Sensitivity of biofilms of vaccine and freshly isolated  Bordetella pertussis  strains to antibiotics

E. M. Zaytsev; Зайцев Е. М.; M. V. Britsina; Брицина М. В.; M. N. Ozeretskovskaya; Озерецковская М. Н.; N. U. Mertsalova; Мерцалова Н. У.; I. G. Bazhanova; Бажанова И. Г.

doi:10.36233/0372-9311-2020-97-6-3

Чувствительность биопленок вакцинных и свежевыделенных штаммов Bordetella pertussis к антибиотикам

Авторы: Зайцев Е.М.¹, Брицина М.В.¹, Озерецковская М.Н.¹, Мерцалова Н.У.¹, Бажанова И.Г.¹
Учреждения:
1. ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»
Выпуск: Том 97, № 6 (2020)
Страницы: 529-534
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 20.01.2021
Дата принятия к публикации: 20.01.2021
Дата публикации: 20.01.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/941
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-6-3
ID: 941

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Изучение чувствительности биопленок вакцинных и свежевыделенных штаммов Bordetella pertussis к антибиотикам.

Материалы и методы. Использованы вакцинные и свежевыделенные штаммы B. pertussis. В качестве инокулята для получения биопленок использовали культуры штаммов, выращенные на плотной питательной среде. Интенсивность образования биопленок в круглодонных полистироловых 96-луночных планшетах оценивали окрашиванием 0,1% раствором генцианвиолета. В опытах использовали антибиотики следующих групп: пенициллины (ампициллин), цефалоспорины (цефтриаксон), аминогликозиды (гентамицин), макролиды (эритромицин).

Результаты. Наиболее высокой устойчивостью к антибиотикам отличались вакцинный штамм № 305 и свежевыделенный штамм № 211, проявлявшие чувствительность только к эритромицину. Вакцинный штамм № 703 был чувствителен к гентамицину и ампициллину и проявлял резистентность к эритромицину и цефтриаксону. Вакцинный штамм № 475 был чувствителен ко всем испытанным антибиотикам. Штамм Tohama 1 был резистентен к ампициллину и чувствителен к остальным антибиотикам. Свежевыделенные штаммы № 178 и № 162 были устойчивы к цефтриаксону и чувствительны к гентамицину, эритромицину и ампициллину. Минимальные подавляющие концентрации использованных антибиотиков составляли 0,2–5 мкг/мл.

Заключение. Приведенные данные свидетельствуют о гетерогенности вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis по чувствительности к антибиотикам. Наибольшую активность проявлял эритромицин, подавлявший рост биопленок 6 из 7 штаммов. Наименее эффективным был цефтриаксон, подавлявший рост биопленок только 2 штаммов.

Ключевые слова

штаммы Bordetella pertussis, биопленки, чувствительность к антибиотикам

Полный текст

Введение

Эпидемический процесс коклюшной инфекции, несмотря на высокий уровень противококлюшной вакцинации, продолжается во многих странах мира. Ежегодно в мире регистрируется около 50 млн случаев заболевания коклюшем, около 300 тыс. детей погибает от него [1][2]. Одной из вероятных причин роста заболеваемости коклюшем являются мутации в генах возбудителя, кодирующих основные факторы вирулентности Bordetella pertussis, что привело к появлению циркулирующих штаммов, отличающихся повышенной вирулентностью [3]. Фармакотерапия больных коклюшем остается актуальной проблемой и включает назначение этиотропных, патогенетических и симптоматических препаратов. Ведущую роль в этиотропном лечении играют антибактериальные средства, прежде всего антибиотики. Наиболее эффективными принято считать антибиотики макролидного ряда: эритромицин, азитромицин, кларитромицин. Вместе с тем для лечения коклюша, в частности при неэффективности эритромицина, с успехом использовались и другие антибиотики (тетрациклинового ряда, пенициллины, аминогликозиды, цефалоспорины и др.) [4]. Главными условиями эффективности антибиотикотерапии коклюша являются правильный выбор антибиотика, его дозировка и длительность лечения. Чувствительность коклюшного микроба к антибиотикам в настоящее время оценивают в бульонных или агаровых культурах методами серийных разведений или с помощью диско-диффузионных методов. Однако в последние годы было установлено, что B. pertussis, как и другие виды бактерий, функционируют в виде биопленок на биотических и абиотических субстратах [5][6]. Биопленочные формы бактерий отличаются от планктонных измененным спектром экспрессии генов и обладают повышенной устойчивостью к факторам внешней среды, в частности к антибиотикам. Установлено, что биопленки разных микроорганизмов могут быть в 100–1000 раз более устойчивы к антибиотикам, чем планктонные культуры [7]. Чувствительность биопленок B. pertussis к антибиотикам пока изучена недостаточно, по данной проблеме имеются лишь единичные публикации [8].

Цель работы заключалась в изучении чувствительности биопленок вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis к антибиотикам разных групп.

Материалы и методы

В опытах использовали две группы штаммов В. pertussis. Первую группу составили вакцинные штаммы, выделенные от больных коклюшем в 1950–1960-е гг., иcпользующиеся в России для изготовления корпускулярных коклюшных вакцин: штамм № 475 (серовар 1.2.3), штамм № 305 (серовар 1.2.0), штамм № 703 (серовар 1.0.3), а также штамм Tohama 1 (серовар 1.2.0), выделенный в 1950-е гг. в Японии и широко использующийся в ряде стран при проведении генетических исследований и производстве коклюшных вакцин. Во вторую группу были включены штаммы, выделенные в РФ от больных коклюшем в 2001–2010 гг.: штамм № 178 (серовар 1.2.0), штамм № 162 (серовар 1.0.3) и штамм № 211 (серовар 1.2.3) [9]. В опытах использовали антибиотики групп пенициллинов (ампициллин), цефалоспоринов (цефтриаксон), аминогликозидов (гентамицин), макролидов (эритромицин).

В качестве инокулята для получения биопленок применяли ночные культуры штаммов, выращенных на плотной питательной среде «Бордетелагар» (Питательная среда для культивирования и выделения коклюшного микроба сухая, ФБУН ГНЦ ПМБ). Для получения биопленок суспензию бактерий культивировали в 96-луночных пластиковых планшетах («Nunc») в жидкой синтетической питательной среде в соответствии с ранее описанным методом [9]. Культуры штаммов в жидкой синтетической питательной среде в концентрации 1,25, 2,5 и 5,0 международных оптических единиц (МОЕ) в объеме 100 мкл вносили в лунки планшетов. После этого в лунки вносили по 100 мкл питательной среды, содержащей испытуемые антибиотики в концентрации 0,2, 1 и 5 мкг/мл. В контрольные пробы антибиотики не добавляли.

После окрашивания биопленок в планшетах 0,1% раствором генцианвиолета оценивали их интенсивность по отношению оптической плотности (ОП) окрашенного растворителя биопленки к негативному контролю (ОП питательной среды = 0,048 ± 0,003). Выделяли следующие группы: плотные (ОП > 0,192), умеренные (0,096 < ОП ≤ 0,192) биопленки, слабые/отсутствие биопленок (ОП ≤ 0,096) [9].

Результаты оценивали по значениям минимальной подавляющей концентрации (МПК, мкг/мл), которую определяли как минимальную концентрацию антибиотиков, подавляющую рост биопленочных культур. Для достоверного обсчета результатов использовали 4 лунки на один опытный образец и рассчитывали среднюю величину ОП опытного образца и удвоенную ошибку. Сравнения проводили по критерию Стьюдента [10].

Результаты

Результаты исследования чувствительности вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis к антибиотикам приведены в таблице. Для определения МПК антибиотиков необходимо было выбрать оптимальную стартовую посевную дозу микробных клеток.

Влияние антибиотиков на рост биопленок (ОП) разных штаммов В. pertussis при посевной дозе 5 МОЕ (М ± т)

Effect of antibiotics on the growth of biofilms (OD values) of different of B. pertussis strains at a seeding dose of 5 IOU (M ± m)

Доза антибиотика Dose of antibiotic	Штаммы В. pertussis / Strains of В. pertussis
	вакцинные / vaccine				свежевыделенные / freshly isolated
	Tohama 1	475	305	703	162	211	178
Контроль	Умеренная	Плотная	Плотная	Умеренная	Плотная	Плотная	Плотная
Control	Moderate	Dense	Dense	Moderate	Dense	Dense	Dense
	0,097 ± 0,015	0,337 ± 0,96	0,248 ± 0,013	0,120 ± 0,010	0,257 ± 0,064	0,345 ± 0,082	0,222 ± 0,011
Гентамицин / Gentamicin
5 мкг/мл 5 μg/ml	Нет	Нет	Слабая	Нет	Нет	Умеренная	Нет
	No	No	Weak	No	No	Moderate	No
	0,096 ± 0,003	0,064 ± 0,002	0,108 ± 0,004	0,074 ± 0,005	0,067 ± 0,001	0,112 ± 0,002	0,095 ± 0,007
1 мкг/мл 1 μg/ml	Умеренная	Нет	Умеренная	Умеренная	Нет	Умеренная	Умеренная
	Moderate	No	Moderate	Moderate	No	Moderate	Moderate
	0,173 ± 0,008	0,073 ± 0,005	0,172 ± 0,026	0,116 ± 0,009	0,078 ± 0,004	0,140 ± 0,015	0,120 ± 0,012
0,2 мкг/мл 0.2 μg/ml	Плотная	Нет	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Умеренная
	Dense	No	Moderate	Moderate	Moderate	Moderate	Moderate
	0,224 ± 0,020	0,086 ± 0,003	0,180 ± 0,021	0,151 ± 0,003	0,112 ± 0,016	0,147 ± 0,017	0,131 ± 0,013
Эритромицин / Erythromycin
5 мкг/мл 5 μg/ml	Нет	Нет	Нет	Слабая	Нет	Нет	Нет
	No	No	No	Weak	No	No	No
	0,058 ± 0,006	0,095 ± 0,004	0,091 ± 0,003	0,100 ± 0,010	0,071 ± 0,005	0,057 ± 0,004	0,081 ± 0,002
1 мкг/мл 1 μg/ml	Умеренная	Умеренная	Плотная	Слабая	Умеренная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Moderate	Dense	Weak	Moderate	Moderate	Moderate
	0,117 ± 0,006	0,134 ± 0,007	0,216 ± 0,011	0,100 ± 0,004	0,154 ± 0,011	0,162 ± 0,005	0,174 ± 0,022
0,2 мкг/мл 0.2 μg/ml	Умеренная	Умеренная	Плотная	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Moderate	Dense	Moderate	Moderate	Moderate	Moderate
	0,152 ± 0,003	0,135 ± 0,003	0,256 ± 0,031	0,180 ± 0,009	0,175 ± 0,011	0,130 ± 0,010	0,144 ± 0,009
Цефтриаксон / Ceftriaxone
5 мкг/мл 5 μg/ml	Нет	Нет	Умеренная	Слабая	Умеренная	Слабая	Умеренная
	No	No	Moderate	Weak	Moderate	Weak	Moderate
	0,089 ± 0,012	0,081 ± 0,012	0,154 ± 0,012	0,101 ± 0,008	0,112 ± 0,002	0,101 ± 0,009	0,124 ± 0,014
1 мкг/мл 1 μg/ml	Нет	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Плотная	Умеренная	Умеренная
	No	Moderate	Moderate	Moderate	Dense	Moderate	Moderate
	0,096 ± 0,026	0,158 ± 0,025	0,154 ± 0,012	0,154 ± 0,023	0,189 ± 0,025	0,127 ± 0,014	0,132 ± 0,002
0,2 мкг/мл 0.2 μg/ml	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Плотная	Плотная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Moderate	Moderate	Dense	Dense	Moderate	Moderate
	0,159 ± 0,026	0,171 ± 0,029	0,171 ± 0,027	0,214 ± 0,018	0,240 ± 0,041	0,126 ± 0,020	0,150 ± 0,010
Ампицилин / Ampicillin
5 мкг/мл 5 μg/ml	Слабая	Нет	Умеренная	Нет	Нет	Умеренная	Нет
	Weak	No	Moderate	No	No	Moderate	No
	0,100 ± 0,007	0,051 ± 0,001	0,112 ± 0,026	0,055 ± 0,003	0,056 ± 0,003	0,184 ± 0,060	0,065 ± 0,002
1 мкг/мл 1 μg/ml	Умеренная	Умеренная	Умеренная	Плотная	Умеренная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Moderate	Moderate	Dense	Moderate	Moderate	Moderate
	0,112 ± 0,004	0,185 ± 0,020	0,162 ± 0,009	0,202 ± 0,028	0,151 ± 0,049	0,170 ± 0,039	0,133 ± 0,017
0,2 мкг/мл 0.2 μg/ml	Умеренная	Плотная	Плотная	Плотная	Плотная	Умеренная	Умеренная
	Moderate	Dense	Dense	Dense	Dense	Moderate	Moderate
	0,180 ± 0,021	0,219 ± 0,028	0,219 ± 0,023	0,228 ± 0,015	0,197 ± 0,039	0,187 ± 0,056	0,126 ± 0,026

Примечание. Различия между значениями ОП культур с отсутствием, слабыми, умеренными и плотными биопленками статистически достоверны (р < 0,001).

Note. Differences between the OD values for cultures with no, weak, moderate and dense biofilms are statistically significant (p < 0.001).

Контрольные культуры исследованных штаммов различались по интенсивности образования биопленок в зависимости от посевной дозы. При посевной дозе 5 МОЕ 5 из 7 штаммов формировали плотные биопленки, а 2 штамма — умеренные. При посевной дозе 2,5 МОЕ плотные биопленки формировали 2 штамма, а 5 штаммов — умеренные. При дозе 1,25 МОЕ только 1 штамм формировал плотную биопленку, а остальные 6 — умеренные или слабые. В связи с этим чувствительность штаммов к антибиотикам оценивали при посевной дозе 5 МОЕ/мл. Вакцинный штамм Tohama 1 проявлял чувствительность к гентамицину и эритромицину с МПК 5 мкг/мл и цефтриаксону с МПК 1 мкг/мл. По отношению к ампициллину этот штамм был устойчивым с ростом умеренных биопленок с МПК 0,2 и 1 мкг/мл и слабых биопленок — с 5 мкг/мл. Вакцинный штамм № 475 был чувствительным к гентамицину с МПК 0,2 мкг/мл, а также к эритромицину, цефтриаксону и ампициллину с МПК 5 мкг/мл. Вакцинный штамм № 305 был чувствителен только к эритромицину с МПК 5 мкг/мл и устойчив к остальным трем антибиотикам. Вакцинный штамм № 703 был чувствительным к гентамицину и ампициллину с МПК 5 мкг/мл и устойчивым к эритромицину и цефтриаксону. Свежевыделенный штамм № 162 проявлял чувствительность к гентамицину c МПК 1 мкг/мл, а к эритромицину и ампициллину — с МПК 5 мкг/мл. Свежевыделенный штамм № 178 был чувствителен к гентамицину, эритромицину и ампициллину с МПК 5 мкг/мл. К цефриаксону штаммы № 162 и № 178 были устойчивы и формировали биопленки различной интенсивности — от умеренных до плотных — при всех использованных концентрациях антибиотика. Свежевыделенный штамм № 211 был чувствительным только к эритромицину с МПК 5 мкг/мл и проявлял устойчивость к гентамицину, цефтриаксону и ампициллину.

Обсуждение

Нами исследована чувствительность биопленок основных сероваров вакцинных и свежевыделенных штаммов коклюшного микроба к различным антибиотикам. В результате проведенных исследований были разработаны оптимальные условия оценки чувствительности биопленочных форм B. pertussis к антибиотикам разных групп. Интенсивность образования биопленок штаммами зависела от стартовой посевной дозы микробных клеток и концентрации антибиотиков. В качестве оптимальной посевной дозы микробных клеток была выбрана доза 5 МОЕ/мл, при использовании которой большинство штаммов формировали плотные биопленки при отсутствии в питательной среде антибиотиков.

Выявлены определенные различия между биопленками исследованных штаммов по чувствительности к антибиотикам. Наиболее высокой устойчивостью к антибиотикам отличались вакцинный штамм № 305 и свежевыделенный штамм № 211, проявлявшие чувствительность только к эритромицину. Вакцинный штамм № 703 был чувствителен к гентамицину и ампициллину и проявлял резистентность к эритромицину и цефтриаксону. Вакцинный штамм № 475 был чувствителен ко всем испытанным антибиотикам. Штамм Tohama 1 был резистентен к ампициллину и чувствителен к остальным антибиотикам. Свежевыделенные штаммы № 178 и № 162 были устойчивы к цефтриаксону и чувствительны к гентамицину, эритромицину и ампициллину. В доступной литературе имеются отдельные указания на возможность более высокой антибиотикорезистентности биопленок свежевыделенных штаммов коклюшного микроба по сравнению с вакцинными [8]. Полученные нами результаты указывают на отсутствие существенных различий между исследованными вакцинными и свежевыделенными штаммами по чувствительности к антибиотикам.

Полученные результаты указывают на гетерогенность исследованных нами вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis по чувствительности к антибиотикам. При этом высокая чувствительность штаммов к определенным антибиотикам сочеталась с резистентностью к антибиотикам других групп. Необходимо отметить высокие МПК антибиотиков для биопленок. МПК гентамицина составляла 0,2 мкг/мл для штамма № 475, 1 мкг/мл для штамма № 162 и 5 мкг/мл для штаммов Tohama 1, № 703 и № 178. МПК эритромицина и ампициллина составляли 5 мкг/мл для всех чувствительных к этим антибиотикам штаммов. МПК цефтриаксона для штаммов Tohama 1 и № 475 составляли 1 и 5 мкг/мл соответственно. В целом МПК использованных антибиотиков составляли от 0,2 до 5 мкг/мл. По данным литературы, МПК для планктонных культур коклюшного микроба, определенные традиционными методами, составляют: эритромицин — 0,1–0,125 мкг/мл, ампициллин — 0,12–0,5 мкг/мл, гентамицин — 0,06–0,5 мкг/мл, цефтриаксон — 0,19 мкг/мл [11][12]. Таким образом, биопленочные культуры B. pertussis отличаются более высокой устойчивостью к антибиотикам по сравнению с планктонными культурами.

Результаты проведенных исследований позволяют также сделать определенные выводы об эффективности исследованных антибиотиков по отношению к биопленочным культурам. Наибольшую активность проявлял эритромицин, подавлявший рост биопленок большинства исследованных штаммов. Только вакцинный штамм № 703 проявлял устойчивость к этому препарату. Эти результаты согласуются с данными других авторов о том, что эритромицин проявляет наиболее высокую активность in vitro по отношению к возбудителю коклюша [11][13][14]. К гентамицину были чувствительны 5 штаммов, а к ампициллину — 4 штамма. Наименее эффективным был цефтриаксон, подавлявший рост биопленок только 2 штаммов.

Механизмы повышенной устойчивости биопленок B. pertussis к антибиотикам до конца не изучены и могут быть связаны с рядом факторов, среди которых можно отметить особенности строения матрикса [5]. Полученные нами результаты указывают на целесообразность дальнейшего исследования чувствительности биопленок B. pertussis к антибиотикам и выяснения механизмов их высокой антибиотикорезистентности.