STUDY OF COLONIZATION PROCESSES AND PERSISTENCE OF MICROORGANISMS IN ARTIFICIAL MATERIALS FOR MEDICAL USE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Большинство изделий медицинского назначения изготавливается из искусственных материалов - металлических, полимерных, резиновых, керамических и т.д. Поскольку все эти изделия прямо или косвенно контактируют с тканями организма человека, к ним предъявляются жесткие санитарно-гигиенические требования [4]. В перечне требований отсутствуют нормативы, касающиеся колонизации этих материалов резидентной и патогенной микрофлорой в процессе их эксплуатации. Искусственные материалы, в том числе и материалы медицинского назначения, могут быть колонизированы микроорганизмами и подвергаться биокоррозии или биодеструкции [2, 10]. В связи с этим, необходимость изучения процессов взаимодействия микроорганизмов с искусственными материалами при длительном их нахождении в организме человека продиктована определением возможного риска для здоровья пациентов, необходимостью разработки новых материалов, покрытий, устойчивых к микробной колонизации, а также эффективных способов удаления микроорганизмов без повреждения искусственных протезов и устройств. Такого рода исследования наиболее актуальны в стоматологической практике, поскольку все используемые зуботехнические материалы длительное время находятся в ротовой полости, постоянно контактируя с микрофлорой, в составе которой могут быть патогенные виды бактерий и грибов [3, 5, 6, 9]. Цель настоящего исследования: изучить процессы микробной колонизации и персистенции на некоторых полимерных материалах медицинского назначения. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для проведения данного исследования были выбраны наиболее распространенные в медицинской практике полимерные пластмассы для производства съемных зубных протезов на основе полиуретана и акрила: «Денталур», ОАО НИИР, Россия; «Фторакс» «Пластмасса бесцветная», АО Стома, Украина. Клинические изоляты грамотрица-тельных и грамположительных бактерий (Pseudomonas aeuruginosa, Staphylococcus aureus) как наиболее значимые микроорганизмы в развитии различных воспалительных процессов были выбраны для изучения процессов взаимодействия микроорганизмов с образцами пластмасс. Динамика процесса взаимодействия микроорганизмов с полимерными материалами была изучена с помощью метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы полимеров (пластины размером 1х1 см) помещались в питательный LB бульон (Luria-Bertani broth), в который предварительно засевали культуру бактерий в концентрации 106/мл. Инкубация образцов проводилась в термостате в течение 24, 48 час и 7, 14 суток и в течение 1,5 и 3 месяцев при температуре 37°C. При инкубации образцов дополнительного внесения питательной среды не производилось, и таким образом, стимулировался процесс образования биопленки в прогрессивно истощающейся среде [21]. После инкубации образцы фиксировались 10% раствором нейтрального формалина. Следует отметить, что в процессе подготовки образцов не применялась традиционное для СЭМ обезвоживание спиртом или ацетоном. Отсутствие дегидратации образцов позволило сохранить их нативную структуру и, в частности, структуру экзоклеточного матрикса биопленок, на 90% состоящего из воды [19]. Поверхности образцов полимерных пластмасс были изучены с помощью двулучевого сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, USA) в режимах высокого вакуума, при ускоряющих напряжениях 5 и 10кХ с предварительным напылением золотом в установке SPI-Module Sputter/Carbon Coater System (SPI Inc., USA). Для оценки морфофункционального состояния бактерий, длительно находившихся на поверхности искусственных материалов, было проведено ультраструктурное исследование соскобов биопленки. Образцы были приготовлены по общепринятой методике для исследования методом ультратонких срезов и проанализированы в просвечивающем электронном микроскопе JEM 100B (JEOL, Japan). Оценка жизнеспособности бактерий, сформировавших биопленку на сроках 1,5 и 3 мес., была произведена посредством посева бактериального налета с поверхности пластмасс в питательный бульон и на агаризированную среду LB. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенного исследования для всех изученных образцов были установлены общие закономерности взаимодействия микроорганизмов с поверхностью пластмасс и процессы, связанные с формированием очагов бактериальной персистен-ции на искусственных материалах. Поэтапно процесс взаимодействия микроорганизмов с поверхностью пластмасс может быть представлен следующим образом. Первый этап - образование безмикробной пленки. На сканограммах образование безмикробной пленки соответствует появлению участков более высокой электронной плотности (рис.). Данный этап является чрезвычайно важным для последующей успешной адгезии бактерий к пластмассам. Безмикробная пленка, состоящая из продуктов жизнедеятельности микро- Этапы формирования биопленок. Вверху слева направо: образование безмикробной пленки; адгезия стафилококка; образование микроколоний - 24, 48 час инкубации. Внизу слева направо: начало синтеза экзоклеточного матрикса; зрелая биопленка с номадами; биопленка P. aeuruginosa с массивным экзоклеточным матриксом. организмов и компонентов питательной среды, меняет заряд поверхности с отрицательного на положительный, тем самым обеспечивая отрицательно заряженным бактериям прикрепление к поверхности за счет сил электростатического взаимодействия [20]. Второй этап - адгезия одиночных бактерий к поверхности. Наиболее интенсивно бактерии адгезируются в области дефектов, образовавшихся при механической обработке материала. На ранних сроках инкубации 24 час синегнойная палочка, у которой хорошо развит жгутиковый аппарат, адгезируется лучше, чем безжгутиковый стафилококк. Жгутики относятся к нитевидным выростам клеточной поверхности, они состоят из спиральной нити толщиной 12 - 18 нм, крючка и базального тела, в совокупности именуемого жгутиковым мотором, который обеспечивает движение бактерий к источнику питания, на поверхности которого могут быть особые химические соединения - аттрактанты [13]. Перитрихиальные жгутики осуществляют поступательное движение и роение клеток, а полярные могут обеспечивать и движение бактерий по поверхности [1]. У безжгутиковых бактерий реализация адгезии происходит посредством увеличения экспрессии поверхностных адгезинов (белок Bap и экзополисахариды - PIA или PNAG), которые способствуют прикреплению к субстрату и обеспечивают межклеточные взаимодействия [16, 21]. На третьем этапе происходит образование микроколоний (деление и объединение бактериальных клеток в единую структуру). На этом этапе можно было видеть начало синтеза экзоклеточного матрикса, который объединяет бактерии и является облигатным признаком формирования биопленки. Четвертый этап - формирование зрелых биопленок с массивным экзоклеточным матриксом. Экзоклеточный матрикс, в состав которого входят гомо- и гетерополисахариды, уроновые кислоты, аминосахара и их сополимеры, белки, нуклеиновые кислоты, липополисахариды, различные минералы (кальций, фосфор и в небольших количествах магний, калий, натрий) выполняет защитную функцию, препятствуя диффузии бактерицидных агентов и действию физических факторов, таких как ультрафиолетовое облучение, изменение рН, осмотический шок, высыхание, участвует в образовании полимикробных биопленок [7, 12, 15, 17, 19]. От зрелых биопленок отшнуровывались особые структуры - номады, состоящие из бактерий, окруженных матриксом. Кроме номад на поверхности биопленок были видны бактерии с четкими контурами без покрытия массивным экзоклеточным матриксом. Очевидно, что номады и поверхностно локализованные бактерии обеспечивают популяции распространение в окружающей среде. При длительной инкубации (1,5 и 3 мес.) синегнойная палочка и золотистый стафилококк находились на поверхности полимерных пластмасс в массивных биопленках. Биопленки могли фрагментарно отслаиваться от поверхности и растрескиваться, при этом внутри биопленки визуализировались морфологически сохранные бактерии. Возможно, растрескивание биопленки, также как и номады, обеспечивает выход из нее жизнеспособных бактерий. При длительной колонизации бактериями поверхности изученных полимеров происходит формирование дополнительных дефектов поверхности и увеличение объема ранее существовавших. Биодеструктивные изменения в пластмассах возникают в результате действия бактериальных эстераз (ферментов, расщепляющих эфирные связи полимеров) и продуктов их жизнедеятельности, в частности, органических кислот [8, 18]. В дефектах пластмасс бактериальные биопленки способны к длительному сохранению, поскольку надежно защищены от агрессивного воздействия внешней среды (механического удаления, воздействия антибактериальных препаратов). В связи с этим, можно обоснованно утверждать, что образованные на полимерных материалах биопленки обеспечивают длительную персистенцию патогенных для человека возбудителей, потенциально являясь очагами хронической инфекции. Следует отметить, что в реальной клинической ситуации наличие биопленок в полости рта, в состав которых может входить патогенная микрофлора, создает угрозу развития воспалительных процессов не только локального порядка, но и для всего организма в целом. Это связано с возможной миграцией защищенных экзополиматриксом жизнеспособных бактерий в желудочно-кишечный и дыхательный тракт при глотании и вдыхании, а также диссеминации гематогенным и лимфогенным путем. Анализ ультратонких срезов соскобов с поверхности пластмасс показал, что на ранних сроках инкубации до 14 суток в препарате были представлены в основном бактерии с сохранной структурой, типичной для вегетативных форм бактерий, и незначительное количество форм бактерий с дефектной клеточной стенкой (ДКС). С увеличением сроков инкубации в препаратах соотношение форм бактерий смещалось в сторону увеличения форм с ДКС, но сохранялись и бактерии в типичной вегетативной форме с признаками деления. На основе этих данных можно заключить, что бактерии в формирующихся биопленках сохраняют жизнеспособные клетки как в вегетативной форме, так и в формах с ДКС, способных к реверсии в типичные вегетативные формы. Следует отметить и наличие лизированных бактерий в биопленках. По существующим представлениям наличие лизированных бактерий в биопленке может быть результатом так называемого «каннибализма», или ауто-фагии. Аутофагические модели были описаны на молекулярном уровне у многих бактерий при нехватке питательных веществ в среде обитания. Некоторые бактерий в колонии начинают выделять в окружающую среду токсины, направленные на уничтожение тех бактерий в той же популяции, которые не производят антитоксины [14]. Продукция бактериями токсинов и антитоксинов рассматривается как фактор их персистенции в стрессовых для бактериальной популяции условиях [11]. Данные микроскопического исследования, свидетельствующие о морфофункциональной сохранности и соответственно жизнеспособности бактерий при длительном их нахождении на поверхности пластмасс в составе биопленок, были подтверждены бактериологически. Посев соскоба с поверхности биопленок пластмасс спустя 1,5 и 3 мес. инкубации показал наличие жизнеспособных бактерий в биопленках, образовывавших колонии. Проведенное исследование показало принципиальную возможность исследовать процессы взаимодействия микроорганизмов с искусственными материалами медицинского назначения в экспериментальных условиях. Разработанная экспериментальная модель образования биопленок на абиотических поверхностях может служить основой для проведения исследований, направленных на борьбу с биопленками с помощью СЭМ. Целесообразность использования микроскопических методов основана на том, что только визуальный контроль способен дать оценку морфофункционального состояния как самих бактерий, так и экзополиматрикса биопленок при использовании тех или иных антибактериальных средств. Сочетание микроскопических методов с традиционными бактериологическими методами исследования, посредством которых можно оценить наличие жизнеспособных бактерий, объективизирует оценку эффективности средств борьбы с биопленками. Работа была выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ по Госзаданию №16.1668.2014/К в рамках проектной части государственного задания в сфере научной деятельности. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

L. V. Didenko

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

G. A Avtandilov

Evdokimov Moscow State Medical-Stomatological University, Moscow, Russia

T. A Smirnova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

N. V Shevlyagina

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

V. N Tsarev

Evdokimov Moscow State Medical-Stomatological University, Moscow, Russia

I. Yu. Lebedenko

Evdokimov Moscow State Medical-Stomatological University, Moscow, Russia

V. M Elinson

Tsiolkovsky Russian State Technological University, Moscow, Russia

I. G Tiganova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

Yu. M Romanova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

O. V Ippolitov

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

References

Supplementary files