Enhancement of systemic and lung-localized CD4 +  T-cell immune responses by truncation of NS1 protein of a seasonal live influenza vaccine strain

Polina I. Prokopenko; Прокопенко Полина Игоревна; Ekaterina A. Stepanova; Степанова Екатерина Алексеевна; Victoria A. Matyushenko; Матюшенко Виктория Аркадьевна; Alexandra Ya. Rak; Рак Александра Яковлевна; Anna K. Chistyakova; Чистякова Анна Константиновна; Arina D. Kostromitina; Костромитина Арина Дмитриевна; Tatyana S. Kotomina; Котомина Татьяна Сергеевна; Igor V. Kudryavtsev; Кудрявцев Игорь Владимирович; Artem A. Rubinstein; Рубинштейн Артем Аркадьевич; Alexey S. Komlev; Комлев Алексей Сергеевич; Larisa G. Rudenko; Руденко Лариса Георгиевна; Irina N. Isakova-Sivak; Исакова-Сивак Ирина Николаевна

doi:10.36233/0372-9311-582

Усиление системного и локализованного в лёгких CD4⁺-Т-клеточного иммунного ответа при укорочении белка NS1 штамма сезонной живой гриппозной вакцины

Авторы: Прокопенко П.И.¹, Степанова Е.А.¹, Матюшенко В.А.¹, Рак А.Я.¹, Чистякова А.К.¹, Костромитина А.Д.¹, Котомина Т.С.¹, Кудрявцев И.В.¹, Рубинштейн А.А.¹, Комлев А.С.¹, Руденко Л.Г.¹, Исакова-Сивак И.Н.¹
Учреждения:
1. Институт экспериментальной медицины
Выпуск: Том 101, № 5 (2024)
Страницы: 619-627
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 15.11.2024
Дата принятия к публикации: 15.11.2024
Дата публикации: 18.11.2024
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18682
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-582
EDN: https://elibrary.ru/rwupfs
ID: 18682

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. В мире существует большое разнообразие лицензированных вакцин против гриппа, но их общими недостатками являются достаточно узкая специфичность и неспособность защищать от дрейфовых вариантов вируса. Соответственно, оптимизация иммуногенных и кросс-протективных свойств лицензированных гриппозных вакцин — актуальная задача практического здравоохранения. Одним из таких подходов является модуляция иммуногенных свойств живой гриппозной вакцины (ЖГВ) за счёт усечения рамки считывания неструктурного белка 1 вируса гриппа (NS1). Основной целью данной работы является оценка иммуногенных свойств сезонной ЖГВ подтипа H1N1 при усечении рамки считывания белка NS1 до 126 аминокислот.

Материалы и методы. Методами обратной генетики сконструированы 2 штамма ЖГВ подтипа H1N1 с полноразмерным и с усечённым белком NS1, где после 126 аминокислот добавлены 3 последовательных стоп-кодона. Мышей линии C57Bl/6J иммунизировали интраназально двукратно с 3-недельным интервалом. Через 7 дней после повторной иммунизации у мышей выделяли клетки из тканей селезёнки и лёгких, стимулировали цельным диким вирусом H1N1 и оценивали уровни системных и тканерезидентных цитокинпродуцирующих CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток памяти методом внутриклеточного окрашивания цитокинов. Также была проведена оценка репродукции штаммов в системах in vitro и in vivo.

Результаты. Укорочение белка NS1 в ЖГВ значительно повышало уровни вирусспецифических CD4⁺-Т-клеток эффекторной памяти в селезёнке и уровни тканерезидентных CD4⁺-Т-клеток в лёгких мышей после двукратной иммунизации, что указывает на более высокий потенциал защиты от гриппозной инфекции у ЖГВ с усечённым белком NS1 по сравнению с классическим вариантом ЖГВ. Важно отметить, что ЖГВ с усечённым белком NS1 также имела более выраженный аттенуированный фенотип в эксперименте на мышах, чем её классический аналог.

Ключевые слова

вирус гриппа, живая гриппозная вакцина, белок NS1, T-клетки памяти, Т-клетки эффекторной памяти, тканерезидентные T-клетки, CD4⁺-Т-клетки, CD8⁺-Т-клетки

Полный текст

Введение

Вирусы гриппа представляют собой постоянную угрозу мировому сообществу ввиду их высокой контагиозности и способности вызывать тяжёлые эпидемии, ежегодно уносящие до 650 тыс. человеческих жизней [1]. Наиболее эффективным средством борьбы с гриппозной инфекцией остаётся вакцинация, которая направлена в основном на предотвращение развития тяжёлых случаев заболевания, а также его осложнений. Существует достаточно большое разнообразие лицензированных вакцин против гриппа, но их эффективность в различные эпидемические сезоны сильно варьируется ввиду узкой специфичности индуцируемого иммунного ответа на вакцинацию [2]. В этой связи поиск новых подходов к повышению иммуногенности и расширению спектра действия сезонных гриппозных вакцин имеет первостепенное значение для мирового здравоохранения.

Неструктурный белок 1 (NS1) вируса гриппа А многофункциональный и участвует в различных стадиях взаимодействия вируса с клеткой: он является антагонистом противовирусного клеточного ответа и регулятором экспрессии вирусных и клеточных генов [3, 4]. В частности, белок NS1 вируса гриппа выполняет функцию антагониста интерферона (ИФН) и тем самым способствует развитию продуктивной инфекции, нарушая одно из важнейших звеньев противовирусного иммунитета [5]. Кроме того, С-концу белка NS1 приписывают функцию снижения активации дендритных клеток и, следовательно, нарушения стимуляции наивных Т-клеток [6]. Соответственно, иммуногенность живой гриппозной вакцины (ЖГВ) может быть усилена за счёт усечения белка NS1 с С-конца с целью ослабления его анти-ИФН-активности. Ранее нами был сконструирован вакцинный штамм ЖГВ подтипа H7N9, который кодировал укороченный до 126 аминокислот белок NS1. Эксперименты на мышах показали, что такая модификация приводила к существенному усилению Т-клеточного ответа к иммунодоминантному эпитопу NP₃₆₆ по сравнению с иммунизацией ЖГВ с полноразмерным NS1 [7].

Целью настоящего исследования явилась оценка модуляции иммуногенных свойств вакцинного штамма сезонной ЖГВ подтипа H1N1 при усечении рамки считывания белка NS1 до 126 аминокислот. При этом изучался системный и локальный Т-клеточный ответ ко всем антигенам вируса гриппа путём стимуляции иммунных клеток цельным живым эпидемическим вирусом гриппа H1N1.

Материалы и методы

Вирусы

Экспериментальные реассортантные штаммы подтипа H1N1 получены стандартными методами обратной генетики на основе донора аттенуации отечественной ЖГВ A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Лен/17) [8]. В качестве родительского эпидемического вируса гриппа выступал штамм A/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1) [H1N1/wt], полученный из коллекции NIBSC (Великобритания). Вакцинный штамм ЖГВ H1N1 c полноразмерным белком NS1 содержал гены PB2, PB1, PA, NP, M и NS от донора аттенуации Лен/17, а гены гемагглютинина и нейраминидазы — от эпидемического вируса H1N1/wt. Для получения рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего усечённый белок NS1, после 126 аминокислот открытой рамки считывания белка NS1 вируса Len/17 добавлены 3 последовательных стоп-кодона с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием набора «Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit» («New England Biolabs») и специфических праймеров («Evrogen Ltd.»). Вирусы культивировали в 10–11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) (птицефабрика «Синявинская») при 33ºС (для вакцинных штаммов ЖГВ) или при 37ºС (для эпидемического штамма H1N1/wt) и хранили при –70ºC в аликвотах.

Клеточные линии

Клетки почки собаки MDCK (ATCC CCL-34) и клетки почки зелёной мартышки Vero (ATCC CCL-81) культивировали в ростовой среде DMEM с содержанием 10% эмбриональной бычьей сыворотки и добавлением антибиотика-антимикотика (перечисленные реагенты — «Capricorn»).

Определение инфекционной активности вирусов гриппа

Инфекционные титры вирусов определяли методом предельных разведений. Для заражения РКЭ вирусы разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и каждым разведением заражали 4–6 эмбрионов в объёме 200 мкл. РКЭ инкубировали при 33ºС и 38ºС в течение 48 ч или при 26ºС в течение 6 сут, после чего эмбрионы охлаждали; наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли в реакции гемагглютинации с куриными эритроцитами. Определение инфекционных титров вирусов на клеточных культурах проводили путём заражения суточной монослойной культуры в формате 96-луночных планшетов серийными 10-кратными разведениями вирусов. После адсорбции инокулят удаляли, клетки промывали, инкубировали в среде DMEM с содержанием 1 мкг/мл трипсина ТРСК и антибиотика-антимикотика при 33ºС в течение 4 сут. Наличие вирусов в лунках определяли путём окрашивания зафиксированных в ацетоне клеток моноклональным анти-NP-антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (ООО «ППДП»). Проявку осуществляли с помощью субстрата ТМБ («Thermo Fisher Scientific»), и оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре «xMark» («BioRad»). Лунки считали положительными при значениях оптической плотности (λ = 450 нм), превышающих значения отрицательных контрольных лунок минимум в 2 раза. Титры вирусов в РКЭ и клетках Vero и MDCK рассчитывали по методу L.J. Reed и соавт. [9] и выражали в 50% инфекционных дозах (lg ЭИД₅₀/мл и lg ТЦИД₅₀/мл).

Накопление и очистка вируса гриппа на градиенте сахарозы

Для проведения иммунологических тестов вирус гриппа H1N1/wt очищали на градиенте сахарозы для удаления неспецифических белков куриных эмбрионов и для концентрирования вируса. Очистку вирусов проводили на 30%/60% градиенте плотности c использованием ультрацентрифуги («BeckmanCoulter») в несколько этапов:

осветление собранной аллантоисной жидкости путём центрифугирования в течение 15 мин при 4ºС при 3500g;
осаждение при 16 000g в течение 2 ч при 4ºС и ресуспендирование образованного осадка в 2 мл ФСБ;
наслаивание ресуспендированного осадка на 30%/60% ступенчатый градиент сахарозы с последующим ультрацентрифугированием в течение 2 ч и при 4ºС при 23 000g;
сбор концентрированного вируса на границах градиента и его отмывка в 10 мл ФСБ путём центрифугирования в течение 1,5 ч при 23 000g. На последнем этапе вирусный осадок ресуспендировали в 1 мл ФСБ и хранили при –70ºС в аликвотах.

Иммунизация мышей и сбор органов

В работе использовали самок мышей линии C57Bl/6J, поставляемых из питомника «Филиал Столбовая» НЦБМТ ФМБА России. Мышей иммунизировали двукратно интраназально с интервалом в 21 день одним из рекомбинантных штаммов ЖГВ в дозе 10⁶ ЭИД₅₀ в объёме 50 мкл с использованием лёгкого эфирного наркоза. Контрольные животные получали равный объём ФСБ. На 3-и сутки у 4 вакцинированных мышей из каждой группы осуществляли забор лёгких и носовых ходов, которые в дальнейшем гомогенизировали с использованием автоматического гомогенизатора «TissueLyser LT» («Qiagen»). Гомогенаты лёгочной и носовой ткани использовали для определения инфекционного титра вируса в системе РКЭ. Через 7 сут после повторной иммунизации у 6 мышей из каждой группы собирали лёгочную ткань и селезёнки для дальнейшей оценки Т-клеточного иммунитета.Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 1/20 от 27.02.2020).

Оценка Т-клеточного иммунного ответа

Определение системных и локализованных в лёгких Т-клеток памяти проводили по ранее описанному методу [7] с небольшими модификациями. Одиночные спленоциты выделяли в среде CR-0 (RPMI-1640 с добавлением антибиотика-антимикотика, 25 мМ HEPES (перечисленные реагенты от «Capricorn») и 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом («Sigma-Aldrich»), используя фильтры с размером пор 70 мкм («BD Biosciences»). Затем эритроциты лизировали с помощью буфера для лизиса эритроцитов («BioLegend»). Для внутриклеточного окрашивания цитокинов 2 × 10⁶ клеток добавляли в стерильные микропланшеты с U-образным дном в 100 мкл среды CR-10 (среда CR-0, содержащая 10% эмбриональной бычьей сыворотки). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл среды CR-10, содержащей очищенный цельный вирус H1N1/wt в дозе 2 инфекционные единицы на клетку, и инкубировали в течение 18 ч при 37ºС, 5% СО₂. Затем к пробам добавляли раствор GolgiPlug («BD Biosciences») в конечной концентрации 1 : 1000 для остановки белкового транспорта. Стимуляцию форболмиристил ацетатом («Sigma-Aldrich») использовали в качестве положительного контроля; также были приготовлены нестимулированные контрольные образцы и образцы изотипического контроля. Клетки инкубировали в течение 5 ч при 37ºC, 5% CO₂, затем окрашивали в течение 20 мин при 4ºC в темноте с помощью флуоресцентного красителя для выявления живых/мёртвых клеток ZombieAqua и смесью следующих флуоресцентно меченных поверхностных антител: CD4-PerCP/Cy5.5, CD8-APC/Cy7, CD44-PE, и CD62L-BV421 (перечисленные реагенты — «BioLegend»). Набор «Cytofix/Cytoperm» («BD Biosciences») использовали для фиксации/пермеабилизации, после чего клетки окрашивали антителами к цитокинам: ИФН-γ — FITC, фактору некроза опухоли-α (ФНО-α) — APC, интерлейкину-2 (ИЛ-2) — PE/Cy7 в течение 20 мин при 4ºC в темноте. Образцы фиксировали буфером Cyto-Last (антитела и буфер — «BioLegend») и анализировали с помощью цитофлуориметра «Navios» («BeckmanCoulter»).

Для обнаружения тканерезидентных Т-клеток памяти (T_RM) перфузированные раствором ФСБ лёгкие разрезали на мелкие кусочки стерильными ножницами и обрабатывали смесью ДНКазы I и коллагеназы («Sigma-Aldrich») в течение 40 мин при 37ºC. Затем готовили суспензию отдельных клеток с помощью фильтров с размером пор 70 мкм. Эритроциты лизировали, как описано выше, и стимулировали цельным вирусом H1N1/wt с последующим выявлением вирусспецифических Т-клеток эффекторной памяти (T_ЕM; CD44⁺CD62L^–), экспрессирующих маркеры тканерезидентности (CD69⁺CD103⁺). Набор для окраски поверхностных маркеров и внутриклеточных цитокинов включал: CD4 — PerCP/Cy5.5, CD8 — APC/Cy7, CD44 — APC, CD62L — BV421, CD69 — PE/Cy7, CD103 — FITC, в то время как внутриклеточную окраску проводили только на один цитокин — ИФН-γ — PE/Dazzle (перечисленные реагенты — «BioLegend»). Подсчитывали количество цитокин-позитивных клеток в стимулированных группах и вычитали уровень спонтанной секреции цитокинов в нестимулированных контрольных образцах.

Статистическая обработка результатов

Данные проточной цитометрии проанализированы в программе «Kaluza Analysis» («BeckmanCoulter»). Статистический анализ и подготовку иллюстраций проводили с помощью программы «GraphPad Prism v. 7.0». Для сравнения данных использовали дисперсионный анализ ANOVA с поправкой Тьюки или U-критерий Манна–Уитни; различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты

В настоящем исследовании генно-инженерными методами получен штамм сезонной ЖГВ подтипа H1N1, экспрессирующий усечённый до 126 аминокислот неструктурный белок 1 (ЖГВ H1N1 NS1₁₂₆). В экспериментах in vitro было показано, что классический вакцинный штамм ЖГВ H1N1 и модифицированный вариант ЖГВ H1N1 NS1₁₂₆ обладали сходными ростовыми характеристиками в различных системах культивирования, однако вариант с NS1₁₂₆ достоверно более слабо размножался при пониженной до 26ºС температуре (таблица). Эти результаты согласуются с полученными ранее данными о фенотипических характеристиках вакцинных штаммов ЖГВ с NS1₁₂₆ [7, 10]. Кроме того, модифицированный штамм практически не размножался в верхних дыхательных путях мышей, в отличие от классического штамма ЖГВ, что также согласуется с полученными ранее данными об усилении аттенуирующих свойств вакцины при укорочении рамки считывания белка NS1.

Репликативные свойства вакцинных штаммов ЖГВ в системах in vitro и in vivo

Replicative properties of LAIV vaccine strains in vitro and in vivo systems

Вакцинный штамм Vaccine strain	Титр вируса в РКЭ, lg ЭИД₅₀/мл Virus titer in ECE, lg EID₅₀/ml			Титр вируса в клетках, lg ТЦИД₅₀/мл Virus titer in cells, lg TCID₅₀/ml		Титр вируса в органах мышей, lg ЭИД₅₀/мл Virus titer in mouse organs, lg EID₅₀/ml
Вакцинный штамм Vaccine strain	26ºC	33ºC	38ºC	MDCK	Vero	лёгкие \| lungs	нос \| nose
ЖГВ H1N1 LAIV H1N1	5,8 ± 0,4	8,7 ± 0,3	1,9 ± 0,4	7,2 ± 0,3	6,2 ± 0,2	˂ 1,2	2,3 ± 1,2
ЖГВ H1N1 NS1₁₂₆ LAIV H1N1 NS1₁₂₆	4,4 ± 0,7	7,6 ± 0,5	˂ 1,2	5,8 ± 0,8	5,4 ± 0,4	˂ 1,2	˂ 1,2

Двукратная иммунизация мышей ЖГВ и ЖГВ NS1₁₂₆ стимулировала индукцию высоких уровней вирус-специфических Т_ЕМ с фенотипом CD44⁺CD62L^– в селезёнках мышей, причём укорочение белка NS1 в вакцинном штамме ЖГВ значительно повышало уровни полифункциональных CD4⁺-Т_ЕМ-клеток, секретирующих одновременно 2 (ИФН-γ, ФНО-α) или 3 (ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-2) цитокина (рис. 1, а). Кроме того, только в группе мышей, получивших ЖГВ NS1₁₂₆, обнаруживались достоверно более высокие уровни ИФН-γ-продуцирующих цитотоксических Т-клеток памяти по сравнению с контролем (рис. 1, б). Таким образом, полученные данные указывают на то, что модифицированный штамм ЖГВ NS1₁₂₆ может обладать более высоким потенциалом защиты от гриппозной инфекции, чем классический вариант ЖГВ.

Рис. 1. Количество Т_ЕМ-клеток (CD44⁺CD62L^–) с фенотипом CD4⁺ (а) и CD8⁺ (б), экспрессирующих ИФН-γ (I), ИФН-γ и TNFα (II) и IFNγ, TNFα и IL-2 (III), в группах мышей, иммунизированных ЖГВ или ЖГВ с укороченным NS1 белком, а также в контрольной группе (ФСБ).

*p < 0,05, **p < 0,01 (критерий Манна–Уитни).

Fig. 1. Number of effector memory T cells (CD44⁺CD62L^–) with CD4⁺ (a) and CD8⁺ (b) phenotype expressing IFNγ (left panel), IFNγ and TNFα (middle panel) and IFNγ, TNFα and IL-2 (right panel) in groups of mice immunized with LAIV or LAIV with truncated NS1 protein, as well as in the control group (PBS).

Significant differences between groups (Mann–Whitney test), *p < 0.05, **p < 0.01.

Далее проведено исследование субпопуляций вирус-специфических Т_ЕМ-клеток в лёгких с оценкой экспрессии этими клетками поверхностных маркеров Т_RM-клеток памяти. Оценка уровней ИФН-γ-продуцирующих Т_ЕМ-клеток в лёгких иммунизированных мышей выявила достоверное усиление CD4⁺-Т-клеточного ответа в группе животных, привитых прототипом ЖГВ NS1₁₂₆, по сравнению с классическим вариантом вакцины (рис. 2, а). Для цитотоксических CD8⁺-Т_ЕМ-клеток в лёгких был показан сопоставимый уровень иммуногенности ЖГВ, не зависящий от модификации белка NS1 (рис. 2, г). При этом уровень экспрессии маркеров тканерезидентности был сопоставим в обеих вакцинных группах (рис. 2, б, в, д, е), что свидетельствует о локализации выявленных вирус-специфических клеток в эпителии лёгких, в непосредственной близости от потенциального места проникновения патогена.

Рис. 2. Индукция вирусспецифических Т-клеток памяти в ткани лёгких при иммунизации мышей исследуемыми вакцинными вирусами.

а, г — количество ИФН-γ-продуцирующих Т_ЕМ-клеток (CD44⁺CD62L^–) с фенотипом CD4⁺- (а) и CD8⁺-клеток (г) в группах мышей, иммунизированных ЖГВ или ЖГВ NS₁₂₆, а также в контрольной группе; б, д — уровень вирусспецифических тканерезидентных клеток памяти с фенотипом CD69⁺CD103^– среди ИФН-γ⁺-клеток в популяциях CD4⁺- (б) и CD8⁺-Т-клеток (д); в, е — количество вирусспецифических тканерезидентных клеток памяти с фенотипом CD69⁺CD103⁺ среди ИФН-γ⁺-клеток в популяциях CD4⁺- (в) и CD8⁺-Т-клеток (е).

*p < 0,05, **p < 0,01 (критерий Манна–Уитни).

Fig. 2. Induction of virus-specific memory T cells in the lungs after immunization of mice with the study vaccine viruses.

(a, d) Number of IFNγ-producing effector memory T cells (CD44⁺CD62L^–) with CD4+ (a) and CD8⁺ (d) cell phenotype in groups of mice immunized with LAIV or LAIV with truncated NS₁₂₆, as well as in controls. Proportion of virus-specific tissue-resident memory cells with CD69⁺CD103^– phenotype among IFNγ⁺ cells in CD4⁺ and CD8⁺ T cell populations (b and f, respectively). Proportion of virus-specific tissue-resident memory cells with CD69⁺CD103⁺ phenotype among IFNγ⁺ cells in CD4⁺ and CD8⁺ T cell populations (c and f, respectively).

* p < 0.05, ** p < 0.01 between groups (Mann–Whitney test).

Обсуждение

Существующие противогриппозные вакцины индуцируют преимущественно нейтрализующие антитела, нацеленные на гипервариабельные эпитопы основного антигена вируса гриппа — молекулы гемагглютинина, из-за чего требуется практически ежегодное обновление штаммового состава вакцин. За последнее десятилетие достигнут существенный прогресс в разработке противогриппозных вакцин более широкого защитного спектра, нацеленных на консервативные вирусные антигены, такие как домен стебля гемагглютинина, нейраминидаза или M2e; а также разработаны подходы на основе Т-клеток, которые обладают наибольшим потенциалом вызывать долговременные перекрёстные защитные реакции клеток памяти [11]. К настоящему времени накоплен большой массив данных о способности вирусов гриппа, экспрессирующих усечённый белок NS1, стимулировать образование более выраженного адаптивного иммунного ответа, одновременно делая вирус более аттенуированным [12–15]. Однако в подавляющем большинстве исследований использовался модельный лабораторный штамм A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) или штамм, созданный на основе вируса гриппа дикого типа, что имеет существенный недостаток — вероятность возврата к вирулентному фенотипу в случае возможной реассортации с другими циркулирующими вирусами. В нашем исследовании в качестве основы использован штамм отечественной лицензированной живой гриппозной вакцины, широко применяемой в практике здравоохранения в России и в ряде зарубежных стран [16].

Ранее нами было показано, что усечение до 126 аминокислот белка NS1 вакцинного штамма ЖГВ H7N9 приводит к усилению гуморального и Т-клеточного ответа в эксперименте на мышах [7]. В отличие от указанного исследования, где Т-клеточный иммунный ответ оценивался путём стимуляции клеток синтетическими пептидами, соответствующими иммунодоминантным CD8⁺-T-клеточным эпитопам NP₃₆₆, в настоящей работе проводили стимуляцию иммунных клеток вакцинированных мышей цельным очищенным вирусом гриппа H1N1/wt. Такая стимуляция лучше отражает реальную клиническую ситуацию, поскольку при гриппе организм сталкивается с циркулирующим вирусом в его естественном виде и инфицированные клетки презентируют на комплексах MHC-I и MHC-II большое разнообразие Т-клеточных вирусных эпитопов.

В настоящем исследовании продемонстрировано усиление CD4⁺-Т-клеточного ответа у мышей при их иммунизации штаммом живой гриппозной вакцины с модифицированным белком NS1, причём данный эффект был выражен как на системном (спленоциты), так и на локальном уровне (клетки из тканей лёгких). При этом системные вирусспецифические CD4⁺-Т-клетки характеризовались полифункциональным фенотипом, продуцируя, помимо ИФН-γ, и другие ключевые провоспалительные цитокины, участвующие в противовирусном ответе, такие как ФНО-α и ИЛ-2. Известно, что Т-лимфоциты, способные секретировать одновременно несколько цитокинов в ответ на антигенную стимуляцию, являются более точными предикторами способности организма противостоять реинфекции, чем монофункциональные клетки с секрецией только ИФН-γ [17]. Для системных CD8⁺-Т_ЕМ-клеток не было выявлено значимого увеличения пропорции цитокинпродуцирующих Т-клеток при укорочении белка NS1, вероятно, из-за небольшого количества животных в группе и высокой дисперсии. Эти данные в целом согласуются с полученными ранее результатами для вакцинного штамма H7N9, экспрессирующего укороченный вариант белка NS1, где CD8⁺-Т-клеточный ответ оценивали после стимуляции спленоцитов пептидом, соответствующим иммунодоминантному эпитопу NP₃₆₆ [7]. Важно отметить, что более выраженный Т-клеточный ответ, формирующийся непосредственно в тканях лёгких мышей, иммунизированных вакцинным штаммом ЖГВ с NS1₁₂₆, указывает на потенциал развития ускоренного иммунного ответа при последующем контакте с патогеном, поскольку Т_RM-клетки в лёгких представляют собой первую линию иммунной защиты организма от респираторных патогенов [18, 19].

Заключение

В настоящей работе приведены свидетельства усиления системного и локализованного в лёгких CD4⁺-Т-клеточного иммунного ответа при укорочении белка NS1 штамма сезонной ЖГВ. Поскольку вирусспецифические Т-клетки выявлялись при стимуляции лимфоцитов цельным живым вирусом H1N1/wt, можно предположить, что при повторном инфицировании современным циркулирующим вирулентным вирусом данного подтипа иммунизированные вариантом ЖГВ H1N1 NS1₁₂₆ мыши будут лучше защищены от клинических проявлений заболевания, чем животные, получившие классический вариант ЖГВ.