Production and purification of recombinant proteins VP2 and VP3 of the Alongshan virus of the Jingmenvirus group and evaluation of their immunochemical properties

Full Text

Введение

Представители рода Orthoflavivirus (семейство Flaviviridae) инфицируют позвоночных и беспозвоночных животных. К этому роду принадлежат такие важные патогены человека, как вирус денге, вирус жёлтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), вирус японского энцефалита и др. Недавно была охарактеризована новая группа вирусов, названная Jingmenvirus, которая имеет родство с родом Orthoflavivirus [1]. В отличие от классических ортофлавивирусов, Jingmenvirus имеют сегментированный РНК геном [2]. Первый и третий сегменты генома Jingmenvirus кодируют белки, гомологичные хеликазе и РНК-зависимой РНК-полимеразе ортофлавивирусов [3, 4]. Второй и четвертый сегменты кодируют уникальные белки: белки оболочки VP1a и VP1b, предположительно капсидный белок VP2 и мембранный белок VP3.

Группа Jingmenvirus включает в себя такие вирусы, как Jingmen tick virus, Alongshan virus (ALSV), Yanggou tick virus и Takachi virus [1, 5, 6]. Они имеют широкое географическое распространение и детектируются в кровососущих членистоногих (в особенности в клещах) и млекопитающих, в том числе найдены в сыворотках людей [3, 7–13]. Вирусы ALSV и Jingmen tick, по-видимому, могут вызывать острую инфекцию у людей, сопровождающуюся лихорадкой [1, 14–16]. ALSV был впервые обнаружен и выделен из крови больного с лихорадочным заболеванием в Китае [17]. Позднее ALSV был выявлен методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) у других больных: было обследовано 86 человек с высокой температурой, головной болью и присасыванием клещей в анамнезе в период с мая по июль 2017 г. [17]. Также вирус был детектирован в клещах Iхоdes persulcatus и различных видах комаров (Anopheles yatsushiroensis, Aedes vexans, Culex pipiens pallens и Culex tritaeniorhynchus) в Китае.

В России в клещах вирус был обнаружен на территориях Калининградской, Челябинской, Ульяновской областей и в республиках Алтай, Татарстан, Карелия и Тыва [5, 18–20]. В связи с описанными случаями заболевания людей важной задачей являются эпидемиологические исследования представителей группы Jingmenvirus.

На данный момент не известно, к какому из белков вырабатываются антитела при инфекции, вызванной Jingmenvirus. Для определения ALSV-специфических антител у овец и крупного рогатого скота в Китае методом иммуноферментного анализа (ИФА) авторами был успешно использован рекомбинантный белок VP2 [17]. ALSV-специфические антитела были обнаружены у 9,2% (22/240) обследованных овец и 4,6% (11/240) обследованного крупного рогатого скота. В 2019 г. финскими учёными были использованы конструкции, кодирующие белки оболочки ALSV VP1a, VP1b, VP2 и VP3, транфицированные в клетки млекопитающих Vero E6. Эти клетки были использованы для выявления антител в сыворотках 900 пациентов методом иммунофлуоресценции [21].

Цель работы — получение рекомбинантных белков ALSV и использование их в лабораторной диагностической тест-системе для определения наличия антител к вирусу.

Материалы и методы

Вирусы и клетки

Для получения рекомбинантных белков был использован штамм Miass527 ALSV, изолированный из клещей I. persulcatus, собранных в 2014 г. в г. Миасс Челябинской области (код доступа NCBI: MN648770–MN648773) [1]. Рекомбинантный белок sE ВКЭ был любезно предоставлен В.С. Барышниковой [22].

Для клонирования были использованы клетки Escherichia coli, штамм TOP10 («Promega»), для экспрессии рекомбинантных белков — штаммы JM109 и BL21 («Promega»).

Получение гипериммунных сывороток крови

Для получения гипериммунных сывороток в работе использовали беспородных мышей ICR (Научный центр биотехнологии), которых иммунизировали под кожу ALSV (штамм Miass527) с адъювантом Фрейнда («BD») 3 раза (1 раз в неделю), через 10 дней после последней инъекции тотально забирали кровь (декапитация). Полученные сыворотки от 3 мышей к ALSV использовали в иммуноблотинге и ИФА. Сыворотка от 1 мыши к ВКЭ (штамм КЭ-328) была любезно предоставлена В.С. Барышниковой [22]. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку неиммунизированной мыши.

Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Федерального научного центра исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита) (протокол № 200923-1 от 20.09.2023).

Сыворотки условно здорового населения

Сыворотки условно здоровых людей, имеющих антитела к ВКЭ, из Москвы и Московской области были любезно предоставлены Центром гигиены и эпидемиологии в Московской области.

Биоинформатический анализ

Для определения сигнальных пептидов, гидрофильных и гидрофобных учасиков белков использовали программу «SignalP 4.1 Server»¹, для определения массы белков — программу DNA to Protein на сайте Zbio.net.

Клонирование генов белков VP2 и VP3 вируса Alongshan (штамм Miass527)

Обратную транскрипцию проводили c использованием обратной транскриптазы «Invitrogen SuperScript III» («Thermo Fisher Scientifiс»).

ПЦР проводили с помощью амплификатора «Veriti 96 Well Thermal Cycler» («Applied Biosystems»), используя полимеразу Platinum Super Fi II («Thermo Fisher Scientifiс»).

Состав смеси для ПЦР: буфер SuperFi 10 мкл, нуклеотиды 2,5 мМ 1 мкл, праймеры по 1 мкл, полимераза Platinum SuperFi II 1 мкл, кДНК 2 мкл, вода 32 мкл. Общий объём 50 мкл.

Программа ПЦР для полимеразы Platinum Super Fi II:

• 98ºС 30 с;
• 98ºС 10 с;
• 60ºС 10 с;
• 72ºС 30 с/30 циклов;
• 72ºС 5 мин.

В работе использовали эндонуклеазы рестрикции:

• BamHI и HindIII («Thermo Fisher Scientific») для плазмиды pQE32 («Qiagen») и ампликонов VP2 и VP3;
• BamHI и XhoI («Thermo Fisher Scientifiс») для плазмиды pet28a+ (коллекция плазмид ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН) и ампликона VP

После рестрикции полученные векторы и вставки наносили на 1% агарозный гель («ПанЭко») на основе 1хTBE буфера: 0,09 M Трис («ДиаМ»), 0,09 M H₃BO₃ («Пущинские лаборатории»), 2 мМ EDTA («ДиаМ») и очищали с помощью центрифужных колонок («Qiagen»).

Концентрацию ДНК измеряли по оптической плотности на приборе «NanoDrop One» («Thermo Fisher Scientifiс»). Реакцию лигирования проводили с помощью лигазы T4 DNA («Thermo Fisher Scientifiс»). Вектор и вставку брали в соотношении 5 : 1.

 

Таблица 1. Состав сред для индукции экспрессии целевого белка в клетках E. coli JM109 и Bl21

Среда	Ингредиенты	Концентрация, г/л
LB	Триптон («ДиаМ»)	10
	Дрожжевой экстракт («Sigma-Aldrich»)	5
	NaCl («Fluka»)	10
SOB	Триптон	20
	Дрожжевой экстракт	5
	NaCl	0,585
	KCl («Fluka»)	0,185
TB	Триптон	12
	Дрожжевой экстракт	24
	Глицерин 99% («Sigma-Aldrich»)	20*

Примечание. *Концентрация глицерина указана в мл/л.

 

Клетки E. coli TOP10 трансформировали полученными лигазными смесями методом теплового шока и растили в среде LB (табл. 1) при 37ºС. Наличие вставки проверяли методом ПЦР с праймерами для клонирования. С помощью метода секвенирования по Сэнгеру подтверждали наличие тэга 6 гистидинов, старт и стоп кодонов, отсутствие несинонимических замен. Секвенирование проводили с помощью набора «BigDye Terminator v.3.1 Cicle Sequencing Kit» («Thermo Fisher Scientific») на приборе «Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer» («Waltham»).

Трансформация и культивирование клеток E. сoli при экспрессии

При трансформации для экспрессии белков использовали штаммы: для плазмиды pQE32 — штамм JM109, для pet28a+ — штамм Bl21. Для культивирования клеток использовали среды: LB, SOB и TB (табл. 1).

Затем отбирали одну колонию клеток с чашки Петри и растили её в 5 мл среды с добавлением антибиотика 100 нг/мл (ампициллин — для pQE32, канамицин — для pet28a+) в течение 18 ч. Далее клеточную суспензию переносили в 250 мл среды с ампициллином 100 нг/мл или канамицином 50 нг/мл. При достижении клеточной массы оптической плотности 0,5–0,8 при длине волны 600 нм (9,6 × 10⁹ клеток/мл) добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (ИПТГ; «Helicon»). Инкубировали клетки при различной температуре и времени при перемешивании. Далее клеточную массу осаждали центрифугированием при 1700g, 4ºС в течение 30 мин, полученный осадок промывали 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS; «Sigma-Aldrich»).

Условия, при которых проводили экспрессию рекомбинантных белков, если не указано иного: время инкубации клеток — 12 ч в среде LB при 37ºС и концентрации ИПТГ 0,5 мМ.

Разрушение клеток ультразвуком

Клеточную массу переосаждали в 20 мл лизирующего буфера (HEPES 100 мМ («ДиаМ»), NaCl 0,15 М, pH 8,5) и обрабатывали ультразвуком (прибор «Soniprep 150», «MSE») следующим образом: 3 раза по 1 мин импульсом 7 мс на льду. Далее клетки центрифугировали (7800g, 4ºС, 30 мин), осадок ресуспензировали в 20 мл лизирующего буфера с 8 М мочевиной (для выхода белка в растворимую фракцию) и обрабатывали ультразвуком 1 раз 30 с, после чего центрифугировали (7800g, 4ºС, 30 мин).

Выделение и очистка рекомбинантных белков

Очистку рекомбинантных белков проводили методом аффинной хроматографии с помощью готового набора для выделения Ni-NTA Fast Start («Qiagen»).

Смену буфера на PBS и концентрирование проводили с помощью центрифужных ультрафильтров «Amicon Ultra-15» 10 кДа («Merck»).

Полученные рекомбинантные белки разделяли электрофорезом в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях (ПААГ-SDS). Для определения концентрации целевых белков использовали калибровочный график, построенный по известным концентрациям BSA («Genesystool»). Далее концентрацию целевого белка измеряли с помощью прибора «GBox» («Syngene») в программе «GeneTools» («Syngene»).

Получение отрицательного контроля (Mock)

Для получения отрицательного контроля (Mock) были проведены те же манипуляции с плазмидами pQE-32 и pet28a+ без вставки, что и с конструкциями со вставкой: трансформация, культивирование соответствующих бактериальных клеток, экспрессия, выделение и очистка. Далее контроль использовали для визуализации в ПААГ, иммуноблотинге и ИФА.

Иммуноблотинг

Полученные рекомбинантные белки разделяли электрофорезом в 15% ПААГ-SDS и переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad»). Мембрану инкубировали с 5% обезжиренным коровьим молоком («Best Value») в трис-солевом буфере (TBS: 25 мМ Tris, 0,15 M NaCl, рН 8,3) в течение 1 ч.

Затем мембрану инкубировали с целевой сывороткой 1 ч: мыши, человека или к гистидиновому тэгу. Далее промывали мембрану TBS с 0,05% Tвин-20 (TBS-T) и инкубировали с меченными пероксидазой хрена (HRP) антителами против IgG мыши или человека соответственно («Abcam») в течение 1 ч. В случае использования HRP-меченных антител к гистидиновому тэгу («Abcam») инкубирование со вторичными мечеными антителами не требуется.

Перед проявлением мембрану снова промывали TBS-T, затем проявляли с использованием набора «ECL» («Bio-Rad») в гель-документирующей системе «Genesys» («Genesys»).

Иммуноферментный анализ

В лунку 96-луночного планшета вносили 80 нг белка, разведённого в PBS, и инкубировали в течение ночи при 4ºС. Планшет промывали PBS, инкубировали с 4% обезжиренным коровьим молоком («Best Value») в PBS в течение 1 ч, затем с сыворотками мышей в PBS с 0,05% Tвин-20 1 ч. Планшет промывали, инкубировали с HRP-конъюгированными антителами против мышиного IgG («Abcam») соответственно в течение 1 ч, после чего промывали и вносили субстрат TMB («Sigma-Aldrich»), через 30 мин реакцию останавливали 2 М серной кислотой («Ленреактив»). Результаты детектировали при длине волны 450 нм на спектрофотометре («Thermo Fisher Scientific»).

Результаты

Выбор и получение мишеней для клонирования

В нашей работы был выбран предположительно капсидный белок VP2, т. к. китайскими учёными уже были обнаружены антитела у крупного рогатого скота к данному белку [13], а также мембранный белок VP3, который был клонирован впервые в нашей работе. Белки кодируются в 4-м сегменте генома ALSV.

Для белка VP2 была определена последовательность сигнального пептида (19 ак), гидрофобных участков он не имеет — для клонирования был выбран участок без сигнального пептида 243 ак, т. к. он мог затруднить последующее выделение белка. Белок VP3 содержит 9 трансмембранных гидрофобных доменов — для клонирования были выбраны гидрофильные участки 1–89 и 244–389 ак (рис. 1).

Рис. 1. Схематическое изображение целевых участков VP2 и VP3 для клонирования.
Черный фрагмент — сигнальный пептид белка VP2, серые — трансмембранные домены белка VP3. 1 — участок белка VP3 1–267 ак, 2 — участок белка VP3 244–389 ак.

 

Предположительные размеры белков: VP2 — 25 кДа, а гидрофильные участки белка VP3-1 и VP3-2 — 10 и 18 кДа соответственно.

Далее на основании нуклеотидных последовательностей белка VP2 и гидрофильных участков белка VP3 были подобраны праймеры (табл. 2) и получены соответствующие ПЦР-продукты (рис. 2).

 

Рис. 2. Электрофоретический анализ ампликонов целевых участков гена белков VP2 и VP3. MW — маркер длины ДНК. VP2 — участок, кодирующий 1-89 ак; VP3 — участок, кодирующий 244–389 ак VP3.

 

Таблица 2. Праймеры для клонирования белка VP2 и гидрофильного участка белка VP3

Праймер	Последовательность, 5'→3'	Участок генома на основе последовательности вируса Alongshan (GenBank #MN648773.2)
VP2-28s	GAGCTAGGATCCAAGCCAAACGGAGCCCCAGAT	168–188
VP2-28as	GAGCTACTCGAGCTACTGAAAAACCTGGTAGTTG	857–872
VP3s 244–389	GAGCTAGGATCCGACAAGGATCAAGCCTACCTC	1576–1597
VP3as 244–389	TAGCTCAAGCTTCCATTGGGTGTAGACCAGGT	1998–2017
MiVP3s 1–89	GCTAGGATCCGTGCGACCCCAACTACCAGGT	848–868
MiVP3as 1–89	TAGCTCAAGCTT TCTCTCCTCCAGTCGCC	1095–1114

 

Получение векторных конструкций

Конструкция со вставкой участка 244–389 ак белка VP3 на основе вектора pQE-32 оказалась удачной (рис. 3, 4). Однако с другими вставками на основе вектора pQE-32 экспрессия рекомбинантных белков либо не происходила (в случае вставки VP2), либо приводила к гибели бактериальных клеток на 3 ч культивирования (в случае вставки участка 1–267 ак белка VP3), что говорит о возможной токсичности белка для данных бактериальных клеток. В связи с этим нами было принято решение собрать новую генно-инженерную конструкцию плазмиды pET28a+ со вставкой белка VP2 (рис. 3).

 

Рис. 3. Генно-инженерные конструкции, с которыми была показана экспрессия. a — конструкция плазмиды pQE-32 и участка белка VP3; б — конструкция плазмиды pet28a и участка белка VP2.  AmpR — ген устойчивости к ампициллину; lac operator — лактозный оператор; bp — нуклеотиды; KanR — ген устойчивости к канамицину; RBS — сайт посадки рибосомы; 6хHis — сайт 6 гистидинов; MCS — сайты рестрикции.

 

Рис. 4. Результаты иммуноблотинга рекомбинантных белков VP3 (a) и VP2 (б) с антителами к гистидину.

 

Успешность экспрессии белков в конструкциях pQE-32-244-389 и pet28a-VP2 была подтверждена с использованием антител к гистидиновой метке. Оба рекомбинантных белка показали положительные результаты в вестерн-блоте (рис. 4). Культивирование клеток проходило при условиях: среда LB, 37°С, концентрация ИПТГ 0,5 мМ, 12 ч.

Оптимизация условий экспрессии рекомбинантных белков

Для повышения выхода белков был предпринят ряд экспериментов. Оптимизировали следующие параметры: среду культивирования клеток, длительность инкубации с ИПТГ, концентрацию ИПТГ и температуру роста клеток. На рис. 5 показано, что наибольшая концентрация целевого белка VP3 достигается при добавлении 0,5 мМ ИПТГ при росте бактерий 12 ч при 37ºC. Использование различных сред LB, SOB и TB не влияло на экспрессию рекомбинантного участка белка VP3 (рис. 5, в).

 

Рис. 5. Электрофоретический анализ рекомбинантного участка белка VP3 244–389 ак в ПААГ при различных концентрации ИПТГ (a), времени (б), среде (в) и температуре (г) экспрессии для целевого белка.

 

В связи с этим нами были определены рабочие условия экспрессии целевого белка — культивирование клеток в течение 12 ч с концентрацией индуктора лактозного оператора 0,5 мМ при 37ºC в среде LB.

 

Рис. 6. Электрофоретический анализ рекомбинантного участка белка VP2 в ПААГ при различных температуре (а), концентрации ИПТГ (б), среде (в) и времени (г) экспрессии для целевого белка.

 

Изменения условий среды, концентрации ИПТГ и температуры не повлияли на экспрессию рекомбинантного белка VP2 в клетках E. coli, штамм BL21 (рис. 6), но при увеличении времени роста клеток бактерий экспрессия увеличивалась.

Поскольку среда для бактерий, температура их роста и концентрация ИПТГ не повлияли на экспрессию рекомбинантного белка VP2, нами были выбраны рабочие условия экспрессии: культивирование клеток в течение 12 ч при 37°C с концентрацией индуктора лактозного оператора 0,5 мМ в среде LB.

Выделение рекомбинантных белков

Одним из важных этапов для дальнейшего выделения белков является определение их растворимости. Для рекомбинантного участка белка VP3 было определено, что он находится в растворимой фракции без мочевины (рис. 7). Целевой белок VP2 находится в нерастворимой фракции (с 8 М мочевиной), что могло затруднить его дальнейшее получение и очистку. При этом добавление ингибиторов сериновых протеаз, которое может повлиять на растворимость белка, не дало результатов — для выделения рекомбинантного белка VP2 необходимо добавление мочевины.

 

Рис. 7. Определение фракций целевых белков VP2 (a) и VP3 (б) в ПААГ. а — лизат клеток после сонификации в лизирующем буфере: 1 — с 8 М мочевиной; 2 — без добавок; 3 — с 8 М мочевиной и ингибиторами сериновых протеаз; 4 — с ингибиторами сериновых протеаз. б — клеточный лизат после 12 ч культивирования (1), Mock (2), лизат клеток до добавления ИПТГ (3), лизат клеток после сонификации в лизирующем буфере (4), фракция осадка с 8 М мочевиной (5).

 

Далее рекомбинантные белки очищали на гравитационной колонке методом аффинной хроматографии (рис. 8). После обессоливания и концентрирования на центрифужных фильтрах измеряли концентрацию белков по методу Брэдфорда: для рекомбинантного участка белка VP3 она составила 70 мкг/мл, для белка VP2 — 120 мкг/мл (при экспрессии белков в 250 мл среды с клеточной массой).

 

Рис. 8. Выделение целевого белка VP2 в ПААГ с помощью набора «Qiagen Ni-NTA Fast Start» (а) и обессоливание с помощью амиконов (б). а: 1 — белок VP2 в лизирующем буфере с 8 М мочевиной; 2 — фракция проскока; 3 — фракция промывки колонки wash-буфером; 4 — элюат, содержащий целевой белок; 5 — элюат, содержащий продукты деградации белка. б — рекомбинантный белок VP2 и продукты его деградации (обозначение: треугольник); К+ — положительный контроль.

 

С помощью вестерн-блота и использования гипериммунных мышиных сывороток к ALSV была показана способность рекомбинатного белка VP2 взаимодействовать с противовирусными антителами. Были проверены 3 гипериммунные мышиные сыворотки — белок VP2 взаимодействовал со всеми, в то время как рекомбинантный участок белка VP3 был выявлен только с одной. В качестве примера на рис. 9 приведён иммуноблот рекомбинантных белков VP2 и VP3 с гипериммунной мышиной сывороткой. В качестве отрицательной сыворотки в вестерн-блоте была использована сыворотка неиммунизированной мыши.

 

Рис. 9. Результаты иммуноблотинга целевого белка с сывороткой мыши, иммунизированной вирусом Alongshan (штамм Miass527). a — экспрессия рекомбинантного белка VP3; б — лизат клеток после экспрессии рекомбинантного белка VP2 (1), выделенного и обессоленного рекомбинантного белка VP2 (2), Mock (3). Для детекции использовали HRP-меченные антитела против IgG мыши («Abcam»).

 

Для доказательства специфичности рекомбинантного белка VP2 в вестерн-блоте также использовали мышиные сыворотки к ВКЭ (рис. 10). В качестве положительного контроля служил рекомбинантный белок ВКЭ sE [22]. Полученный нами белок VP2 не связывался с антителами к ВКЭ.

 

Рис. 10. Результаты иммуноблотинга целевого белка мышиной гипериммунной сыворотки к ВКЭ (штамм КЭ-328). Для детекции использованы HRP-меченные антитела против IgG мыши («Abcam»). 1 — выделенный и обессоленный рекомбинантный белок VP2; 2 — Mock; 3 — лизат клеток СПЭВ без вируса ВКЭ; 4 — рекомбинантный белок sE размером 44 кДа [22].

 

Рис. 11. Анализ мышиной гипериммунной сыворотки к вирусу Alongshan Miass527 с рекомбинантным белком VP2 (a) и Mock (б).Лунки 96-луночного планшета сенсибилизировали раствором белка VP2; в анализе использована гипериммунная мышиная сыворотка к вирусу Alongshan (С+) и сыворотка неиммунизированной мыши (С–) с указанными на рисунке разведениями. Для детекции использованы HRP-меченные антитела против IgG мыши («Abcam»).

 

Результаты вестерн-блот-анализа были подтверждены в ИФА с мышиной гипериммунной сывороткой к ALSV (рис. 11). Для определения рабочей концентрации рекомбинантных белков в ИФА были проверены разные концентрации белка (20, 40, 80 и 120 нг/лунку) и разведение сыворотки (1 : 180 и 1 : 360). Оптимальной оказалась концентрация белка 80 нг/лунку. В качестве отрицательного контроля использовалась сыворотка неиммунизированной мыши. Для дополнительного подтверждения результатов мышиная гипериммунная сыворотка к ALSV также была проверена в ИФА, где в качестве подложки использовалась плазмида, с которой были произведены все те же манипуляции, что и с плазмидой со вставкой и рекомбинантным белком при выделении (Mock).

Положительные результаты ИФА и вестерн-блот позволяют использовать белок VP2 для детекции антител против ALSV в сыворотках.

Анализ сывороток условно здоровых людей

С помощью полученных нами рекомбинантных белков были проверены 30 сывороток условно здоровых людей из Москвы и Московской области, имеющих антитела к ВКЭ. При анализе методом ИФА использовали образцы целевого белка в концентрации 80 нг/лунку, в качестве отрицательного контроля в подложке был использован Mock (имел ту же концентрацию по общему белку), а в качестве отрицательной сыворотки — сыворотка условно здорового человека, не имевшего антитела к ВКЭ. Таким образом, была выявлена 1 сыворотка, содержащая антитела к белку VP2 ALSV. К рекомбинантному участку 244–389 ак белка VP3-антител не обнаружено.

Для подтверждения результатов ИФА нами был проведён вестерн-блот положительной в ИФА сыворотки пациента (рис. 12).

 

Рис. 12. Результаты иммуноблотинга целевого белка с сывороткой условно здорового человека. Для детекции использовали HRP-меченные антитела против IgG человека («Abcam»).

 

Обсуждение

Ранее белок VP2 уже был получен китайскими учёными с помощью вектора pET30a, который экспрессировали при 15ºС в клетках BL21 (DE3) E. сoli [17]. В нашей работе было показано, что белок VP2 успешно экспрессируется с использованием плазмиды плазмида pet28a(+), также была опробована низкая температура культивирования клеток, но это не повлияло на уровень экспрессии рекомбинантного белка. Эффективное выделение рекомбинантного белка VP2 проходит при добавлении 8 М мочевины. При этом было показано, что впервые полученный нами рекомбинантный участок белка VP3 (вектор pQE-32) является растворимым. Выход целевого продукта выше с вектором pet28a(+), чем с pQE-32, при этом полученных концентраций обоих белков достаточно для многократного проведения ИФА.

С помощью рекомбинантного белка VP2 были выявлены антитела у крупного рогатого скота в Китае [17]. В нашей работе мы подтвердили, что белок VP2 обладает антигенными свойствами в иммуноблоте и ИФА. Впервые нами было показано, что полученный нами рекомбинантный пептид VP2 ALSV штамм Miass527 не имеет антигенных перекрёстов с ВКЭ в вестерн-блоте. Показано, что при иммунизации мышей живым ALSV более регулярно синтезируются антитела к рекомбинантному белку VP2 и менее регулярно — к рекомбинантному участку белка VP3. Возможно, это связано с различным спектром антител в полученных мышиных сыворотках — белок VP2 взаимодействует с бÓльшим спектром антител, выработанных на разных этапах инфекции. Также в ИФА были обнаружены антитела у условно здорового человека с укусом клеща в анамнезе к рекомбинантному пептиду VP2, а к рекомбинантному пептиду VP3 антител в сыворотках людей не обнаружено.

 

 

***

Источник финансирования. Финансирование работы осуществлялось по государственному заданию FNZG-2024-0001 и государственному заданию FNZG-2024-0008.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23.07.2010). Протокол исследования одобрен этическим комитетом Федерального научного центра исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита) (протокол № 200923-1 от 20.09.2023).

Участие авторов: Бондаренко Е.В., Ермолаева Е.А. — визуализация, написание и подготовка рукописи; Холодилов И.С., Литов А.Г. — руководство и научное редактирование. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям Международного комитета редакторов медицинских журналов, внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Funding source. The work was funded under the state assignment FNZG-2024-0001 and the state assignment FNZG-2024-0008.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July, 2010). The research protocol was approved by the Ethics Committee of the Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (protocol No. 200923-1, September 20, 2023).

Authors’ contribution: Bondarenko E.V., Ermolaeva E.A. — visualization, writing and preparation of manuscript; Kholodilov I.S., Litov A.G. — management and scientific editing. Аll authors confirm that they meet the International Committee of Medical Journal Editors criteria for authorship, made a substantial contribution to the conception of the article, acquisition, analysis, interpretation of data for the article, drafting and revising the article, final approval of the version to be published.

 

¹ SignalP 4.1 Server». URL: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0

About the authors

Ekaterina V. Bondarenko

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Author for correspondence.
Email: bondarenko_ev@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0002-5972-0761

junior researcher, Laboratory of biochemistry

Россия, Moscow

Elena A. Ermolaeva

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: le.ermolaeva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0406-0604

junior researcher, Laboratory of biochemistry

 

Россия, Moscow

Ivan S. Kholodilov

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: ivan-kholodilov@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-3764-7081

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of arboviruses biology

Россия, Moscow

Aleksander G. Litov

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: novosti-wxo@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6086-3655

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of arboviruses biology

Россия, Moscow

References

Supplementary files