Multiplex real-time PCR for detection of  qac A/B  and  smr  genes in Gram-positive bacteria

Svetlana N. Kovalchuk; Ковальчук Светлана Николаевна; Anna L. Arkhipova; Архипова Анна Леонидовна; Svetlana Yu. Kovylkova; Ковылкова Светлана Юрьевна; Elena N. Ilina; Ильина Елена Николаевна; Lyudmila S. Fedorova; Федорова Людмила Самуиловна

doi:10.36233/0372-9311-574

Multiplex real-time PCR for detection of qac A/B and smr genes in Gram-positive bacteria

Authors: Kovalchuk S.N.¹, Arkhipova A.L.¹, Kovylkova S.Y.¹, Ilina E.N.¹, Fedorova L.S.¹
Affiliations:
1. Research Institute for Systems Biology and Medicine
Issue: Vol 101, No 5 (2024)
Pages: 692-698
Section: SCIENCE AND PRACTICE
Submitted: 16.11.2024
Accepted: 16.11.2024
Published: 18.11.2024
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18690
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-574
EDN: https://elibrary.ru/ubbcnj
ID: 18690

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Background. Disinfectants are effective means of non-specific prevention of infections associated with the provision of medical care. Violation of disinfectant use regimes leads to the formation of microorganism resistance to them. To monitor the spread of clinically significant microorganisms resistant to disinfectants, the development of methods for their detection, including molecular genetic methods, remains relevant.

The aim of the study was to develop a multiplex real-time PCR for the identification of qacA/B and smr genes, the determinants of resistance to cationic biocides, in Gram-positive bacteria.

Materials and methods. Conserved regions of qacA, qacB and smr genes were searched, and primers and probes were designed using BLASTN, GeneRunner, and Multiple Primer Analyzer programs. To evaluate the analytical sensitivity of the multiplex PCR, plasmids pTZ57-qacA/B, pTZ57-smr, and pTZ57-16S containing qacA/B, smr and 16S rRNA gene fragments of 197 bp, 127 bp, and 287 bp, respectively, were constructed. The method was tested on clinical isolates of Gram-positive bacteria (n = 30).

Results. A multiplex real-time PCR using TaqMan probes was developed for the detection of qacA/B and smr genes in Gram-positive bacteria. The 16S rRNA gene was used as an internal amplification control. The sensitivity of the multiplex PCR was 10³ copies for all genes. Multiplex PCR validation showed that qacA/B genes were present in 30%, smr genes were present in 10% of the isolates tested. The reproducibility of the results was 100%.

Conclusion. The developed multiplex PCR differs from existing assays by high specificity and short turnaround time, as well as by the presence of an internal amplification control. It can be used for the detection of Gram-positive bacteria potentially resistant to cationic biocides.

Keywords

disinfectants, resistance, qacA/B, smr, real-time PCR

Full Text

Введение

Распространение в последние десятилетия штаммов патогенных бактерий, устойчивых к антимикробным препаратам и дезинфицирующим веществам (ДВ), — одна из острых проблем современного здравоохранения. ДВ являются одним из наиболее эффективных средств при проведении неспецифической профилактики инфекционных заболеваний и играют ведущую роль в системе мер по профилактике инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, а также широко используются на предприятиях общественного питания, пищевой промышленности, на коммунальных объектах, в образовательных учреждениях и в быту. Однако наблюдаемый с 1950-х гг. феномен устойчивости микроорганизмов к ДВ приводит к резкому снижению эффективности дезинфекционных мероприятий [1], что связано с использованием неэффективных режимов их применения, приводящим к формированию устойчивости микроорганизмов к ДВ, а также к перекрестной устойчивости к антибиотикам в силу наличия общих механизмов действия [2, 3].

Катионные поверхностно-активные вещества (КПАВ), к которым относятся четвертичные аммониевые соединения (ЧАС), производные гуанидина и третичные амины, являются наиболее часто используемыми ДВ [4, 5]. В 2023 г. ЧАС занимали наибольшую долю ДВ на мировом рынке¹, и сохранение этой тенденции прогнозируется на ближайшие 10 лет². Согласно имеющимся данным, на российском рынке их доля составляет 50–70% [6, 7].

Основным механизмом формирования микробной резистентности к ЧАС является снижение их внутриклеточной концентрации за счёт выведения из клетки c помощью эффлюксных насосов [5, 8], которые на основе структурного сходства и особенностей функционирования объединены в 6 суперсемейств:

RND (Resistance-Nodulation Division);
SMR (Small Multidrug Resistance);
MATE (Multidrug And Toxic compound Extrusion);
MFS (Major Facilitator Superfamily);
ABC (ATP Binding Cassette);
PACE (Proteobacterial Antimicrobial Compound Efflux) [9, 10].

Устойчивость к ЧАС грамположительных бактерий в основном связана с эффлюксными насосами QacA, QacB (суперсемейство MFS), а также Smr (QacC), QacG, QacH и QacJ, относящимися к надсемейству SMR [11, 12]. Мониторинг распространённости этих эффлюксных насосов среди грамположительных бактерий с помощью молекулярногенетических методов ведётся во многих странах и показал, что наиболее часто встречаются гены qacA, qacB и smr [13–16]. При этом информация о распространении этих генов среди российских изолятов грамположительных бактерий практически отсутствует. Лишь в одной публикации были представлены данные о наличии генов qacA и qacB у изолятов стафилоккоков, выделенных из смывов с поверхностей в общественных местах Новосибирска [17]. С учётом того, что гены qacA, qacB и smr имеют преимущественно плазмидную локализацию, они могут широко распространяться посредством горизонтального переноса, приводя к формированию приобретённой устойчивости к КПАВ у грамположительных бактерий [12].

Целью исследования была разработка мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с флуоресцентно-мечеными зондами для выявления генов qacA/B и smr у грамположительных бактерий.

Материалы и методы

Бактериальные изоляты

В исследовании были использованы изоляты грамположительных бактерий видов Staphylococcus aureus (n = 12), S. haemolyticus (n = 6), Enterococcus faecium (n = 6) и E. faecalis (n = 4), Streptococcus parasanguinis (n = 1) и S. epidermidis (n = 1), полученные от медицинских учреждений Москвы. Изоляты выделены из смывов, взятых с объектов внутрибольничной среды — поверхностей аппаратов ИВЛ и УЗИ, прикроватных тумбочек, поручней кроватей. Бактерии культивировали в течение 16 ч при 37ºC в ГРМ-бульоне (ГНЦ ПМБ). Видовую принадлежность изолятов определяли с помощью масс-спектрометра «SMART MS 5020» («Zhuhai DL Biotech Co., Ltd»).

Выделение ДНК

ДНК выделяли из бактериальной культуры с помощью набора для выделения ДНК «ExtractDNA Blood & Cells» (ЗАО «Евроген») согласно рекомендациям производителя и хранили при –20ºC. Концентрацию образцов ДНК определяли с помощью спектрофотометра «NanoDrop 2000C» («ThermoFS»).

Разработка праймеров и зондов

Нуклеотидные последовательности генов эффлюксных насосов qacA, qacB, smr и 16S рРНК грамположительных бактерий были взяты из базы данных GenBank³. Их анализ проводили с помощью программы BLASTN⁴. Праймеры и зонды были разработаны на основе консервативных участков генов с использованием программ «GeneRunner v. 62.2.55 Beta»⁵ и «Multiple Primer Analyzer»⁶.

Проведение мультиплексной ПЦР-РВ

Мультиплексную ПЦР-РВ проводили в объёме 25 мкл в 96-луночных планшетах для ПЦР с использованием амплификатора «CFX96 Real-Time System» («Bio-Rad Laboratories, Inc.»). Реакционная смесь включала в себя 5× буфер и 2,5 ЕД Taq-полимеразы (ООО «НПФ Литех»), праймеры (по 0,5 мкМ каждого), зонды TaqMan (по 0,25 мкМ каждого; таблица) и образец ДНК (5 нг). Зонды TaqMan синтезированы OOO «ДНК-синтез», праймеры — ЗАО «Евроген». Профиль реакции: 95ºC — 2 мин, 95ºC — 15 с, 56ºC — 20 с (36 циклов), 72ºC — 30 с.

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Nucleotide sequences of the primers and probes

Гены

Genes

Нуклеотидная последовательность (5’–3’)

Nucleotide sequence (5’–3’)

Размер, п. н.

Size, bp

qacA/B

qacA/B-D: 5'-CTGGCTTATACCTATTACCTA-3'

qacA/B-R: 5'-TCCAACTAAAATTAATGCTAAAG -3'

qacA/B-Pb: 5'-HEX- CGATTTGGACCGAAAATAGTGTTAC-BHQ1

197

smr

smr-F: AGTAAAACAATGCAACACCTAC-3'

smr-R: ATACTATAGTTATTAGATTTATTTG-3'

smr-Pb: 5'-FAM-TTAGTCTTAACAACCGTAGTCTCAAT-BHQ1

127

16S рРНК

16S rRNA

16S-D: 5'-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3'

Bakt_805R: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'

16S-Pb: Cy5-5'-TGTAGCGGTGAAATGCG- BHQ2'

287

Определение аналитической чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ

Для оценки аналитической чувствительности метода сконструированы плазмиды pTZ57-qacA/B, pTZ57-smr и pTZ57-16S, содержащие фрагменты генов qacA/B, smr и 16S рРНК длиной 197, 127 и 287 п. н. соответственно. Клонирование проводили с использованием набора реактивов «InsTAclone PCR Cloning Kit» («ThermoFS») согласно рекомендациями производителя. Оценку концентраций плазмид проводили с помощью набора «Spectra Q BR» (ООО «Сесана») и флуориметра «Qubit» («ThermoFS»). Секвенирование полученных плазмид проводили по методу Сэнгера. Путём 10-кратных разведений получены образцы плазмид pTZ57-qacA/B, pTZ57-smr и pTZ57-16S с концентрацией 10¹–10⁶ копий в 1 мкл, которые использовались в качестве матрицы для ПЦР-РВ. Анализ результатов проводили при помощи программного обеспечения к прибору «CFX96 Real-Time System» («Bio-Rad Laboratories, Inc.»).

Апробация и валидация метода

Апробацию мультиплексной ПЦР-РВ проводили с использованием ДНК, выделенной из изолятов грамположительных бактерий (n = 30). Для оценки вариабельности значений порогового цикла ПЦР (Cq) каждый образец тестировали в 3-кратной повторности и рассчитывали средние значения Cq, стандартные отклонения (SD) и коэффициент вариабельности (Cv, %). Полученные ампликоны генов qacA/B и smr проанализированы с помощью электрофорезного разделения в 1,5% агарозном геле и секвенированы по методу Сэнгера. Для валидации мультиплексной ПЦР-РВ использовали описанные ранее методы ПЦР с электрофоретической детекцией фрагментов генов qacA/B [18] и smr [19].

Результаты

Для мультиплексной ПЦР-РВ разработаны праймеры и зонды типа TaqMan, комплементарные высококонсервативным участкам генов qacA, qacB и smr (таблица), которые были выявлены на основе множественного выравнивания всех полноразмерных нуклеотидных последовательностей этих генов, имеющихся в базах данных GenBank, EMBL⁷ и DDBJ⁸. Проанализировано 302 нуклеотидных последовательности генов qacA/B и 220 последовательностей гена smr. Анализ генов qacA и qacВ показал, что они различались 8 нуклеотидами, поэтому для них разработаны общие праймеры и зонд.

При проведении тестирования методом ПЦР важным является использование внутреннего контроля амплификации, который позволяет исключить ложноотрицательные результаты вследствие отсутствия или недостаточного для детекции количества ДНК в реакционной смеси. В качестве эндогенного внутреннего контроля амплификации в разработанной мультиплексной ПЦР-РВ использован ген 16S рРНК. Праймер 16S-D и зонд были разработаны на основе анализа 5000 последовательностей 16S рРНК (таблица). В качестве обратного праймера использовали универсальный праймер Bakt_805R, разработанный ранее [20].

C помощью разработанных нами праймеров проведён поиск изолятов грамположительных бактерий (n = 30), содержащих гены qacA/B и smr. Полученные ампликоны были проанализированы с помощью электрофорезного разделения в 1,5% агарозном геле. Длины ампликонов генов qacA/B и smr соответствовали ожидаемым (таблица; рис. 1). Специфичность праймеров была подтверждена секвенированием ампликонов по методу Сэнгера.

Рис. 1. Результаты амплификации фрагментов генов qacA/B и smr.

1–9 — qacA/B-позитивные изоляты; 10–12 — smr-позитивные изоляты. К– — отрицательный контроль. M — маркер длин ДНК.

Fig. 1. Results of the amplification of qacA/B and smr genes.

1–9 — qacA/B-positive isolates; 10–12 — smr-positive isolates. K– — negative control. M — DNA length marker.

Для оценки аналитической чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ сконструированы плазмиды pTZ57-qacA/B, pTZ57-smr и pTZ57-16S, содержащие полученные ампликоны генов qacA/B, smr и 16S рРНК. С помощью 10-кратных разведений получены их образцы с концентрацией от 10¹ до 10⁶ копий в 1 мкл, которые использовались в качестве матрицы для разработанной мультиплексной ПЦР-РВ. Чувствительность мультиплексной ПЦР-РВ составила 10³ копий для всех генов. Эффективность амплификации генов qacA/B, smr и 16S рРНК при составила 95,1, 91,3 и 101,8% соответственно (рис. 2).

Рис. 2. Результаты определения чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ для выявления генов qacA/B и smr у грамположительных бактерий.

Fig. 2. Results of multiplex PCR sensitivity evaluation for detection of qacA/B and smr genes in gram-positive bacteria.

Апробацию разработанной мультиплексной ПЦР-РВ проводили с использованием 30 клинических изолятов грамположительных бактерий, полученных от медицинских учреждений Москвы. Тестирование проводили в 3 повторах. Выявлено, что 30% изолятов (6 изолятов S. haemolyticus и по 1 изоляту E. faecium, E. faecalis и S. parasanguinis) имели гены qacA/B и 10% изолятов (2 изолята S. haemolyticus и изолят S. epidermidis) содержали ген smr. У 2 изолятов S. haemolyticus были найдены и qacA/B, и smr. Воспроизводимость результатов тестирования для всех образцов составила 100%, коэффициент вариабельности значений Cq — от 3,4 до 6,2%. Результаты мультиплексной ПЦР-РВ полностью совпали как с данными моноплекных ПЦР с электрофорезной детекцией, так и с результатами секвенирования ампликонов по методу Сэнгера. В качестве альтернативного метода сравнения для разработанной нами мультиплексной ПЦР-РВ использованы методы ПЦР с электрофоретической детекцией генов qacA/B и smr, предложенные ранее K.H. Lin и соавт. [18] и N. Noguchi и соавт. [19] соответственно. Результаты, полученные с помощью этих методов, также полностью совпали. Таким образом, специфичность разработанной нами мультиплексной ПЦР-РВ с флуоресцентно-мечеными зондами составила 100%.

Обсуждение

Выявление генов резистентности методами ПЦР является широко распространенным и доступным методом их мониторинга. Анализ источников литературы показал, что на сегодняшний день было предложено несколько методов детекции генов qacA/B и smr на основе ПЦР с электрофоретической детекцией результатов [9, 14, 21–23] и ПЦР-РВ с использованием интеркалирующих ДНК-красителей [18, 24], однако эти методы имеют ряд недостатков, связанных с длительностью тестирования и надёжностью результатов. Метод ПЦР с электрофоретической детекцией требует проведения гель-электрофореза, что увеличивает продолжительность анализа по сравнению с ПЦР-РВ и делает его трудоёмким и неудобным для проведения тестирования большого количества клинических изолятов. ПЦР с использованием интеркалирующих красителей позволяет проводить детекцию ампликонов в режиме реального времени, что сокращает продолжительность тестирования по сравнению с предыдущим методом, однако может давать ложноположительные результаты, поскольку интеркалирующие красители связываются со всеми двухцепочечными ДНК, включая димеры праймеров и возможные неспецифические продукты ПЦР, что требует тщательного подбора праймеров и соблюдения условий проведения ПЦР, включая используемые реактивы [25]. Нами была разработана мультиплексная ПЦР-РВ, которая лишена недостатков вышеупомянутых методов за счёт использования флуоресцентно-меченых зондов TaqMan, а также наличия внутреннего контроля амплификации.

Заключение

Разработана мультиплексная ПЦР-РВ с флуоресцентно-мечеными зондами для выявления генов qacA/B и smr грамположительных бактерий, которая отличается от существующих методов простотой и быстротой анализа, а также наличием внутреннего контроля амплификации, что позволяет исключить получение ложноотрицательных результатов тестирования. Разработанная мультиплексная ПЦР-РВ может быть использована для проведения мониторинга распространённости генов qacA/B и smr-устойчивости к КПАВ для выявления потенциально устойчивых к ним изолятов грамположительных бактерий. Однако следует учитывать, что все молекулярно-генетические тест-системы являются прогностическим инструментом и не исключают необходимости подтверждения фенотипа устойчивости микробиологическими методами.

¹ Global antiseptics and disinfectants market size, share, trends & growth forecast report — segmented by type (alcohol and aldehyde, phenols and derivatives, biguanides and amides, quaternary ammonium compounds, iodine compounds and others), end user (domestic user and institutional user) and region — industry forecast from 2024 to 2029. URL: https://www.marketdataforecast.com/market-reports/antiseptics-and-disinfectants-market (дата обращения 23.10.2024).

² Global antiseptics and disinfectants market size to exceed USD 79.25 Billion by 2033 | CAGR of 10.67%. URL: https://finance.yahoo.com/news/global-antiseptics-disinfectants-market-size-160000859.html (дата обращения 23.10.2024).

³ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

⁴ URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

⁵ URL: http://www.generunner.net

⁶ URL: https://www.thermofisher.com

⁷ URL: https://www.embl.org

⁸ URL: https://www.ddbj.nig.ac.jp