Sensitivity of biofilms of vaccine and freshly isolated Bordetella pertussis strains to antibiotics

Full Text

Введение

Эпидемический процесс коклюшной инфекции, несмотря на высокий уровень противококлюшной вакцинации, продолжается во многих странах мира. Ежегодно в мире регистрируется около 50 млн случаев заболевания коклюшем, около 300 тыс. детей погибает от него [1][2]. Одной из вероятных причин роста заболеваемости коклюшем являются мутации в генах возбудителя, кодирующих основные факторы вирулентности Bordetella pertussis, что привело к появлению циркулирующих штаммов, отличающихся повышенной вирулентностью [3]. Фармакотерапия больных коклюшем остается актуальной проблемой и включает назначение этиотропных, патогенетических и симптоматических препаратов. Ведущую роль в этиотропном лечении играют антибактериальные средства, прежде всего антибиотики. Наиболее эффективными принято считать антибиотики макролидного ряда: эритромицин, азитромицин, кларитромицин. Вместе с тем для лечения коклюша, в частности при неэффективности эритромицина, с успехом использовались и другие антибиотики (тетрациклинового ряда, пенициллины, аминогликозиды, цефалоспорины и др.) [4]. Главными условиями эффективности антибиотикотерапии коклюша являются правильный выбор антибиотика, его дозировка и длительность лечения. Чувствительность коклюшного микроба к антибиотикам в настоящее время оценивают в бульонных или агаровых культурах методами серийных разведений или с помощью диско-диффузионных методов. Однако в последние годы было установлено, что B. pertussis, как и другие виды бактерий, функционируют в виде биопленок на биотических и абиотических субстратах [5][6]. Биопленочные формы бактерий отличаются от планктонных измененным спектром экспрессии генов и обладают повышенной устойчивостью к факторам внешней среды, в частности к антибиотикам. Установлено, что биопленки разных микроорганизмов могут быть в 100–1000 раз более устойчивы к антибиотикам, чем планктонные культуры [7]. Чувствительность биопленок B. pertussis к антибиотикам пока изучена недостаточно, по данной проблеме имеются лишь единичные публикации [8].

Цель работы заключалась в изучении чувствительности биопленок вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis к антибиотикам разных групп.

Материалы и методы

В опытах использовали две группы штаммов В. pertussis. Первую группу составили вакцинные штаммы, выделенные от больных коклюшем в 1950–1960-е гг., иcпользующиеся в России для изготовления корпускулярных коклюшных вакцин: штамм № 475 (серовар 1.2.3), штамм № 305 (серовар 1.2.0), штамм № 703 (серовар 1.0.3), а также штамм Tohama 1 (серовар 1.2.0), выделенный в 1950-е гг. в Японии и широко использующийся в ряде стран при проведении генетических исследований и производстве коклюшных вакцин. Во вторую группу были включены штаммы, выделенные в РФ от больных коклюшем в 2001–2010 гг.: штамм № 178 (серовар 1.2.0), штамм № 162 (серовар 1.0.3) и штамм № 211 (серовар 1.2.3) [9]. В опытах использовали антибиотики групп пенициллинов (ампициллин), цефалоспоринов (цефтриаксон), аминогликозидов (гентамицин), макролидов (эритромицин).

В качестве инокулята для получения биопленок применяли ночные культуры штаммов, выращенных на плотной питательной среде «Бордетелагар» (Питательная среда для культивирования и выделения коклюшного микроба сухая, ФБУН ГНЦ ПМБ). Для получения биопленок суспензию бактерий культивировали в 96-луночных пластиковых планшетах («Nunc») в жидкой синтетической питательной среде в соответствии с ранее описанным методом [9]. Культуры штаммов в жидкой синтетической питательной среде в концентрации 1,25, 2,5 и 5,0 международных оптических единиц (МОЕ) в объеме 100 мкл вносили в лунки планшетов. После этого в лунки вносили по 100 мкл питательной среды, содержащей испытуемые антибиотики в концентрации 0,2, 1 и 5 мкг/мл. В контрольные пробы антибиотики не добавляли.

После окрашивания биопленок в планшетах 0,1% раствором генцианвиолета оценивали их интенсивность по отношению оптической плотности (ОП) окрашенного растворителя биопленки к негативному контролю (ОП питательной среды = 0,048 ± 0,003). Выделяли следующие группы: плотные (ОП > 0,192), умеренные (0,096 < ОП ≤ 0,192) биопленки, слабые/отсутствие биопленок (ОП ≤ 0,096) [9].

Результаты оценивали по значениям минимальной подавляющей концентрации (МПК, мкг/мл), которую определяли как минимальную концентрацию антибиотиков, подавляющую рост биопленочных культур. Для достоверного обсчета результатов использовали 4 лунки на один опытный образец и рассчитывали среднюю величину ОП опытного образца и удвоенную ошибку. Сравнения проводили по критерию Стьюдента [10].

Результаты

Результаты исследования чувствительности вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis к антибиотикам приведены в таблице. Для определения МПК антибиотиков необходимо было выбрать оптимальную стартовую посевную дозу микробных клеток.

 

Влияние антибиотиков на рост биопленок (ОП) разных штаммов В. pertussis при посевной дозе 5 МОЕ (М ± т)

Effect of antibiotics on the growth of biofilms (OD values) of different of B. pertussis strains at a seeding dose of 5 IOU (M ± m)

Доза антибиотика Dose of antibiotic	Штаммы В. pertussis / Strains of В. pertussis
	вакцинные / vaccine				свежевыделенные / freshly isolated
	Tohama 1	475	305	703	162	211	178
Контроль	Умеренная	Плотная	Плотная	Умеренная	Плотная	Плотная	Плотная
Control	Moderate	Dense	Dense	Moderate	Dense	Dense	Dense
	0,097 ± 0,015	0,337 ± 0,96	0,248 ± 0,013	0,120 ± 0,010	0,257 ± 0,064	0,345 ± 0,082	0,222 ± 0,011
Гентамицин / Gentamicin
5 мкг/мл 5 μg/ml	Нет	Нет	Слабая	Нет	Нет	Умеренная	Нет
	No	No	Weak	No	No	Moderate	No
	0,096 ± 0,003	0,064 ± 0,002	0,108 ± 0,004	0,074 ± 0,005	0,067 ± 0,001	0,112 ± 0,002	0,095 ± 0,007
1 мкг/мл 1 μg/ml	Умеренная	Нет	Умеренная	Умеренная	Нет	Умеренная	Умеренная
	Moderate	No	Moderate	Moderate	No	Moderate	Moderate
	0,173 ± 0,008	0,073 ± 0,005	0,172 ± 0,026	0,116 ± 0,009	0,078 ± 0,004	0,140 ± 0,015	0,120 ± 0,012
0,2 мкг/мл 0.2 μg/ml	Плотная	Нет	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Умеренная
	Dense	No	Moderate	Moderate	Moderate	Moderate	Moderate
	0,224 ± 0,020	0,086 ± 0,003	0,180 ± 0,021	0,151 ± 0,003	0,112 ± 0,016	0,147 ± 0,017	0,131 ± 0,013
Эритромицин / Erythromycin
5 мкг/мл 5 μg/ml	Нет	Нет	Нет	Слабая	Нет	Нет	Нет
	No	No	No	Weak	No	No	No
	0,058 ± 0,006	0,095 ± 0,004	0,091 ± 0,003	0,100 ± 0,010	0,071 ± 0,005	0,057 ± 0,004	0,081 ± 0,002
1 мкг/мл 1 μg/ml	Умеренная	Умеренная	Плотная	Слабая	Умеренная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Moderate	Dense	Weak	Moderate	Moderate	Moderate
	0,117 ± 0,006	0,134 ± 0,007	0,216 ± 0,011	0,100 ± 0,004	0,154 ± 0,011	0,162 ± 0,005	0,174 ± 0,022
0,2 мкг/мл 0.2 μg/ml	Умеренная	Умеренная	Плотная	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Moderate	Dense	Moderate	Moderate	Moderate	Moderate
	0,152 ± 0,003	0,135 ± 0,003	0,256 ± 0,031	0,180 ± 0,009	0,175 ± 0,011	0,130 ± 0,010	0,144 ± 0,009
Цефтриаксон / Ceftriaxone
5 мкг/мл 5 μg/ml	Нет	Нет	Умеренная	Слабая	Умеренная	Слабая	Умеренная
	No	No	Moderate	Weak	Moderate	Weak	Moderate
	0,089 ± 0,012	0,081 ± 0,012	0,154 ± 0,012	0,101 ± 0,008	0,112 ± 0,002	0,101 ± 0,009	0,124 ± 0,014
1 мкг/мл 1 μg/ml	Нет	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Плотная	Умеренная	Умеренная
	No	Moderate	Moderate	Moderate	Dense	Moderate	Moderate
	0,096 ± 0,026	0,158 ± 0,025	0,154 ± 0,012	0,154 ± 0,023	0,189 ± 0,025	0,127 ± 0,014	0,132 ± 0,002
0,2 мкг/мл 0.2 μg/ml	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Плотная	Плотная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Moderate	Moderate	Dense	Dense	Moderate	Moderate
	0,159 ± 0,026	0,171 ± 0,029	0,171 ± 0,027	0,214 ± 0,018	0,240 ± 0,041	0,126 ± 0,020	0,150 ± 0,010
Ампицилин / Ampicillin
5 мкг/мл 5  μg/ml	Слабая	Нет	Умеренная	Нет	Нет	Умеренная	Нет
	Weak	No	Moderate	No	No	Moderate	No
	0,100 ± 0,007	0,051 ± 0,001	0,112 ± 0,026	0,055 ± 0,003	0,056 ± 0,003	0,184 ± 0,060	0,065 ± 0,002
1 мкг/мл 1 μg/ml	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Плотная	Умеренная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Moderate	Moderate	Dense	Moderate	Moderate	Moderate
	0,112 ± 0,004	0,185 ± 0,020	0,162 ± 0,009	0,202 ± 0,028	0,151 ± 0,049	0,170 ± 0,039	0,133 ± 0,017
0,2 мкг/мл 0.2  μg/ml	Умеренная	Плотная	Плотная	Плотная	Плотная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Dense	Dense	Dense	Dense	Moderate	Moderate
	0,180 ± 0,021	0,219 ± 0,028	0,219 ± 0,023	0,228 ± 0,015	0,197 ± 0,039	0,187 ± 0,056	0,126 ± 0,026

Примечание. Различия между значениями ОП культур с отсутствием, слабыми, умеренными и плотными биопленками статистически достоверны (р < 0,001).

Note. Differences between the OD values for cultures with no, weak, moderate and dense biofilms are statistically significant (p < 0.001).

 

Контрольные культуры исследованных штаммов различались по интенсивности образования биопленок в зависимости от посевной дозы. При посевной дозе 5 МОЕ 5 из 7 штаммов формировали плотные биопленки, а 2 штамма — умеренные. При посевной дозе 2,5 МОЕ плотные биопленки формировали 2 штамма, а 5 штаммов — умеренные. При дозе 1,25 МОЕ только 1 штамм формировал плотную биопленку, а остальные 6 — умеренные или слабые. В связи с этим чувствительность штаммов к антибиотикам оценивали при посевной дозе 5 МОЕ/мл. Вакцинный штамм Tohama 1 проявлял чувствительность к гентамицину и эритромицину с МПК 5 мкг/мл и цефтриаксону с МПК 1 мкг/мл. По отношению к ампициллину этот штамм был устойчивым с ростом умеренных биопленок с МПК 0,2 и 1 мкг/мл и слабых биопленок — с 5 мкг/мл. Вакцинный штамм № 475 был чувствительным к гентамицину с МПК 0,2 мкг/мл, а также к эритромицину, цефтриаксону и ампициллину с МПК 5 мкг/мл. Вакцинный штамм № 305 был чувствителен только к эритромицину с МПК 5 мкг/мл и устойчив к остальным трем антибиотикам. Вакцинный штамм № 703 был чувствительным к гентамицину и ампициллину с МПК 5 мкг/мл и устойчивым к эритромицину и цефтриаксону. Свежевыделенный штамм № 162 проявлял чувствительность к гентамицину c МПК 1 мкг/мл, а к эритромицину и ампициллину — с МПК 5 мкг/мл. Свежевыделенный штамм № 178 был чувствителен к гентамицину, эритромицину и ампициллину с МПК 5 мкг/мл. К цефриаксону штаммы № 162 и № 178 были устойчивы и формировали биопленки различной интенсивности — от умеренных до плотных — при всех использованных концентрациях антибиотика. Свежевыделенный штамм № 211 был чувствительным только к эритромицину с МПК 5 мкг/мл и проявлял устойчивость к гентамицину, цефтриаксону и ампициллину.

Обсуждение

Нами исследована чувствительность биопленок основных сероваров вакцинных и свежевыделенных штаммов коклюшного микроба к различным антибиотикам. В результате проведенных исследований были разработаны оптимальные условия оценки чувствительности биопленочных форм B. pertussis к антибиотикам разных групп. Интенсивность образования биопленок штаммами зависела от стартовой посевной дозы микробных клеток и концентрации антибиотиков. В качестве оптимальной посевной дозы микробных клеток была выбрана доза 5 МОЕ/мл, при использовании которой большинство штаммов формировали плотные биопленки при отсутствии в питательной среде антибиотиков.

Выявлены определенные различия между биопленками исследованных штаммов по чувствительности к антибиотикам. Наиболее высокой устойчивостью к антибиотикам отличались вакцинный штамм № 305 и свежевыделенный штамм № 211, проявлявшие чувствительность только к эритромицину. Вакцинный штамм № 703 был чувствителен к гентамицину и ампициллину и проявлял резистентность к эритромицину и цефтриаксону. Вакцинный штамм № 475 был чувствителен ко всем испытанным антибиотикам. Штамм Tohama 1 был резистентен к ампициллину и чувствителен к остальным антибиотикам. Свежевыделенные штаммы № 178 и № 162 были устойчивы к цефтриаксону и чувствительны к гентамицину, эритромицину и ампициллину. В доступной литературе имеются отдельные указания на возможность более высокой антибиотикорезистентности биопленок свежевыделенных штаммов коклюшного микроба по сравнению с вакцинными [8]. Полученные нами результаты указывают на отсутствие существенных различий между исследованными вакцинными и свежевыделенными штаммами по чувствительности к антибиотикам.

Полученные результаты указывают на гетерогенность исследованных нами вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis по чувствительности к антибиотикам. При этом высокая чувствительность штаммов к определенным антибиотикам сочеталась с резистентностью к антибиотикам других групп. Необходимо отметить высокие МПК антибиотиков для биопленок. МПК гентамицина составляла 0,2 мкг/мл для штамма № 475, 1 мкг/мл для штамма № 162 и 5 мкг/мл для штаммов Tohama 1, № 703 и № 178. МПК эритромицина и ампициллина составляли 5 мкг/мл для всех чувствительных к этим антибиотикам штаммов. МПК цефтриаксона для штаммов Tohama 1 и № 475 составляли 1 и 5 мкг/мл соответственно. В целом МПК использованных антибиотиков составляли от 0,2 до 5 мкг/мл. По данным литературы, МПК для планктонных культур коклюшного микроба, определенные традиционными методами, составляют: эритромицин — 0,1–0,125 мкг/мл, ампициллин — 0,12–0,5 мкг/мл, гентамицин — 0,06–0,5 мкг/мл, цефтриаксон — 0,19 мкг/мл [11][12]. Таким образом, биопленочные культуры B. pertussis отличаются более высокой устойчивостью к антибиотикам по сравнению с планктонными культурами.

Результаты проведенных исследований позволяют также сделать определенные выводы об эффективности исследованных антибиотиков по отношению к биопленочным культурам. Наибольшую активность проявлял эритромицин, подавлявший рост биопленок большинства исследованных штаммов. Только вакцинный штамм № 703 проявлял устойчивость к этому препарату. Эти результаты согласуются с данными других авторов о том, что эритромицин проявляет наиболее высокую активность in vitro по отношению к возбудителю коклюша [11][13][14]. К гентамицину были чувствительны 5 штаммов, а к ампициллину — 4 штамма. Наименее эффективным был цефтриаксон, подавлявший рост биопленок только 2 штаммов.

Механизмы повышенной устойчивости биопленок B. pertussis к антибиотикам до конца не изучены и могут быть связаны с рядом факторов, среди которых можно отметить особенности строения матрикса [5]. Полученные нами результаты указывают на целесообразность дальнейшего исследования чувствительности биопленок B. pertussis к антибиотикам и выяснения механизмов их высокой антибиотикорезистентности.

About the authors

E. M. Zaytsev

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: pertussis@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4813-9074

Eugene M. Zaуtsev — D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of immunomodulators

Moscow

Россия

M. V. Britsina

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3044-0790

Marina V. Вritsina — PhD (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators

Moscow

Россия

M. N. Ozeretskovskaya

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9809-4217

Maria N. Ozeretskovskaya — PhD (Med.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators

Moscow

Россия

N. U. Mertsalova

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9072-2538

Natalia U. Mertsalova — PhD (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators

Moscow

Россия

I. G. Bazhanova

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1404-1498

Irina G. Bazhanova — PhD (Biol.), senior researcher, Laboratory of immunomodulators

Moscow

Россия

References

Supplementary files