного дерева, гвоздики, эвкалипта и др. Доказано, что мишенями действия компонентов масел являются внутренние структуры микробной клетки [7].

Эфирные масла содержат противомикробные компоненты, которые высокоактивны против широкого спектра микроорганизмов, включая некоторые вирусы, микоплазмы и простейшие [8]. Эфирные масла являются натуральными, экологически безопасными, низкотоксичными веществами, к ним не формируется резистентность микроорганизмов, они обладают минимальным перечнем побочных эффектов [9].

Крым является регионом, в котором традиционно возделываются эфиромасличные и лекарственные растения, поэтому возможно использовать данный потенциал для разработки новых отечественных антимикробных препаратов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний [8, 10].

Чабер горный (Satureja montana L.) используют в кулинарии как пряность и консервант, в косметологии — как очищающее и успокаивающее средство для кожи, а также как средство против алопеции; он оказывает спазмолитическое, болеутоляющее, мочегонное, антидепрессивное, антиоксидантное и ряд других воздействий на организм человека и животных, что нашло применение в медицине и ветеринарии. В состав растения входят карвакрол, цимин, тимол, пинены, лимонен, цинеол, борнеол, терпинеол и ряд минорных компонентов, таких как р-кариофиллен, геранилацетат и др. — всего более 19 веществ, а также витамины А, В₁, В₆, РР, комплекс макро- и микроэлементов. Природные горечи и фитонциды чабера уничтожают патогенные микроорганизмы, а также плесневые грибы и гельминты. При этом эфирное масло чабера горного (МЧГ) обладает гораздо меньшими побочными эффектами, чем противогрибковые препараты группы полиенов: в 6,5 раза менее токсично, чем натриевая соль нистатина, и в 12,9 раза — чем амфотерицин В [8].

Целью исследования было изучение влияния эфирного МЧГ на рост культур условно-патогенных микроорганизмов.

Материалы и методы

Эфирное МЧГ (урожай 2019 г.) получали методом исчерпывающей гидропародистилляции из воздушно-сухого сырья [11]. Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа показали, что в образцах МЧГ содержатся карвакрол (49,88%), пара-цимен (15,76%), γ-терпинен (15,28%), α-пинен (2,52%), α-терпинен (2,07%) и тимол (0,23%).

Изучение антимикробной активности МЧГ проводили на референтных штаммах Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922 и дрожжеподобных грибах Candida albicans ССМ 885 из коллекции живых культур кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Медицинской академии им. С.И. Георгиевского. Для ряда экспериментов также использовали 9 клинических изолятов S. aureus, выделенных из зева давших добровольное информированное согласие пациентов Городской больницы г. Симферополя № 7 с различной ЛОР-патологией (690, 701, 713, 718, 720, 752, 760, 762, 766), и 2 изолята S. aureus, выделенные из морской воды вблизи стока городской канализации г. Судак (М1 и М3).

Протокол исследования одобрен Комитетом по этике Крымского федерального университета им. В.И. Вернадского» (протокол № 12 от 14.12.2021).

Кратковременное действие МЧГ на рост референтных штаммов микроорганизмов исследовали в соответствии с Европейским стандартом определения скорости инактивации микроорганизмов исследуемым веществом [12]. Использовали цельное МЧГ, а также его водные эмульсии в соотношении объёмов (v/v) масло : вода — 1 : 10 и 1 : 100. В контрольных вариантах культуры инкубировали в стерильной дистиллированной воде, в вариантах опыта микроорганизмы вносили в соответствующие разбавления МЧГ. Во всех образцах использовали суспензию суточных культур плотностью 10 ед. мутности для бактерий и 20 ед. мутности для грибов по стандарту Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Пробы перемешивали на лабораторном встряхивателе со скоростью 150 об/мин в течение 10–60 мин. Через 10 мин и 1 ч из контрольного и опытных образцов производили посев на мясо- пептонный агар для бактерий и среду Сабуро для грибов по методу Голда [13]. Результат учитывали через 24 ч роста в термостате при 37°С.

Для изучения длительного воздействия МЧГ на клинические изоляты S. aureus бактерии культивировали в 96-луночном планшете. Из суточных культур бактерий готовили суспензии плотностью 10 ед. мутности по стандарту ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Объём инокулята составлял 20 мкл. Исследовали антибактериальное действие разведений МЧГ 1 : 100 и 1 : 1000 (v/v) в ростовой среде. Контролем служили образцы с культурами без добавления МЧГ. В начале опыта, а затем через каждый час в течение 24 ч роста при 37°С измеряли оптическую плотность суспензий бактерий при длине волны 540 нм с помощью прибора «Multisсan». Оптическая плотность среды при 540 нм составляла 0,267. Подавление роста стафилококков в опытных образцах сравнивали с контрольными, разницу выражали в процентах. Через 24 ч из образцов суспензионных культур производили посев на мясо-пептонный и желточно-солевой агары в чашки Петри для оценки характера подавления роста бактерий МЧГ. Бактерицидным действием считали отсутствие роста бактерий на среде, бактериостатическим — наличие колоний.

Влияние МЧГ на образование биоплёнок клиническими изолятами S. аureus исследовали в 96-луночном планшете по методу [14]. Использовали разведение МЧГ в среде (v/v) 1 : 10. Плотность биоплёнок оценивали через 24 ч при 620 нм по интенсивности окраски экстрагированного этанолом генцианвиолета, связанного бактериями биоплёнки.

Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М) из 8 повторений, ошибку среднего арифметического значения (m), и представляли в виде M ± m. После проведения проверки вариационных рядов на нормальность распределения согласно критерию Шапиро–Уилка различия между контрольными и опытными значениями оптической плотности оценивали при помощи критерия Стьюдента, достоверными считали результаты при р ≤ 0,05.

Результаты

Результаты кратковременного (10–60 мин) действия цельного МЧГ, а также его разведений 1 : 10 и 1 : 100 на рост S. aureus АТСС 25923, E. coli АТСС 25922 и дрожжеподобных грибов C. albicans ССМ 885 представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Число КОЕ/мл культур условно-патогенных микроорганизмов при кратковременном воздействии МЧГ и его разведений / Table 1. The number of CFU/ml of cultures of conditionally pathogenic microorganisms with short-term exposure to savory essential oil and its dilutions

Время воздействия, мин Exposure time, min	S. aureus АТСС 25923, КОЕ/мл | CFU/ml				E. coli АТСС 25922, КОЕ/мл | CFU/ml				C. аlbicans ССМ 885, КОЕ/мл | CFU/ml
	контроль control	1 : 1	1 : 10	1 : 100	контроль control	1 : 1	1 : 10	1 : 100	контроль control	1 : 1	1 : 10	1 : 100
10	105	0	0	0	105	0	0	0	105	0	0	103
60	104	0	0	0	105	0	0	0	5 × 104	0	0	103

 

Как показали проведённые исследования, цельное МЧГ, а также его разведения 1 : 10 и 1 : 100 при кратковременном действии (10–60 мин) полностью подавляли рост референтных штаммов условно-патогенных бактерий; рост штамма C. аlbicans ССМ 885 ингибировался цельным МЧГ и его разведением 1 : 10, а разведение МЧГ 1 : 100 оказывало бактериостатический эффект, снижая количество микроорганизмов в 100 раз.

Результаты длительного (24 ч) действия разведения 1 : 100 МЧГ на суспензионные культуры клинических изолятов S. aureus представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Оптическая плотность биомассы суспензионных культур S. aureus при воздействии разведения МЧГ 1 : 100 (λ = 540 нм) / Table 2. Optical density of biomass suspension cultures S. aureus exposed to a 1:100 dilution of savory essential oil (λ = 540 nm)

Разведение МЧГ Savory oil dilution	Оптическая плотность среды Optical density of medium	Оптическая плотность культур S. aureus* | Optical density of S. aureus cultures*
		АТСС 25923	690	701	713	718	720	752	760	762	766
Контроль Сontrol	0,267	0,610 ± 0,017	0,780 ± 0,020	0,657 ± 0,016	0,770 ± 0,020	0,762 ± 0,022	0,634 ± 0,024	0,862 ± 0,032	0,901 ± 0,024	0,869 ± 0,022	0,783 ± 0,021
1 : 100		0,293 ± 0,013*	0,309 ± 0,012*	0,299 ± 0,012*	0,301 ± 0,011*	0,302 ± 0,012*	0,313 ± 0,014*	0,316 ± 0,015*	0,345 ± 0,012*	0,345 ± 0,014*	0,357 ± 0,013*
% к контролю % to control	–	48,0 ± 4,0	39,6 ± 2,5	45,5 ± 3,0	39,1 ± 2,5	39,6 ± 2,8	49,4 ± 4,1	36,7 ± 3,1	38,3 ± 2,4	39,7 ± 2,6	45,6 ± 3,0
1 : 1000	0,267	0,291 ± 0,013*	0,305 ± 0,016*	0,301 ± 0,015*	0,306 ± 0,017*	0,304 ± 0,014*	0,316 ± 0,017*	0,326 ± 0,015*	0,335 ± 0,016*	0,339 ± 0,020*	0,362 ± 0,018*
% к контролю % to control	–	48,0 ± 3,7	39,1 ± 3,0	45,8 ± 3,5	39,7 ± 3,3	39,9 ± 3,0	49,8 ± 5,0	37,8 ± 3,0	37,2 ± 2,8	39,0 ± 3,3	46,2 ± 3,7
Рост на среде Growth on medium	–	+	–	+	–	–	+	+	+	+	+

Примечание. *р ≤ 0,05 по сравнению с контролем.

Note. *р ≤ 0.05 compared to the control.

 

Показатели оптической плотности культур клинических изолятов и референтного штамма S. aureus в среде с добавлением разведения МЧГ в разведении 1 : 100 незначительно отличались от плотности среды без бактерий (0,267), варьируя от 0,293 до 0,357, в то время как значения плотности при росте тех же культур без МЧГ составляли 0,610–0,901, в зависимости от изолята бактерий. При разведении МЧГ 1 : 1000 показатели роста были схожи с таковыми при разведении 1 : 100. В целом ингибирование роста составляло более 50%. Таким образом, разведения МЧГ 1 : 100 и 1 : 1000 оказывали выраженное антибактериальное действие на культуры золотистого стафилококка, степень которого зависела от изолята бактерий. Для определения характера действия МЧГ после 24 ч культивирования производили высев суспензионной культуры на мясо-пептонный и желточно-солевой агары. Рост колоний бактерий наблюдался у референтного штамма S. aureus АТСС 25923 и изолятов 701, 720, 752, 760, 762, 766, что говорит о бактериостатическом действии эфирного МЧГ на эти культуры. Рост бактерий отсутствовал у изолятов 713, 718, 690, что свидетельствует о бактерицидном эффекте.

Важным показателем антимикробного действия веществ является их способность влиять на биоплёнкообразование микроорганизмов. Воздействие МЧГ в разведении 1 : 10 на способность бактерий образовывать биоплёнки изучали у клинических изолятов, а также у 2 культур S. aureus, выделенных из морской воды вблизи стока городской канализации. Восемь из 9 клинических изолятов и 2 культуры из морской воды были устойчивы к полусинтетическому бета-лактамному антибиотику амоксициллину. Три изолята продемонстрировали устойчивость к 14- и 15-членным макролидам и офлоксацину, 5 культур были умеренно устойчивы к макролидам. Три изолята (752, 762 и 760) были одновременно устойчивыми к препаратам из разных групп (амоксициллину, офлоксацину, макролидам). Оба изолята S. aureus, выделенные из моря вблизи стока городской канализации, были устойчивыми к макролидам и амоксициллину, М1 обладал также резистентностью к гентамицину. Все выделенные культуры относились к фенотипу MSSA. Контролем служил вариант с добавлением масла в среду, без бактерий. Результаты представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Оптическая плотность биоплёнок культур S. aureus при воздействии разведения МЧГ 1 : 10 (λ = 620 нм) / Table 3. Optical density of biofilms of S. aureus cultures exposed to dilution of savory essential oil 1 : 10 (λ = 620 nm)

Оптическая плотность среды Optical density of medium	Плотность биоплёнок культур S. aureus | S. aureus biofilm density
	690	701	713	718	720	752	760	762	766	М1	М3
Контроль Control	0,732 ± 0,018	0,412 ± 0,016	0,532 ± 0,017	0,381 ± 0,014	0,393 ± 0,014	0,365 ± 0,014	0,435 ± 0,015	0,443 ± 0,015	0,434 ± 0,015	0,768 ± 0,019	0,814 ± 0,018
МЧГ Savory oil	0,161 ± 0,011*	0,180 ± 0,012*	0,206 ± 0,012*	0,205 ± 0,013*	0,191 ± 0,012*	0,156 ± 0,011*	0,184 ± 0,012*	0,190 ± 0,013 *	0,189 ± 0,014*	0,205 ± 0,014*	0,207 ± 0,014*
% к контролю % to control	22,0 ± 2,60	43,7 ± 2,81	38,7 ± 3,50	53,8 ± 4,14	48,6 ± 3,59	42,7 ± 2,94	42,3 ± 2,69	42,9 ± 3,08	43,5 ± 3,16	26,7 ± 2,63	25,4 ± 2,14

Примечание. *р ≤ 0,05 по сравнению с контролем.

Note. *р ≤ 0.05 compared to the control.

 

Плотность биоплёнок стафилококков при добавлении МЧГ в разведении 1 : 10 незначительно превышала значение 0,111 в образце среды без бактерий: показатель оптической плотности колебался от 0,156 (изолят 752) до 0,207 (изолят М3). Значения оптической плотности при добавлении МЧГ к культурам стафилококка у всех 11 изолятов было в 2–4 раза меньше, чем в соответствующем контрольном образце. Для большинства изолятов ингибирование роста составляло более 50% от контроля, у культур 690, М1 и М3 оно было примерно 75%. Следовательно, МЧГ подавляло образование биоплёнок 9 клиническими изолятами S. aureus и 2 культурами, выделенными из морской воды.

Обсуждение

При изучении кратковременного действия МЧГ оказывало бактерицидное действие на рост референтных штаммов E. coli АТСС 25922 и S. aureus АТСС 2592. Рост референтного штамма C. аlbicans ССМ 885 ингибировался только цельным МЧГ и разведением 1 : 10, а МЧГ в разведении 1 : 100 оказывало бактериостатический эффект.

Эти результаты коррелируют с данными других авторов, в исследованиях которых добавление эфирного масла чабера садового вдвое усиливало бактериостатический и бактерицидный эффекты 40% этанола по отношению к E. coli [15]. В ряде других исследований показано, что фракция МЧГ обладает мощным фунгицидным действием в отношении грибов C. albicans, C. tropicalis, Aspergillus fumigatus, A. niger, Penicillium sp., Acremonium falciforme, выделенных от больных с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями [8].

Одним из направлений решения проблемы устойчивости клинических штаммов золотистого стафилококка к химиопрепаратам является использование натуральных веществ растительного происхождения, в том числе эфирных масел [16, 17]. Наши исследования показали, что МЧГ в разведениях 1 : 100 и 1 : 1000 оказывает бактериостатический эффект в отношении 70% культур золотистого стафилококка (7 изолятов) и бактерицидный эффект в отношении 30% (3 изолята). При исследованиях свойств эфирных масел растений, принадлежавших к тому же семейству, что и чабер, — душицы и тимьяна, также был выявлен антибактериальный эффект по отношению к клиническим изолятам S. aureus [18].

Важным критерием антимикробного действия различных веществ является не только подавление роста суспензионных культур микроорганизмов, но и воздействие на способность микроорганизма образовывать биоплёнки. В нашем исследовании МЧГ подавляло образование биоплёнки ряда изолятов S. aureus, снижая плотность образования биоплёнки в вариантах с добавлением МЧГ по отношению к контролю в 2–4 раза в зависимости от культуры. Эти результаты коррелируют с данными других авторов, в исследованиях которых показано ингибирование образования биоплёнок клиническими штаммами S. aureus под воздействием эфирных масел душицы обыкновенной, тимьяна обыкновенного и тимьяна даенского (семейство Яснотковые) [8, 19]. Эфирное масло душицы обыкновенной и тимьяна даенского, как и МЧГ, содержат карвакрол — фенольное соединение, обладающее высокой антибактериальной активностью. Кроме того, чабер горный, как и некоторые другие представители семейства Яснотковых (душица, тимьян), содержит тимол и терпинен [19].

Заключение

Эфирное масло чабера горного (Satureja montana L.) проявляет выраженное антимикробное действие в отношении референтных штаммов бактерий S. aureus АТСС 25923, E. coli АТСС 25922 и грибов C. albicans ССМ 885, что делает перспективным дальнейшие исследований данного растительного продукта. Антибактериальное действие МЧГ на клинические изоляты S. aureus позволяет предлагать его в качестве компонента комбинированных препаратов для лечения инфекций, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами стафилококка.

Об авторах

Ольга Николаевна Постникова

Медицинская академия имени С.И. Георгиевского Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского

Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2113-4107

старший преподаватель каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, Симферополь

Людмила Александровна Шевкопляс

Медицинская академия имени С.И. Георгиевского Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского

Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1166-4585

ассистент каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, Симферополь

Татьяна Алексеевна Куевда

Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма

Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0055-8605

м.н.с. отд. полевых культур

Россия, Симферополь

Татьяна Павловна Сатаева

Медицинская академия имени С.И. Георгиевского Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского

Автор, ответственный за переписку.
Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6451-7285

д.м.н., зав. каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, Симферополь

Марина Александровна Кирсанова

Медицинская академия имени С.И. Георгиевского Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского

Email: tanzcool@mail.ru

к.б.н., доц. каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, Симферополь

Татьяна Алексеевна Логадырь

Медицинская академия имени С.И. Георгиевского Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского

Email: tanzcool@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2470-5374

к.м.н., доц. каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, Симферополь

Список литературы

Дополнительные файлы