Epidemiology and molecular genetic characteristics of Lyme borreliosis pathogens circulating in tick’s population in the Almaty oblast of the Republic of Kazakhstan

Full Text

Введение

Боррелии — грамотрицательные спирохеты, относящиеся к порядку Spirochaetales, семейству Spirосhaetaceae, роду Borrelia, являются облигатными внутриклеточными паразитами [1]. Представители Borrelia spp. сгруппированы в три основные филогенетические группы: группа Лайм-боррелиоза (ЛБ), формирующая надвидовой комплекс B. burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi s.l.), группа боррелий клещевых возвратных лихорадок, в которую входят B. miyamotoi, B. theileri и B. lonestari, а также группа боррелий, связанных с рептилиями, включающая B. turcica [2][3][4].

К комплексу B. burgdorferi s.l. на сегодняшний день относят 22 геновида на основе общности генетических характеристик. По крайней мере 10 из них (B. afzelii, B. bavariensis, B. bissettii, B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. kurtenbachii, B. lusitaniae, B. spielmanii и B. valaisiana [5][6][7], B. chilensis [8]) являются патогенными для человека, и один геновид — B. mayonii — был недавно выделен из клинических образцов пациента, но его патогенность еще не была доказана экспериментально [9]. Каждый из патогенных геновидов тропен к определенным системам органов, хотя при этом может вызывать поражения любой локализации.

Заражение людей происходит при укусе иксодовых клещей, которые, в свою очередь, заражаются B. burgdorferi на любом этапе своего жизненного цикла, во время укуса естественных хозяев боррелий (мыши, полевки, бурундуки и другие мелкие млекопитающие, олени, а также некоторые виды птиц) [10]. Хотя возбудителей ЛБ периодически детектируют в клещах, относящихся к родам Boophilus, Dermacentor, Haemaphysalis, Hyalomma и Rhipicephalus, возможность выступать в качестве переносчиков заболевания доказана лишь для представителей рода Ixodes [11]. Основными векторами патогенов ЛБ в США и Канаде являются I. scapularis и I. pacificus, в Европе — I. ricinus, в Азии — I. persulcatus [1][11]. В Казахстане основным переносчиком боррелий является I. persulcatus [12][13][14][15]. На территории Казахстана встречаются и другие представители рода Ixodes (I. kazakstani, I. pavlovskyi, I. laguri, I. crenulatus, I. redikorzevi, I. stromi, I. cornutus, I. subterraneus, I. lividus, I. apronophorus, I. eldaricus) [14][16], но их роль в качестве переносчиков ЛБ пока остается невыясненной [16].

Официальная регистрация ЛБ в Казахстане была начата в 2012 г. [12][15]. Эндемичными по данному заболеванию считаются Алматинская и Восточно-Казахстанская области, на территории которых сосредоточены ареалы распространения I. persulcatus. Однако в последнее время единичные случаи данного заболевания стали регистрироваться в Акмолинской, Костанайской и Северо-Казахстанской областях [17]. Инфицированность клещей рода Ixodes B. burgdorferi s.l. в Восточно-Казахстанской области составляет около 40,9% [13], однако в Алматинской области данный показатель не определен. Геновиды надвидового комплекса B. burgdorferi s.l., циркулирующих в популяции клещей, обитающих на территории Алматинской области, не изучены.

Согласно классификации Кёппена–Гейгера, территория Алматинской области характеризуется влажным континентальным климатом, включающим 5 климатических зон: жаркий-летний влажный континентальный климат (Dfa), холодный полузасушливый климат (BSk), теплый-летний влажный континентальный климат (Dfb), средиземноморский жаркий-летний влажный континентальный климат (Dsa), холодный пустынный климат (BWk) [18]. Южный и восточный районы области расположены у подножия хребта северного Тянь-Шаня — Заилийского Алатау и Джунгарского Алатау. Предгорные и горные районы Алматинской области состоят из лиственных и смешанных лесов, типичных мест обитания I. persulcatus [19].

Характерные для ЛБ полиморфность клинической картины, сходность симптоматики с рядом других заболеваний, одновременное поражение нескольких органов и частая латентная персистенция возбудителя в организме могут приводить к ошибкам в диагностике заболевания, поздней постановке диагноза, несвоевременной медицинской помощи и, как следствие, к серьезным социально-экономическим потерям, связанным с временной нетрудоспособностью и инвалидизацией пациентов [13][20][21]. Известно, что геновиды B. burgdorferi s.l связаны с различной патогенностью и клиническими проявлениями у пациентов. В связи с этим определение генотипов, циркулирующих в том или ином регионе, является важным для диагностики заболевания и может содействовать лучшему ведению пациентов с ЛБ [22].

В эпидемиологических исследованиях для детекции и генотипирования наиболее часто применяются видоспецифичный ПЦР-анализ, полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, анализ последовательности конкретных локусов генов [11]. В качестве мишеней при диагностике и генотипировании B. burgdorferi s.l. методами на основе ПЦР чаще всего используют гены рибосомной РНК (рРНК), такие как flaB, recA, p66 и плазмидный ген ospA [11]. Наличие в гене 16S рРНК как высококонсервативных, так и гипервариабельных участков позволяет, помимо выявления ДНК B burgdorferi s.l., осуществлять типирование боррелий для выявления геновидов, а также проводить филогенетический анализ различных генотипов этих бактерий [23][24].

Практика изучения зараженности клещей в эндемичных районах основывается на методах активного и пассивного мониторинга, а также эпидемиологического надзора за случаями ЛБ. При этом пассивный мониторинг дает возможность проанализировать не только уровень распространенности клещей в отдельных районах и степень зараженности их патогенами, но и риск заражения людей [25], а также успешно предсказать появление случаев
заболевания людей и своевременно выявить новые зоны распространения ЛБ [26].

Поскольку в Алматинской области ежегодно увеличивается количество атак клещей и случаев лихорадки неясной этиологии [27], выявление уровня зараженности клещей B. burgdorferi s.l. и их генотипов крайне необходимо для разработки эффективных мер профилактики заболеваемости ЛБ. Понимание возможной дифференциальной патогенности между боррелиями разных генотипов важно для изучения этиологии заболевания и улучшения лабораторной диагностики.

Целью настоящего исследования был пассивный мониторинг распространенности и степени зараженности клещей разных видов B. burgdorferi s.l. и их генотипирование по гену 16S рРНК для определения генотипов, циркулирующих в популяции клещей, а также анализ эпидемиологических данных по заболеваемости ЛБ в Алматинской области за 2013–2018 гг.

Материалы и методы

Для анализа эпидемиологических данных по заболеваемости ЛБ в Алматинской области использовали материалы Научно-практического центра санитарно-эпидемиологической экспертизы и мониторинга (НПЦСЭЭиМ) Комитета охраны общественного здоровья Министерства здравоохранения Республики Казахстан за 2013–2018 гг. [27].

Также в исследовании использовали 253 клеща, снятых с людей, проживающих в Алматинской области, в период с марта по июль 2018 г. Клещи были предоставлены НПЦСЭЭиМ. Видовую идентификацию клещей проводили морфологически с использованием лупы, бинокулярного микроскопа и таксономических ключей идентификатора «Кровососущие клещи Казахстана» [28]. После этого клещей замораживали в индивидуальных криопробирках при –20°С.

Клещей гомогенизировали индивидуально с использованием герметичного гомогенизатора «Homogenizer Mixer Mill MM 400» («Retsch»). Для этого единичных клещей помещали в пробирки с тремя размольными боросиликатными шарами (5 мм в диаметре) и 600 мкл фосфатно-солевого буфера и проводили гомогенизацию в течение 3 мин при 30 Гц. Гомогенаты центрифугировали в течение 5 мин при 5000g и 4°С. Далее отбирали супернатанты, из которых выделяли нуклеиновые кислоты с использованием набора «АмплиСенс^® РИБО-преп» («ИнтерЛабСервис») согласно инструкции производителя.

ДНК B. burgdorferi s.l. выявляли с использованием набора «АмплиСенс^® TBEV, B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum, E. chaffeensis/E.muris-FL» («ИнтерЛабСервис») по методике производителя. Положительными считали образцы, значение Ct которых было меньше 38.

Для секвенирования ДНК B. burgdorferi s.l. сначала проводили амплификацию участка гена 16S рРНК боррелий с использованием полимеразы High-Fidelity («Thermo Fisher») в амплификаторе «Mastercycler X50h» («Eppendorf») с использованием праймеров 16S1A (5’CTAACGCTGGCAGTGCGTCTTAAGC)/16S1B (5’AGCGTCAGTCTTGACCCAGAAGTTC) [29]. Далее проводили электрофорез полученных нуклеиновых кислот в системе для электрофореза «BioRad» в 1,5% агарозном геле на 1× трис-ацетатном буфере, содержащем 0,5 пг/мл бромистого этидия («SigmaAldrich»). Элюцию ДНК-фрагментов из агарозного геля проводили с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» («Qiagen») по методике производителя. Очищенные амплификаты секвенировали в обоих направлениях, используя праймеры для ПЦР, набор для секвенирования «BigDye^® Terminator v3.1» («Applied Biosystems») и генетический анализатор «ABI 3500XL» («Applied Biosystems»). Полученные участки гена 16S рРНК сравнивали с нуклеотидными последовательностями различных геновидов боррелий, взятыми из базы данных NCBI¹, и выравнивали с использованием алгоритма MUSCLE. Филогенетическое древо было создано методом максимального правдоподобия с использованием программного обеспечения «MEGA X»². Значения надежности в процентах на каждом внутреннем узле были определены в соответствии с анализом начальной загрузки с 1000 повторов.

Статистическую обработку результатов проводили с применением программы R. Для расчета 95% доверительных интервалов (95% ДИ) был использован метод Клоппера–Пирсона. Критерий Пирсона χ² использовался для определения статистически значимой разницы между ожидаемыми частотами. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Анализ эпидемиологических данных по заболеваемости ЛБ за 2013–2018 гг.

На данный момент в районах Казахстана, эндемичных по клещевым инфекциям, существует значительный пробел в мониторинге лиц, укушенных клещами. Клещи, принесенные укушенными пациентами, не проверяются на наличие возбудителя боррелиоза, не проводится комплексное серологическое обследование пациентов в динамике, что затрудняет своевременную диагностику заболеваний.

По данным НПЦСЭЭиМ, количество подтвержденных случаев ЛБ в Казахстане за 2013– 2018 гг. варьирует от 7 до 21 случая в год, таким образом средний уровень заболеваемости составляет 0,04–0,12 на 100 тыс. человек в год (табл. 1) [27].

 

Таблица 1. Мониторинг заболеваемости ЛБ в Республике Казахстан в 2013-2018 гг.

Table 1. Monitoring of the LB incidence in the Republic of Kazakhstan in 2013-2018

Показатель Index	2013	2014	2015	2016	2017	2018
Количество подтвержденных случаев клещевого иксодового боррелиоза Number of confirmed cases of tick-borne borreliosis	21	17	7	12	12	19
Количество случаев на 100 тыс. человек (уровень заболеваемости) Number of cases per 100,000 population (incidence rate)	0,12	0,09	0,04	0,06	0,07	0,11

 

Что касается Алматинской области, то в 2017 г. было зарегистрировано 4 подтвержденных случая ЛБ (0,11 на 100 тыс. человек), а в 2018 г. — 7 случаев (0,19 на 100 тыс. человек). К сожалению, клещи, укусившие данных пациентов, не были включены в наше исследование.

Видовой состав клещей, нападавших на людей в Алматинской области

Клещи, снятые с пострадавших от укуса людей в Алматинской области в марте–июле 2018 г., были идентифицированы до вида. Основываясь на морфологической идентификации, все 253 клеща были отнесены к имаго. Из 253 клещей 23 (9,1%) принадлежали к основному переносчику ЛБ — I. persulcatus (95% ДИ 5,9–13,3%; рис. 1). Наиболее часто на людей в Алматинской области нападали клещи R. turanicus (116/253; 45,9%; 95% ДИ
39,5–52,2%), Ha. punctata (74/253; 29,3%; 95% ДИ 23,7–35,3%) и D. marginatus (28/253; 11,1%; 95% ДИ 7,5–15,6%). Наименьшее количество напавших на людей клещей были идентифицированы как Hy. asiaticum (7/253; 2,7%; 95% ДИ 1,1–5,6%) и D. pictus (5/253, 1,9%; 95% ДИ 0,6–4,5%; рис. 1).

Периоды активности у разных родов клещей отличаются. Период наибольшей активности основного переносчика возбудителей ЛБ I. persulcatus в Алматинской области был отмечен с апреля по июнь. Преобладающие по количеству укусов виды клещей (R. turanicus, Ha. punctata и D. marginatus) проявляли наибольшую активность в период с мая по июнь, с апреля по июнь и с апреля по май соответственно (рис. 2).

ПЦР-диагностика ДНК-препаратов клещей

В ходе анализа ДНК-препаратов клещей, снятых с людей в Алматинской области в 2018 г., методом ПЦР в режиме реального времени выявлено, что I. persulcatus являются наиболее инфицированными B. burgdorferi s.l. Однако ДНК B. burgdorferi s.l. была детектирована также в клещах D. marginatus, Ha. punctata и R. turanicus (табл. 2). В любом случае уровень инфицированности клещей I. persulcatus боррелиями B. burgdorferi s.l. был достоверно выше, чем тот же показатель для D. marginatus (χ² = 7,9980; p = 0,001), Ha. punctata (χ² = 23,154; p < 0,0001) и R. turanicus (χ² = 21,986; p < 0,0001). Уровни инфицированности B. burgdorferi s.l. клещей, не относящихся к роду Ixodes, не отличались достоверно друг от друга (χ² = 0,6832; p = 0,5).

 

Таблица 2. Результаты ПЦР-анализа по детекции ДНК В. burgdorferi s.l. в клещах

Table 2. Results of PCR analysis for the detection of B. burgdorferi s.l. DNA in ticks

Вид клещей Tick species	Количество клещей, взятых для анализа Number of ticks tested	ПЦР- положительные PCR-positive	Уровень инфицированности клещей В. burgdorferi s.l., % Infection rate of ticks with B. burgdorferi s.l., %	ДИ 95% Cl 95%	Ct
l. persulcatus	23	9	39,13	19,7-61,5	26,66 ± 1,59
D. marginatus	28	1	3,57	0,1-18,35	30,31
D. pictus	5	0	0,00	-	-
Ha. punctata	74	1	1,35	0,0-7,3	31,65
Hy. asiaticum	7	0	0,00	-	-
R. turanicus	116	5	4,31	1,4-9,8	35,18 ± 1,88
Всего Total	253	16	6,32

 

Следует также заметить, что относительное содержание B. burgdorferi s.l. в клещах D. marginatus, Ha. punctata и R. turanicus оказалось низким по сравнению со средним их содержанием в I. persulcatus, исходя из сравнительно высоких значений Ct (табл. 2).

Секвенирование и филогенетический анализ

Определение видовой принадлежности 16 qPCR-положительных образцов, выделенных из иксодовых клещей, осуществлялось посредством амплификации части гена 16S рРНК размером 724 п.н. родоспецифичными праймерами с последующим секвенированием очищенных амплификатов. В качестве положительного контроля в ПЦР использовали геномную ДНК B. garinii. В 3 из 16 образцов не удалось получить амплификат, видимо, из-за низкого содержания в них ДНК B. burgdorferi s.l. На рис. 3 представлены результаты электрофоретического анализа продуктов амплификации участка гена 16S рРНК для 5 образцов, выделенных из I. persulcatus, для которых удалось получить считывание достаточного для анализа качества. Остальные 8 из 13 проанализированных методом секвенирования ДНК образцов давали миксы по нескольким позициям, что указывает на наличие в них ДНК от более чем одного геновида боррелий.

Согласно результатам проведенного филогенетического анализа, 4 образца (A003A1, A012A1, A041A1 и A196A1) были идентичны по последовательности амплификата линии VS461 (GenBank NR_104748.1) B. afzelii (рис. 4). Один образец (A186A1) содержал ДНК, наиболее близкую по последовательности амплифицированного участка гена 16S рРНК к линии PBi (GenBank NR_074854.1) B. bavariensis (2 нуклеотидные замены) и линии 20047 (GeneBank NR_043413.1) B. garinii (3 нуклеотидные замены) (рис. 4).

Обсуждение

В настоящей работе представлены анализ данных по подтвержденным случаям клещевого боррелиоза в Казахстане и данные видовой идентификации по видам клещей, нападавших на людей в Алматинской области Республики Казахстан с марта по июль 2018 г., уровня их инфицированности возбудителями ЛБ, а также генотипирования выявленных боррелий по участку гена 16S рРНК.

Доминирующими видами клещей, нападающими на людей, были R. turanicus, Ha. punctata, D. marginatus и I. persulcatus. Наиболее высокий уровень зараженности B. burgdorferi s.l. показали клещи I. persulcatus. Несмотря на то что этот показатель является сравнительно высоким, за 2018 г. в Алматинской области, в которой ареал распространения I. persulcatus перекрывается с наиболее густозаселенными районами, зарегистрировано лишь 7 официально подтвержденных случаев клещевого боррелиоза [27]. Возможно, это связано с отсутствием эффективной и своевременной системы диагностики данного заболевания в областных и городских клиниках в силу некоторых факторов: например, низкой информированности врачей о клинических проявлениях ЛБ, который характеризуется выраженным клиническим полиморфизмом течения заболевания; недостаточности/отсутствия в клиниках специфических методов лабораторной диагностики, а также вариабельности результатов таких лабораторных методов на разных стадиях инфекции [20][21]. Немаловажным является установление факта наличия укуса клеща, т.к. укус клещей зачастую бывает безболезненным и только около 50% пациентов с ЛБ указывают на факт присасывания клеща, что также усложняет процесс диагностики [13][15].

Согласно результатам анализа ДНК-препаратов клещей, снятых с людей в Алматинской области, выявлено, что I. persulcatus являются наиболее инфицированными B. burgdorferi s.l. Однако следует отметить, что ДНК B. burgdorferi s.l. была детектирована также в клещах D. marginatus, Ha. punctata и R. turanicus, что было продемонстрировано ранее и другими исследовательскими группами. Так, например, F.K. Adham и соавт. показали, что в Египте агенты ЛБ были обнаружены в нескольких видах клещей: Rhipicephalus, Hyalomma и Ornithodoros savignyi, частично с высокой распространенностью — до 66% [30]. Дополнительно Borrelia spp. были обнаружены у клещей-олигофагов, таких как I. frontalis, I. acuminatus и Argas reflexus, а также у полифагов Haemaphysalis [11][31]. Однако способность заражать людей B. burgdorferi s.l. для данных видов клещей не была доказана [31]. Таким образом, роль этих видов в энзоотических циклах агентов ЛБ остается неясной.

По результатам секвенирования в реальном времени ПЦР-положительных по B. burgdorferi s.l. образцов установлено, что в Алматинской области циркулируют по меньшей мере два геновида B. burgdorferi s.l. (B. afzelii и B. garinii и или B. bavariensis). Однако полученные результаты требуют дополнительных исследований и подтверждений. Наше исследование было частично ограничено некоторыми факторами: отсутствием клинических данных от укушенных исследованными клещами людей, недостаточным количеством исследуемых образцов и объёмом их выборки, отсутствием точных данных ГИС-координат по точкам, где были зарегистрированы укусы клещей, лимитированностью в наличии коммерческих тест-систем для детекции B. burgdorferi s.l., а также материалов для таких современных методов генотипирования, как MLST/MLSA.

Данным исследованием мы хотим подчеркнуть факт зараженности и определенной распространенности патогенов ЛБ в популяции клещей Алматинской области Республики Казахстан. Более того, большая гетерогенность самих патогенов и их переносчиков все еще оставляет многие вопросы без ответа. Следовательно, для более точной картины распространенности и уровня зараженности клещей разных видов, в частности I. persulcatus, патогенами клещевого боррелиоза в дальнейшем необходимо продолжить исследования, охватывающие следующие области:

• комплексные эпидемиологические исследования, в том числе в регионах за пределами основных районов распространения I. persulcatus;
• обнаружение коинфекций с другими клещевыми патогенами и выявление биотических и абиотических факторов, которые влияют на распространение Borrelia spp.;
• ассоциации хозяина и вектора: cпирохеты комплекса ЛБ могут быть обнаружены в неожиданно широком диапазоне возможных векторов, что указывает на необходимость изучения потенциала различных видов членистоногих в отношении передачи агентов ЛБ людям или резервуарам позвоночных;
• филогения и таксономия спирохет Borrelia spp.: для характеристики новых генотипов рекомендуется применение самых современных методов, таких как MLSA/MLST.

Благодарность

Авторы выражают признательность Л.С. Карань (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) за предоставление в качестве положительного контроля геномной ДНК B. garinii.

About the authors

A. O. Bissenbay

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Author for correspondence.
Email: akerke.bissenbay@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7109-2534

Akerke O. Bissenbay — researcher, Department of biosafety and biosecurity

050054, Almaty

Казахстан

A. V. Zhigailov

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9646-033X

Andrey V. Zhigailov — PhD (Biol.), leading researcher, Laboratory of molecular biology

050054, Almaty

Казахстан

Yu. V. Perfilyeva

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6803-0773

Yuliya V. Perfilyeva — PhD (Biol.), leading researcher, Laboratory for expertise and diagnostics

050054, Almaty

Казахстан

D. A. Naizabayeva

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0606-4289

Dinara A. Naizabayeva — junior researcher, Laboratory for expertise and diagnostics

050054, Almaty

Казахстан

A. S. Neupokoyeva

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7257-8037

Alena S. Neupokoyeva — senior researcher, Laboratory for expertise and diagnostics

050054, Almaty

Казахстан

Zh. A. Berdygulova

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-0379-2472

Zhanna A. Berdygulova — PhD, leading researcher, Laboratory of molecular biology

050054, Almaty

Казахстан

Ye. O. Ostapchuk

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3771-423X

Yekaterina O. Ostapchuk — PhD, leading researcher, Laboratory of molecular biology

050054, Almaty

Казахстан

E. R. Maltseva

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9198-695X

Elina R. Maltseva — PhD, Head, Biosafety and biosecurity department

050054, Almaty

Казахстан

S. A. Kuatbekova

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-5569-1847

Saltanat A. Kuatbekova — junior researcher, Laboratory for expertise and diagnostics

050054, Almaty

Казахстан

A. S. Nizkorodova

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1597-7207

Anna S. Nizkorodova — PhD (Biol.), leading researcher, Laboratory of molecular biology

050054, Almaty

Казахстан

A. M. Dmitrovskiy

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4714-3079

Andrey M. Dmitrovskiy — D. Sci. (Med.), Prof., Head, Laboratory for expertise and diagnostics

050054, Almaty

Казахстан

Yu. A. Skiba

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4895-1473

Yuriy A. Skiba — PhD (Biol.), Deputy director

050054, Almaty

Казахстан

S. M. Mamadaliyev

Almaty Branch of Republican State Enterprise «National Center for Biotechnology» — Central Reference Laboratory

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7767-0251

Seydigapbar M. Mamadaliyev — D. Sci. (Vet.), Prof., Director

050054, Almaty

Казахстан

References

Supplementary files