Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени для выявления генов qacA/B и smr у грамположительных бактерий

Полный текст

Введение

Распространение в последние десятилетия штаммов патогенных бактерий, устойчивых к антимикробным препаратам и дезинфицирующим веществам (ДВ), — одна из острых проблем современного здравоохранения. ДВ являются одним из наиболее эффективных средств при проведении неспецифической профилактики инфекционных заболеваний и играют ведущую роль в системе мер по профилактике инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, а также широко используются на предприятиях общественного питания, пищевой промышленности, на коммунальных объектах, в образовательных учреждениях и в быту. Однако наблюдаемый с 1950-х гг. феномен устойчивости микроорганизмов к ДВ приводит к резкому снижению эффективности дезинфекционных мероприятий [1], что связано с использованием неэффективных режимов их применения, приводящим к формированию устойчивости микроорганизмов к ДВ, а также к перекрестной устойчивости к антибиотикам в силу наличия общих механизмов действия [2, 3].

Катионные поверхностно-активные вещества (КПАВ), к которым относятся четвертичные аммониевые соединения (ЧАС), производные гуанидина и третичные амины, являются наиболее часто используемыми ДВ [4, 5]. В 2023 г. ЧАС занимали наибольшую долю ДВ на мировом рынке¹, и сохранение этой тенденции прогнозируется на ближайшие 10 лет². Согласно имеющимся данным, на российском рынке их доля составляет 50–70% [6, 7].

Основным механизмом формирования микробной резистентности к ЧАС является снижение их внутриклеточной концентрации за счёт выведения из клетки c помощью эффлюксных насосов [5, 8], которые на основе структурного сходства и особенностей функционирования объединены в 6 суперсемейств:

1. RND (Resistance-Nodulation Division);
2. SMR (Small Multidrug Resistance);
3. MATE (Multidrug And Toxic compound Extrusion);
4. MFS (Major Facilitator Superfamily);
5. ABC (ATP Binding Cassette);
6. PACE (Proteobacterial Antimicrobial Compound Efflux) [9, 10].

Устойчивость к ЧАС грамположительных бактерий в основном связана с эффлюксными насосами QacA, QacB (суперсемейство MFS), а также Smr (QacC), QacG, QacH и QacJ, относящимися к надсемейству SMR [11, 12]. Мониторинг распространённости этих эффлюксных насосов среди грамположительных бактерий с помощью молекулярногенетических методов ведётся во многих странах и показал, что наиболее часто встречаются гены qacA, qacB и smr [13–16]. При этом информация о распространении этих генов среди российских изолятов грамположительных бактерий практически отсутствует. Лишь в одной публикации были представлены данные о наличии генов qacA и qacB у изолятов стафилоккоков, выделенных из смывов с поверхностей в общественных местах Новосибирска [17]. С учётом того, что гены qacA, qacB и smr имеют преимущественно плазмидную локализацию, они могут широко распространяться посредством горизонтального переноса, приводя к формированию приобретённой устойчивости к КПАВ у грамположительных бактерий [12].

Целью исследования была разработка мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с флуоресцентно-мечеными зондами для выявления генов qacA/B и smr у грамположительных бактерий.

Материалы и методы

Бактериальные изоляты

В исследовании были использованы изоляты грамположительных бактерий видов Staphylococcus aureus (n = 12), S. haemolyticus (n = 6), Enterococcus faecium (n = 6) и E. faecalis (n = 4), Streptococcus parasanguinis (n = 1) и S. epidermidis (n = 1), полученные от медицинских учреждений Москвы. Изоляты выделены из смывов, взятых с объектов внутрибольничной среды — поверхностей аппаратов ИВЛ и УЗИ, прикроватных тумбочек, поручней кроватей. Бактерии культивировали в течение 16 ч при 37ºC в ГРМ-бульоне (ГНЦ ПМБ). Видовую принадлежность изолятов определяли с помощью масс-спектрометра «SMART MS 5020» («Zhuhai DL Biotech Co., Ltd»).

Выделение ДНК

ДНК выделяли из бактериальной культуры с помощью набора для выделения ДНК «ExtractDNA Blood & Cells» (ЗАО «Евроген») согласно рекомендациям производителя и хранили при –20ºC. Концентрацию образцов ДНК определяли с помощью спектрофотометра «NanoDrop 2000C» («ThermoFS»).

Разработка праймеров и зондов

Нуклеотидные последовательности генов эффлюксных насосов qacA, qacB, smr и 16S рРНК грамположительных бактерий были взяты из базы данных GenBank³. Их анализ проводили с помощью программы BLASTN⁴. Праймеры и зонды были разработаны на основе консервативных участков генов с использованием программ «GeneRunner v. 62.2.55 Beta»⁵ и «Multiple Primer Analyzer»⁶.

Проведение мультиплексной ПЦР-РВ

Мультиплексную ПЦР-РВ проводили в объёме 25 мкл в 96-луночных планшетах для ПЦР с использованием амплификатора «CFX96 Real-Time System» («Bio-Rad Laboratories, Inc.»). Реакционная смесь включала в себя 5× буфер и 2,5 ЕД Taq-полимеразы (ООО «НПФ Литех»), праймеры (по 0,5 мкМ каждого), зонды TaqMan (по 0,25 мкМ каждого; таблица) и образец ДНК (5 нг). Зонды TaqMan синтезированы OOO «ДНК-синтез», праймеры — ЗАО «Евроген». Профиль реакции: 95ºC — 2 мин, 95ºC — 15 с, 56ºC — 20 с (36 циклов), 72ºC — 30 с.

 

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Nucleotide sequences of the primers and probes

Гены Genes	Нуклеотидная последовательность (5’–3’) Nucleotide sequence (5’–3’)	Размер, п. н. Size, bp
qacA/B	qacA/B-D: 5'-CTGGCTTATACCTATTACCTA-3' qacA/B-R: 5'-TCCAACTAAAATTAATGCTAAAG -3' qacA/B-Pb: 5'-HEX- CGATTTGGACCGAAAATAGTGTTAC-BHQ1	197
smr	smr-F: AGTAAAACAATGCAACACCTAC-3' smr-R: ATACTATAGTTATTAGATTTATTTG-3' smr-Pb: 5'-FAM-TTAGTCTTAACAACCGTAGTCTCAAT-BHQ1	127
16S рРНК 16S rRNA	16S-D: 5'-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3' Bakt_805R: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' 16S-Pb: Cy5-5'-TGTAGCGGTGAAATGCG- BHQ2'	287

 

Определение аналитической чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ

Для оценки аналитической чувствительности метода сконструированы плазмиды pTZ57-qacA/B, pTZ57-smr и pTZ57-16S, содержащие фрагменты генов qacA/B, smr и 16S рРНК длиной 197, 127 и 287 п. н. соответственно. Клонирование проводили с использованием набора реактивов «InsTAclone PCR Cloning Kit» («ThermoFS») согласно рекомендациями производителя. Оценку концентраций плазмид проводили с помощью набора «Spectra Q BR» (ООО «Сесана») и флуориметра «Qubit» («ThermoFS»). Секвенирование полученных плазмид проводили по методу Сэнгера. Путём 10-кратных разведений получены образцы плазмид pTZ57-qacA/B, pTZ57-smr и pTZ57-16S с концентрацией 10¹–10⁶ копий в 1 мкл, которые использовались в качестве матрицы для ПЦР-РВ. Анализ результатов проводили при помощи программного обеспечения к прибору «CFX96 Real-Time System» («Bio-Rad Laboratories, Inc.»).

Апробация и валидация метода

Апробацию мультиплексной ПЦР-РВ проводили с использованием ДНК, выделенной из изолятов грамположительных бактерий (n = 30). Для оценки вариабельности значений порогового цикла ПЦР (Cq) каждый образец тестировали в 3-кратной повторности и рассчитывали средние значения Cq, стандартные отклонения (SD) и коэффициент вариабельности (Cv, %). Полученные ампликоны генов qacA/B и smr проанализированы с помощью электрофорезного разделения в 1,5% агарозном геле и секвенированы по методу Сэнгера. Для валидации мультиплексной ПЦР-РВ использовали описанные ранее методы ПЦР с электрофоретической детекцией фрагментов генов qacA/B [18] и smr [19].

Результаты

Для мультиплексной ПЦР-РВ разработаны праймеры и зонды типа TaqMan, комплементарные высококонсервативным участкам генов qacA, qacB и smr (таблица), которые были выявлены на основе множественного выравнивания всех полноразмерных нуклеотидных последовательностей этих генов, имеющихся в базах данных GenBank, EMBL⁷ и DDBJ⁸. Проанализировано 302 нуклеотидных последовательности генов qacA/B и 220 последовательностей гена smr. Анализ генов qacA и qacВ показал, что они различались 8 нуклеотидами, поэтому для них разработаны общие праймеры и зонд.

При проведении тестирования методом ПЦР важным является использование внутреннего контроля амплификации, который позволяет исключить ложноотрицательные результаты вследствие отсутствия или недостаточного для детекции количества ДНК в реакционной смеси. В качестве эндогенного внутреннего контроля амплификации в разработанной мультиплексной ПЦР-РВ использован ген 16S рРНК. Праймер 16S-D и зонд были разработаны на основе анализа 5000 последовательностей 16S рРНК (таблица). В качестве обратного праймера использовали универсальный праймер Bakt_805R, разработанный ранее [20].

C помощью разработанных нами праймеров проведён поиск изолятов грамположительных бактерий (n = 30), содержащих гены qacA/B и smr. Полученные ампликоны были проанализированы с помощью электрофорезного разделения в 1,5% агарозном геле. Длины ампликонов генов qacA/B и smr соответствовали ожидаемым (таблица; рис. 1). Специфичность праймеров была подтверждена секвенированием ампликонов по методу Сэнгера.

 

Рис. 1. Результаты амплификации фрагментов генов qacA/B и smr.

1–9 — qacA/B-позитивные изоляты; 10–12 — smr-позитивные изоляты. К– — отрицательный контроль. M — маркер длин ДНК.

Fig. 1. Results of the amplification of qacA/B and smr genes.

1–9 — qacA/B-positive isolates; 10–12 — smr-positive isolates. K– — negative control. M — DNA length marker.

 

Для оценки аналитической чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ сконструированы плазмиды pTZ57-qacA/B, pTZ57-smr и pTZ57-16S, содержащие полученные ампликоны генов qacA/B, smr и 16S рРНК. С помощью 10-кратных разведений получены их образцы с концентрацией от 10¹ до 10⁶ копий в 1 мкл, которые использовались в качестве матрицы для разработанной мультиплексной ПЦР-РВ. Чувствительность мультиплексной ПЦР-РВ составила 10³ копий для всех генов. Эффективность амплификации генов qacA/B, smr и 16S рРНК при составила 95,1, 91,3 и 101,8% соответственно (рис. 2).

 

Рис. 2. Результаты определения чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ для выявления генов qacA/B и smr у грамположительных бактерий.

Fig. 2. Results of multiplex PCR sensitivity evaluation for detection of qacA/B and smr genes in gram-positive bacteria.

 

Апробацию разработанной мультиплексной ПЦР-РВ проводили с использованием 30 клинических изолятов грамположительных бактерий, полученных от медицинских учреждений Москвы. Тестирование проводили в 3 повторах. Выявлено, что 30% изолятов (6 изолятов S. haemolyticus и по 1 изоляту E. faecium, E. faecalis и S. parasanguinis) имели гены qacA/B и 10% изолятов (2 изолята S. haemolyticus и изолят S. epidermidis) содержали ген smr. У 2 изолятов S. haemolyticus были найдены и qacA/B, и smr. Воспроизводимость результатов тестирования для всех образцов составила 100%, коэффициент вариабельности значений Cq — от 3,4 до 6,2%. Результаты мультиплексной ПЦР-РВ полностью совпали как с данными моноплекных ПЦР с электрофорезной детекцией, так и с результатами секвенирования ампликонов по методу Сэнгера. В качестве альтернативного метода сравнения для разработанной нами мультиплексной ПЦР-РВ использованы методы ПЦР с электрофоретической детекцией генов qacA/B и smr, предложенные ранее K.H. Lin и соавт. [18] и N. Noguchi и соавт. [19] соответственно. Результаты, полученные с помощью этих методов, также полностью совпали. Таким образом, специфичность разработанной нами мультиплексной ПЦР-РВ с флуоресцентно-мечеными зондами составила 100%.

Обсуждение

Выявление генов резистентности методами ПЦР является широко распространенным и доступным методом их мониторинга. Анализ источников литературы показал, что на сегодняшний день было предложено несколько методов детекции генов qacA/B и smr на основе ПЦР с электрофоретической детекцией результатов [9, 14, 21–23] и ПЦР-РВ с использованием интеркалирующих ДНК-красителей [18, 24], однако эти методы имеют ряд недостатков, связанных с длительностью тестирования и надёжностью результатов. Метод ПЦР с электрофоретической детекцией требует проведения гель-электрофореза, что увеличивает продолжительность анализа по сравнению с ПЦР-РВ и делает его трудоёмким и неудобным для проведения тестирования большого количества клинических изолятов. ПЦР с использованием интеркалирующих красителей позволяет проводить детекцию ампликонов в режиме реального времени, что сокращает продолжительность тестирования по сравнению с предыдущим методом, однако может давать ложноположительные результаты, поскольку интеркалирующие красители связываются со всеми двухцепочечными ДНК, включая димеры праймеров и возможные неспецифические продукты ПЦР, что требует тщательного подбора праймеров и соблюдения условий проведения ПЦР, включая используемые реактивы [25]. Нами была разработана мультиплексная ПЦР-РВ, которая лишена недостатков вышеупомянутых методов за счёт использования флуоресцентно-меченых зондов TaqMan, а также наличия внутреннего контроля амплификации.

Заключение

Разработана мультиплексная ПЦР-РВ с флуоресцентно-мечеными зондами для выявления генов qacA/B и smr грамположительных бактерий, которая отличается от существующих методов простотой и быстротой анализа, а также наличием внутреннего контроля амплификации, что позволяет исключить получение ложноотрицательных результатов тестирования. Разработанная мультиплексная ПЦР-РВ может быть использована для проведения мониторинга распространённости генов qacA/B и smr-устойчивости к КПАВ для выявления потенциально устойчивых к ним изолятов грамположительных бактерий. Однако следует учитывать, что все молекулярно-генетические тест-системы являются прогностическим инструментом и не исключают необходимости подтверждения фенотипа устойчивости микробиологическими методами.

 

¹ Global antiseptics and disinfectants market size, share, trends & growth forecast report — segmented by type (alcohol and aldehyde, phenols and derivatives, biguanides and amides, quaternary ammonium compounds, iodine compounds and others), end user (domestic user and institutional user) and region — industry forecast from 2024 to 2029. URL: https://www.marketdataforecast.com/market-reports/antiseptics-and-disinfectants-market (дата обращения 23.10.2024).

² Global antiseptics and disinfectants market size to exceed USD 79.25 Billion by 2033 | CAGR of 10.67%. URL: https://finance.yahoo.com/news/global-antiseptics-disinfectants-market-size-160000859.html (дата обращения 23.10.2024).

³ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

⁴ URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

⁵ URL: http://www.generunner.net

⁶ URL: https://www.thermofisher.com

⁷ URL: https://www.embl.org

⁸ URL: https://www.ddbj.nig.ac.jp

Об авторах

Светлана Николаевна Ковальчук

Институт системной биологии и медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: s.n.kovalchuk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5029-0750

к. б. н., с. н. с. лаб. преодоления микробной резистентности

Россия, Москва

Анна Леонидовна Архипова

Институт системной биологии и медицины

Email: s.n.kovalchuk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8835-6671

м. н. с. лаб. преодоления микробной резистентности

Россия, Москва

Светлана Юрьевна Ковылкова

Институт системной биологии и медицины

Email: s.n.kovalchuk@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-5668-7622

специалист лаб. преодоления микробной резистентности

Россия, Москва

Елена Николаевна Ильина

Институт системной биологии и медицины

Email: s.n.kovalchuk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0130-5079

д. б. н., профессор РАН, член-корреспондент РАН, г.н.с., зав. лаб. математической биологии и биоинформатики

Россия, Москва

Людмила Самуиловна Федорова

Институт системной биологии и медицины

Email: s.n.kovalchuk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2663-0273

д. м. н., профессор, зав. лаб. преодоления микробной резистентности

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы