Enhancement of systemic and lung-localized CD4 +  T-cell immune responses by truncation of NS1 protein of a seasonal live influenza vaccine strain

Polina I. Prokopenko; Прокопенко Полина Игоревна; Ekaterina A. Stepanova; Степанова Екатерина Алексеевна; Victoria A. Matyushenko; Матюшенко Виктория Аркадьевна; Alexandra Ya. Rak; Рак Александра Яковлевна; Anna K. Chistyakova; Чистякова Анна Константиновна; Arina D. Kostromitina; Костромитина Арина Дмитриевна; Tatyana S. Kotomina; Котомина Татьяна Сергеевна; Igor V. Kudryavtsev; Кудрявцев Игорь Владимирович; Artem A. Rubinstein; Рубинштейн Артем Аркадьевич; Alexey S. Komlev; Комлев Алексей Сергеевич; Larisa G. Rudenko; Руденко Лариса Георгиевна; Irina N. Isakova-Sivak; Исакова-Сивак Ирина Николаевна

doi:10.36233/0372-9311-582

Enhancement of systemic and lung-localized CD4⁺ T-cell immune responses by truncation of NS1 protein of a seasonal live influenza vaccine strain

Authors: Prokopenko P.I.¹, Stepanova E.A.¹, Matyushenko V.A.¹, Rak A.Y.¹, Chistyakova A.K.¹, Kostromitina A.D.¹, Kotomina T.S.¹, Kudryavtsev I.V.¹, Rubinstein A.A.¹, Komlev A.S.¹, Rudenko L.G.¹, Isakova-Sivak I.N.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
Issue: Vol 101, No 5 (2024)
Pages: 619-627
Section: ORIGINAL RESEARCHES
Submitted: 15.11.2024
Accepted: 15.11.2024
Published: 18.11.2024
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18682
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-582
EDN: https://elibrary.ru/rwupfs
ID: 18682

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. There is a large variety of licensed influenza vaccines worldwide, but their common limitation is rather narrow specificity and inability to protect against antigenic-drift variants of influenza virus. Therefore, optimization of immunogenic and cross-protective properties of licensed influenza vaccines is an urgent priority of public health agenda. One such approach is to modulate the immunogenic properties of live attenuated influenza vaccine (LAIV) by truncating the open reading frame of influenza virus non-structural protein 1 (NS1). The main objective of this study is to evaluate the immunogenic properties of the H1N1 seasonal LAIV strain by truncation of the NS1 protein to 126 amino acides.

Materials and methods. Using reverse genetics technique, two H1N1 LAIV strains with full-length and truncated NS1 protein with three consecutive stop codons added after the 126^th amino acid residue were obtained.C57BL/6J mice were immunized intranasally with the vaccine candidates, twice at a three-week interval. Seven days after the second immunization, cells were isolated from spleen and lung tissues and stimulated with whole wild-type H1N1 influenza virus. Levels of systemic and tissue-resident cytokine-producing CD4⁺ and CD8⁺ memory T cells were assessed by intracellular cytokine staining assay with flow cytometry. Replication of engineered vaccine strains in in vitro and in vivo systems was also evaluated.

Results. Truncation of NS1 protein of the LAIV strain significantly increased the levels of virus-specific CD4⁺ effector memory T cells in spleens and the levels of CD4⁺ tissue-resident memory T cells in lungs of mice after two-dose immunization, indicating a higher potential for protection against influenza infection of the LAIV NS₁₂₆ vaccine strain compared to the classical variant of LAIV. Importantly, the LAIV NS₁₂₆ strain also had a more pronounced attenuated phenotype in mice than its classical counterpart.

Keywords

influenza virus, live attenuated influenza vaccine, NS1 protein, memory T cells, tissue-resident memory T cells, tissue-resident memory T cells, CD4⁺ Т cells, CD8⁺ Т cells

Full Text

Введение

Вирусы гриппа представляют собой постоянную угрозу мировому сообществу ввиду их высокой контагиозности и способности вызывать тяжёлые эпидемии, ежегодно уносящие до 650 тыс. человеческих жизней [1]. Наиболее эффективным средством борьбы с гриппозной инфекцией остаётся вакцинация, которая направлена в основном на предотвращение развития тяжёлых случаев заболевания, а также его осложнений. Существует достаточно большое разнообразие лицензированных вакцин против гриппа, но их эффективность в различные эпидемические сезоны сильно варьируется ввиду узкой специфичности индуцируемого иммунного ответа на вакцинацию [2]. В этой связи поиск новых подходов к повышению иммуногенности и расширению спектра действия сезонных гриппозных вакцин имеет первостепенное значение для мирового здравоохранения.

Неструктурный белок 1 (NS1) вируса гриппа А многофункциональный и участвует в различных стадиях взаимодействия вируса с клеткой: он является антагонистом противовирусного клеточного ответа и регулятором экспрессии вирусных и клеточных генов [3, 4]. В частности, белок NS1 вируса гриппа выполняет функцию антагониста интерферона (ИФН) и тем самым способствует развитию продуктивной инфекции, нарушая одно из важнейших звеньев противовирусного иммунитета [5]. Кроме того, С-концу белка NS1 приписывают функцию снижения активации дендритных клеток и, следовательно, нарушения стимуляции наивных Т-клеток [6]. Соответственно, иммуногенность живой гриппозной вакцины (ЖГВ) может быть усилена за счёт усечения белка NS1 с С-конца с целью ослабления его анти-ИФН-активности. Ранее нами был сконструирован вакцинный штамм ЖГВ подтипа H7N9, который кодировал укороченный до 126 аминокислот белок NS1. Эксперименты на мышах показали, что такая модификация приводила к существенному усилению Т-клеточного ответа к иммунодоминантному эпитопу NP₃₆₆ по сравнению с иммунизацией ЖГВ с полноразмерным NS1 [7].

Целью настоящего исследования явилась оценка модуляции иммуногенных свойств вакцинного штамма сезонной ЖГВ подтипа H1N1 при усечении рамки считывания белка NS1 до 126 аминокислот. При этом изучался системный и локальный Т-клеточный ответ ко всем антигенам вируса гриппа путём стимуляции иммунных клеток цельным живым эпидемическим вирусом гриппа H1N1.

Материалы и методы

Вирусы

Экспериментальные реассортантные штаммы подтипа H1N1 получены стандартными методами обратной генетики на основе донора аттенуации отечественной ЖГВ A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Лен/17) [8]. В качестве родительского эпидемического вируса гриппа выступал штамм A/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1) [H1N1/wt], полученный из коллекции NIBSC (Великобритания). Вакцинный штамм ЖГВ H1N1 c полноразмерным белком NS1 содержал гены PB2, PB1, PA, NP, M и NS от донора аттенуации Лен/17, а гены гемагглютинина и нейраминидазы — от эпидемического вируса H1N1/wt. Для получения рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего усечённый белок NS1, после 126 аминокислот открытой рамки считывания белка NS1 вируса Len/17 добавлены 3 последовательных стоп-кодона с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием набора «Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit» («New England Biolabs») и специфических праймеров («Evrogen Ltd.»). Вирусы культивировали в 10–11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) (птицефабрика «Синявинская») при 33ºС (для вакцинных штаммов ЖГВ) или при 37ºС (для эпидемического штамма H1N1/wt) и хранили при –70ºC в аликвотах.

Клеточные линии

Клетки почки собаки MDCK (ATCC CCL-34) и клетки почки зелёной мартышки Vero (ATCC CCL-81) культивировали в ростовой среде DMEM с содержанием 10% эмбриональной бычьей сыворотки и добавлением антибиотика-антимикотика (перечисленные реагенты — «Capricorn»).

Определение инфекционной активности вирусов гриппа

Инфекционные титры вирусов определяли методом предельных разведений. Для заражения РКЭ вирусы разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и каждым разведением заражали 4–6 эмбрионов в объёме 200 мкл. РКЭ инкубировали при 33ºС и 38ºС в течение 48 ч или при 26ºС в течение 6 сут, после чего эмбрионы охлаждали; наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли в реакции гемагглютинации с куриными эритроцитами. Определение инфекционных титров вирусов на клеточных культурах проводили путём заражения суточной монослойной культуры в формате 96-луночных планшетов серийными 10-кратными разведениями вирусов. После адсорбции инокулят удаляли, клетки промывали, инкубировали в среде DMEM с содержанием 1 мкг/мл трипсина ТРСК и антибиотика-антимикотика при 33ºС в течение 4 сут. Наличие вирусов в лунках определяли путём окрашивания зафиксированных в ацетоне клеток моноклональным анти-NP-антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (ООО «ППДП»). Проявку осуществляли с помощью субстрата ТМБ («Thermo Fisher Scientific»), и оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре «xMark» («BioRad»). Лунки считали положительными при значениях оптической плотности (λ = 450 нм), превышающих значения отрицательных контрольных лунок минимум в 2 раза. Титры вирусов в РКЭ и клетках Vero и MDCK рассчитывали по методу L.J. Reed и соавт. [9] и выражали в 50% инфекционных дозах (lg ЭИД₅₀/мл и lg ТЦИД₅₀/мл).

Накопление и очистка вируса гриппа на градиенте сахарозы

Для проведения иммунологических тестов вирус гриппа H1N1/wt очищали на градиенте сахарозы для удаления неспецифических белков куриных эмбрионов и для концентрирования вируса. Очистку вирусов проводили на 30%/60% градиенте плотности c использованием ультрацентрифуги («BeckmanCoulter») в несколько этапов:

осветление собранной аллантоисной жидкости путём центрифугирования в течение 15 мин при 4ºС при 3500g;
осаждение при 16 000g в течение 2 ч при 4ºС и ресуспендирование образованного осадка в 2 мл ФСБ;
наслаивание ресуспендированного осадка на 30%/60% ступенчатый градиент сахарозы с последующим ультрацентрифугированием в течение 2 ч и при 4ºС при 23 000g;
сбор концентрированного вируса на границах градиента и его отмывка в 10 мл ФСБ путём центрифугирования в течение 1,5 ч при 23 000g. На последнем этапе вирусный осадок ресуспендировали в 1 мл ФСБ и хранили при –70ºС в аликвотах.

Иммунизация мышей и сбор органов

В работе использовали самок мышей линии C57Bl/6J, поставляемых из питомника «Филиал Столбовая» НЦБМТ ФМБА России. Мышей иммунизировали двукратно интраназально с интервалом в 21 день одним из рекомбинантных штаммов ЖГВ в дозе 10⁶ ЭИД₅₀ в объёме 50 мкл с использованием лёгкого эфирного наркоза. Контрольные животные получали равный объём ФСБ. На 3-и сутки у 4 вакцинированных мышей из каждой группы осуществляли забор лёгких и носовых ходов, которые в дальнейшем гомогенизировали с использованием автоматического гомогенизатора «TissueLyser LT» («Qiagen»). Гомогенаты лёгочной и носовой ткани использовали для определения инфекционного титра вируса в системе РКЭ. Через 7 сут после повторной иммунизации у 6 мышей из каждой группы собирали лёгочную ткань и селезёнки для дальнейшей оценки Т-клеточного иммунитета.Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 1/20 от 27.02.2020).

Оценка Т-клеточного иммунного ответа

Определение системных и локализованных в лёгких Т-клеток памяти проводили по ранее описанному методу [7] с небольшими модификациями. Одиночные спленоциты выделяли в среде CR-0 (RPMI-1640 с добавлением антибиотика-антимикотика, 25 мМ HEPES (перечисленные реагенты от «Capricorn») и 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом («Sigma-Aldrich»), используя фильтры с размером пор 70 мкм («BD Biosciences»). Затем эритроциты лизировали с помощью буфера для лизиса эритроцитов («BioLegend»). Для внутриклеточного окрашивания цитокинов 2 × 10⁶ клеток добавляли в стерильные микропланшеты с U-образным дном в 100 мкл среды CR-10 (среда CR-0, содержащая 10% эмбриональной бычьей сыворотки). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл среды CR-10, содержащей очищенный цельный вирус H1N1/wt в дозе 2 инфекционные единицы на клетку, и инкубировали в течение 18 ч при 37ºС, 5% СО₂. Затем к пробам добавляли раствор GolgiPlug («BD Biosciences») в конечной концентрации 1 : 1000 для остановки белкового транспорта. Стимуляцию форболмиристил ацетатом («Sigma-Aldrich») использовали в качестве положительного контроля; также были приготовлены нестимулированные контрольные образцы и образцы изотипического контроля. Клетки инкубировали в течение 5 ч при 37ºC, 5% CO₂, затем окрашивали в течение 20 мин при 4ºC в темноте с помощью флуоресцентного красителя для выявления живых/мёртвых клеток ZombieAqua и смесью следующих флуоресцентно меченных поверхностных антител: CD4-PerCP/Cy5.5, CD8-APC/Cy7, CD44-PE, и CD62L-BV421 (перечисленные реагенты — «BioLegend»). Набор «Cytofix/Cytoperm» («BD Biosciences») использовали для фиксации/пермеабилизации, после чего клетки окрашивали антителами к цитокинам: ИФН-γ — FITC, фактору некроза опухоли-α (ФНО-α) — APC, интерлейкину-2 (ИЛ-2) — PE/Cy7 в течение 20 мин при 4ºC в темноте. Образцы фиксировали буфером Cyto-Last (антитела и буфер — «BioLegend») и анализировали с помощью цитофлуориметра «Navios» («BeckmanCoulter»).

Для обнаружения тканерезидентных Т-клеток памяти (T_RM) перфузированные раствором ФСБ лёгкие разрезали на мелкие кусочки стерильными ножницами и обрабатывали смесью ДНКазы I и коллагеназы («Sigma-Aldrich») в течение 40 мин при 37ºC. Затем готовили суспензию отдельных клеток с помощью фильтров с размером пор 70 мкм. Эритроциты лизировали, как описано выше, и стимулировали цельным вирусом H1N1/wt с последующим выявлением вирусспецифических Т-клеток эффекторной памяти (T_ЕM; CD44⁺CD62L^–), экспрессирующих маркеры тканерезидентности (CD69⁺CD103⁺). Набор для окраски поверхностных маркеров и внутриклеточных цитокинов включал: CD4 — PerCP/Cy5.5, CD8 — APC/Cy7, CD44 — APC, CD62L — BV421, CD69 — PE/Cy7, CD103 — FITC, в то время как внутриклеточную окраску проводили только на один цитокин — ИФН-γ — PE/Dazzle (перечисленные реагенты — «BioLegend»). Подсчитывали количество цитокин-позитивных клеток в стимулированных группах и вычитали уровень спонтанной секреции цитокинов в нестимулированных контрольных образцах.

Статистическая обработка результатов

Данные проточной цитометрии проанализированы в программе «Kaluza Analysis» («BeckmanCoulter»). Статистический анализ и подготовку иллюстраций проводили с помощью программы «GraphPad Prism v. 7.0». Для сравнения данных использовали дисперсионный анализ ANOVA с поправкой Тьюки или U-критерий Манна–Уитни; различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты

В настоящем исследовании генно-инженерными методами получен штамм сезонной ЖГВ подтипа H1N1, экспрессирующий усечённый до 126 аминокислот неструктурный белок 1 (ЖГВ H1N1 NS1₁₂₆). В экспериментах in vitro было показано, что классический вакцинный штамм ЖГВ H1N1 и модифицированный вариант ЖГВ H1N1 NS1₁₂₆ обладали сходными ростовыми характеристиками в различных системах культивирования, однако вариант с NS1₁₂₆ достоверно более слабо размножался при пониженной до 26ºС температуре (таблица). Эти результаты согласуются с полученными ранее данными о фенотипических характеристиках вакцинных штаммов ЖГВ с NS1₁₂₆ [7, 10]. Кроме того, модифицированный штамм практически не размножался в верхних дыхательных путях мышей, в отличие от классического штамма ЖГВ, что также согласуется с полученными ранее данными об усилении аттенуирующих свойств вакцины при укорочении рамки считывания белка NS1.

Репликативные свойства вакцинных штаммов ЖГВ в системах in vitro и in vivo

Replicative properties of LAIV vaccine strains in vitro and in vivo systems

Вакцинный штамм Vaccine strain	Титр вируса в РКЭ, lg ЭИД₅₀/мл Virus titer in ECE, lg EID₅₀/ml			Титр вируса в клетках, lg ТЦИД₅₀/мл Virus titer in cells, lg TCID₅₀/ml		Титр вируса в органах мышей, lg ЭИД₅₀/мл Virus titer in mouse organs, lg EID₅₀/ml
Вакцинный штамм Vaccine strain	26ºC	33ºC	38ºC	MDCK	Vero	лёгкие \| lungs	нос \| nose
ЖГВ H1N1 LAIV H1N1	5,8 ± 0,4	8,7 ± 0,3	1,9 ± 0,4	7,2 ± 0,3	6,2 ± 0,2	˂ 1,2	2,3 ± 1,2
ЖГВ H1N1 NS1₁₂₆ LAIV H1N1 NS1₁₂₆	4,4 ± 0,7	7,6 ± 0,5	˂ 1,2	5,8 ± 0,8	5,4 ± 0,4	˂ 1,2	˂ 1,2

Двукратная иммунизация мышей ЖГВ и ЖГВ NS1₁₂₆ стимулировала индукцию высоких уровней вирус-специфических Т_ЕМ с фенотипом CD44⁺CD62L^– в селезёнках мышей, причём укорочение белка NS1 в вакцинном штамме ЖГВ значительно повышало уровни полифункциональных CD4⁺-Т_ЕМ-клеток, секретирующих одновременно 2 (ИФН-γ, ФНО-α) или 3 (ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-2) цитокина (рис. 1, а). Кроме того, только в группе мышей, получивших ЖГВ NS1₁₂₆, обнаруживались достоверно более высокие уровни ИФН-γ-продуцирующих цитотоксических Т-клеток памяти по сравнению с контролем (рис. 1, б). Таким образом, полученные данные указывают на то, что модифицированный штамм ЖГВ NS1₁₂₆ может обладать более высоким потенциалом защиты от гриппозной инфекции, чем классический вариант ЖГВ.

Рис. 1. Количество Т_ЕМ-клеток (CD44⁺CD62L^–) с фенотипом CD4⁺ (а) и CD8⁺ (б), экспрессирующих ИФН-γ (I), ИФН-γ и TNFα (II) и IFNγ, TNFα и IL-2 (III), в группах мышей, иммунизированных ЖГВ или ЖГВ с укороченным NS1 белком, а также в контрольной группе (ФСБ).

*p < 0,05, **p < 0,01 (критерий Манна–Уитни).

Fig. 1. Number of effector memory T cells (CD44⁺CD62L^–) with CD4⁺ (a) and CD8⁺ (b) phenotype expressing IFNγ (left panel), IFNγ and TNFα (middle panel) and IFNγ, TNFα and IL-2 (right panel) in groups of mice immunized with LAIV or LAIV with truncated NS1 protein, as well as in the control group (PBS).

Significant differences between groups (Mann–Whitney test), *p < 0.05, **p < 0.01.

Далее проведено исследование субпопуляций вирус-специфических Т_ЕМ-клеток в лёгких с оценкой экспрессии этими клетками поверхностных маркеров Т_RM-клеток памяти. Оценка уровней ИФН-γ-продуцирующих Т_ЕМ-клеток в лёгких иммунизированных мышей выявила достоверное усиление CD4⁺-Т-клеточного ответа в группе животных, привитых прототипом ЖГВ NS1₁₂₆, по сравнению с классическим вариантом вакцины (рис. 2, а). Для цитотоксических CD8⁺-Т_ЕМ-клеток в лёгких был показан сопоставимый уровень иммуногенности ЖГВ, не зависящий от модификации белка NS1 (рис. 2, г). При этом уровень экспрессии маркеров тканерезидентности был сопоставим в обеих вакцинных группах (рис. 2, б, в, д, е), что свидетельствует о локализации выявленных вирус-специфических клеток в эпителии лёгких, в непосредственной близости от потенциального места проникновения патогена.

Рис. 2. Индукция вирусспецифических Т-клеток памяти в ткани лёгких при иммунизации мышей исследуемыми вакцинными вирусами.

а, г — количество ИФН-γ-продуцирующих Т_ЕМ-клеток (CD44⁺CD62L^–) с фенотипом CD4⁺- (а) и CD8⁺-клеток (г) в группах мышей, иммунизированных ЖГВ или ЖГВ NS₁₂₆, а также в контрольной группе; б, д — уровень вирусспецифических тканерезидентных клеток памяти с фенотипом CD69⁺CD103^– среди ИФН-γ⁺-клеток в популяциях CD4⁺- (б) и CD8⁺-Т-клеток (д); в, е — количество вирусспецифических тканерезидентных клеток памяти с фенотипом CD69⁺CD103⁺ среди ИФН-γ⁺-клеток в популяциях CD4⁺- (в) и CD8⁺-Т-клеток (е).

*p < 0,05, **p < 0,01 (критерий Манна–Уитни).

Fig. 2. Induction of virus-specific memory T cells in the lungs after immunization of mice with the study vaccine viruses.

(a, d) Number of IFNγ-producing effector memory T cells (CD44⁺CD62L^–) with CD4+ (a) and CD8⁺ (d) cell phenotype in groups of mice immunized with LAIV or LAIV with truncated NS₁₂₆, as well as in controls. Proportion of virus-specific tissue-resident memory cells with CD69⁺CD103^– phenotype among IFNγ⁺ cells in CD4⁺ and CD8⁺ T cell populations (b and f, respectively). Proportion of virus-specific tissue-resident memory cells with CD69⁺CD103⁺ phenotype among IFNγ⁺ cells in CD4⁺ and CD8⁺ T cell populations (c and f, respectively).

* p < 0.05, ** p < 0.01 between groups (Mann–Whitney test).

Обсуждение

Существующие противогриппозные вакцины индуцируют преимущественно нейтрализующие антитела, нацеленные на гипервариабельные эпитопы основного антигена вируса гриппа — молекулы гемагглютинина, из-за чего требуется практически ежегодное обновление штаммового состава вакцин. За последнее десятилетие достигнут существенный прогресс в разработке противогриппозных вакцин более широкого защитного спектра, нацеленных на консервативные вирусные антигены, такие как домен стебля гемагглютинина, нейраминидаза или M2e; а также разработаны подходы на основе Т-клеток, которые обладают наибольшим потенциалом вызывать долговременные перекрёстные защитные реакции клеток памяти [11]. К настоящему времени накоплен большой массив данных о способности вирусов гриппа, экспрессирующих усечённый белок NS1, стимулировать образование более выраженного адаптивного иммунного ответа, одновременно делая вирус более аттенуированным [12–15]. Однако в подавляющем большинстве исследований использовался модельный лабораторный штамм A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) или штамм, созданный на основе вируса гриппа дикого типа, что имеет существенный недостаток — вероятность возврата к вирулентному фенотипу в случае возможной реассортации с другими циркулирующими вирусами. В нашем исследовании в качестве основы использован штамм отечественной лицензированной живой гриппозной вакцины, широко применяемой в практике здравоохранения в России и в ряде зарубежных стран [16].

Ранее нами было показано, что усечение до 126 аминокислот белка NS1 вакцинного штамма ЖГВ H7N9 приводит к усилению гуморального и Т-клеточного ответа в эксперименте на мышах [7]. В отличие от указанного исследования, где Т-клеточный иммунный ответ оценивался путём стимуляции клеток синтетическими пептидами, соответствующими иммунодоминантным CD8⁺-T-клеточным эпитопам NP₃₆₆, в настоящей работе проводили стимуляцию иммунных клеток вакцинированных мышей цельным очищенным вирусом гриппа H1N1/wt. Такая стимуляция лучше отражает реальную клиническую ситуацию, поскольку при гриппе организм сталкивается с циркулирующим вирусом в его естественном виде и инфицированные клетки презентируют на комплексах MHC-I и MHC-II большое разнообразие Т-клеточных вирусных эпитопов.

В настоящем исследовании продемонстрировано усиление CD4⁺-Т-клеточного ответа у мышей при их иммунизации штаммом живой гриппозной вакцины с модифицированным белком NS1, причём данный эффект был выражен как на системном (спленоциты), так и на локальном уровне (клетки из тканей лёгких). При этом системные вирусспецифические CD4⁺-Т-клетки характеризовались полифункциональным фенотипом, продуцируя, помимо ИФН-γ, и другие ключевые провоспалительные цитокины, участвующие в противовирусном ответе, такие как ФНО-α и ИЛ-2. Известно, что Т-лимфоциты, способные секретировать одновременно несколько цитокинов в ответ на антигенную стимуляцию, являются более точными предикторами способности организма противостоять реинфекции, чем монофункциональные клетки с секрецией только ИФН-γ [17]. Для системных CD8⁺-Т_ЕМ-клеток не было выявлено значимого увеличения пропорции цитокинпродуцирующих Т-клеток при укорочении белка NS1, вероятно, из-за небольшого количества животных в группе и высокой дисперсии. Эти данные в целом согласуются с полученными ранее результатами для вакцинного штамма H7N9, экспрессирующего укороченный вариант белка NS1, где CD8⁺-Т-клеточный ответ оценивали после стимуляции спленоцитов пептидом, соответствующим иммунодоминантному эпитопу NP₃₆₆ [7]. Важно отметить, что более выраженный Т-клеточный ответ, формирующийся непосредственно в тканях лёгких мышей, иммунизированных вакцинным штаммом ЖГВ с NS1₁₂₆, указывает на потенциал развития ускоренного иммунного ответа при последующем контакте с патогеном, поскольку Т_RM-клетки в лёгких представляют собой первую линию иммунной защиты организма от респираторных патогенов [18, 19].

Заключение

В настоящей работе приведены свидетельства усиления системного и локализованного в лёгких CD4⁺-Т-клеточного иммунного ответа при укорочении белка NS1 штамма сезонной ЖГВ. Поскольку вирусспецифические Т-клетки выявлялись при стимуляции лимфоцитов цельным живым вирусом H1N1/wt, можно предположить, что при повторном инфицировании современным циркулирующим вирулентным вирусом данного подтипа иммунизированные вариантом ЖГВ H1N1 NS1₁₂₆ мыши будут лучше защищены от клинических проявлений заболевания, чем животные, получившие классический вариант ЖГВ.