ADENOVIRUSES IN THE ETIOLOGICAL STRUCTURE OF ACUTE RESPIRATORY VIRAL INFECTION IN MOSCOW IN 2004 - 2014

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Аденовирусная инфекция встречается в различных регионах мира в виде спорадических случаев, семейных очагов и отдельных вспышек, составляя от 0,8% до 27% случаев острых респираторных заболеваний [4, 5, 18, 21]. Возбудителями являются аденовирусы - икосаэдрические не имеющие оболочки ДНК-содержащие вирусы, выделяемые от позвоночных. Аденовирусы, инфицирующие человека (hAdv), которые впервые были изолированы в 1953 году из ткани аденоидов, относят к роду Mastadenovirus. Международный комитет по таксономии вирусов выделяет 7 видов аденовируса человека: от A до G, включающих 68 серотипов. Дифференциацию аденовирусов на серотипы проводят исследованием в реакции гемагглютинации и нейтрализации со специфическими сыворотками или с использованием молекулярногенетических методов [14, 15]. Клинические проявления аденовирусной инфекции человека варьируются в широком диапазоне от инаппарантной формы инфекции до тяжелых случаев (пневмония, менингиты, энцефалиты) с летальным исходом [12], и в зависимости от вида и серотипа вируса могут поражаться различные органы и системы. Аденовирусы D вызывают кератоконъюнктивиты, F - гастроэнтериты, G - гастриты. Аденовирусы, относимые к виду А, могут обнаруживаться в испражнениях практически здоровых детей. Острые респираторные заболевания вызывают различные серотипы аденовирусов видов B, C и E. В зарубежных исследованиях отмечается неоднородная представленность различных серотипов респираторных аденовирусов, которая варьирует в зависимости от возраста. Некоторые серотипы чаще регистрируются в период вспышек аденовирусной инфекции [8, 13, 19]. Современные сведения по эпидемиологии аденовирусной инфекции в России отсутствуют. Последнее исследование по изучению распространения различных видов и серотипов аденовируса и их клинической значимости было проведено около 50 лет назад с использованием серологического метода типирования вируса с предшествующим выделением вирусов в культуре клеток [1, 2]. В данной работе на основе использования молекулярно-генетических методов представлена распространенность аденовирусов в качестве возбудителей острых вирусных инфекций дыхательных путей (ОРВИ) в Москве с 2004 по 2014 гг., охарактеризованы их виды и серотипы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследование, проводимое в 2004 - 2014 гг., включен биологический материал от 4731 пациентов и 663 условно здоровых лиц. Биологический материал включал мазки из носо- и ротоглотки, мокроту и/или аспираты из трахеи, а также посмертный секционный материал. Основную часть исследованного материала составили образцы, полученные от 4593 детей в возрасте от 1,5 месяцев до 17 лет, больных острыми респираторными инфекциями: 4000 детей были госпитализированы в инфекционные больницы г. Москва (5 ДИБ, ИКБ 1, Измайловская ДГКБ, Мытищинская ГКБ), 593 чел. находились на амбулаторном лечении в детских городских поликлиниках (ДГП № 17, 44, 45, 81, 120, 138). Биологический материал собирался в периоды подъема заболеваемости ОРВИ. Также были исследованы назофарингеальные мазки от 138 взрослых от 18 до 86 лет, лечившихся амбулаторно (ГП № 69) по поводу респираторной инфекции в 2010 - 2014 гг. преимущественно в апреле-мае 2010 г. и в январе- марте 2011 г. Также исследовались назофарингеальные образцы от 567 условно здоровых (не имеющих явных признаков респираторной инфекции на момент взятия материала для исследования) детей дошкольного и школьного возраста и 96 взрослых. Образцы от условно здоровых детей были собраны в 2008 - 2012 годах; от взрослых - в течение 2011 года. Отдельную группу исследования составили образцы от военнослужащих (95 человек), собранные во время вспышек острых респираторных инфекций в декабре 2010 - январе 2011 гг., в августе 2012 г., декабре 2012 - январе 2013 гг., в январе-феврале 2014 г. в Московском военном округе. Кроме того, исследовались аденовирусы, обнаруженные в посмертном материале от больных пневмонией с летальными исходом, поступившем в референс-центр по мониторингу за возбудителями инфекций верхних и нижних дыхательных путей ЦНИИЭ за 2014 г. с целью определения этиологического агента пневмонии. Экстракты нуклеиновых кислот были получены из 100 мкл образцов биологического материала с помощью набора «Рибо-преп» («АмплиСенс», ЦНИИЭ, Москва). Возбудители ОРВИ, включая аденовирусы, определяли в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием ряда наборов реагентов и лабораторных методик ЦНИИЭ: набор реагентов «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» для выявления РНК респираторно-синцитиального вируса (hRSv), метапневмовируса (hMpv), вирусов парагриппа (hPiv) 1,2, 3, 4 типов, коронавирусов (hCov) 229E, NL-63, oC43, HKU-1, риновирусов (hRv), бокавируса (hBov) и аденовирусов (hAdv) B, C, E; набор реагентов «АмплиСенс Influenza virus A/B-FL» для выявления РНК вирусов гриппа А и B; лабораторная методика для выявления РНК вируса гриппа С. ПЦР проводилась в термоциклере с блоком флуоресцентной детекции Rotor-Gene 6000 Corbett Research. Для положительных по аденовирусу образцов с целью определения принадлежности к серотипу проводилось секвенирование фрагментов амплификации, полученных с применением набора реагентов «АмплиСенс Adenovirus-Eph» (ЦНИИЭ, Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Полученные фрагменты ПЦР соответствовали различающемуся у разных серотипов аденовируса гипервариабельному участку гена гексона [14, 15]. Полученные фрагменты ПЦР длиной 450 пар нуклеотидов очищались и секвенировались по обеим цепям методом cycle sequence с набором ABI PRISM Big Dye v.3.1 (Applied Biosystems, USA) согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Анализ последовательностей с определением принадлежности к определенному серотипу проводился с применением программы DNASTAR, ресурсов GenBank и BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. С целью оценки связи определенного серотипа аденовируса с клиническим диагнозом и исключения влияния других вирусов анализировались только случаи аденовирусной моноинфекции. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Этиологическая структура ОРВИ спорадического характера у детей и взрослых была следующей. Искомые возбудители ОРВИ у больных детей были обнаружены в 64,6% и 58% случаев у взрослых. За исследованные годы в этиологической структуре ОРВИ у детей превалировали респираторно-синцитиальный вирус (10,6% от всех исследованных образцов) и риновирусы (14,4%); в два раза реже встречались вирусы гриппа А (5,2%), вирусы парагриппа (5,2%), бокавирусы (4,6%) и аденовирусы (3,9%). Почти у 13% детей обнаруживались два или более вирусов одновременно. Среди случаев сочетанной инфекции чаще встречались бокавирусы, риновирусы и вирусы парагриппа. В этиологической структуре ОРВИ взрослых превалировал вирус гриппа А (21% от исследованных образцов), далее следовали риновирусы (10,1%), коронавирусы (6,5%), метапневмовирусы (5,8%), вирус гриппа В (5,1%), вирусы парагриппа (4,4%) и аденовирусы (2,9%). Сочетанная вирусная инфекция была зарегистрирована лишь у 1,5% взрослых. Таким образом, аденовирусы в этиологической структуре ОРВИ спорадического характера занимали 5 - 7 место. При этом аденовирусная инфекция у детей встречалась чаще, чем у взрослых: 3,9% случаев в виде моноинфекции и дополнительно 3% в составе сочетанной инфекции с другими респираторными вирусами, тогда как у взрослых аденовирусы обнаруживались в 2,9% случаев и только в виде моноинфекции. В исследованном материале здоровых взрослых аденовирусы отсутствовали, но были обнаружены у 0,4% условно здоровых детей. Дизайн исследования позволил оценить сезонность распространенности различных серотипов аденовирусов за период 2004 - 2014 гг. В связи с тем, что в разные сезоны по причине разной заболеваемости было собрано неодинаковое количество образцов, для адекватного сравнения результаты представлены в долях hAdv-положительных образцов от общего числа собранных и исследованных за этот месяц образцов. Показано, что доля респираторных аденовирусных инфекций возрастает в осенне-зимний период, в особенности с октября по декабрь, составляя от 8 до 10%, тогда как в остальные месяцы колеблется от 3 до 6%. Максимальная доля респираторных инфекций аденовирусной этиологии была отмечена в ноябре, а минимальная - в апреле. Ко-инфекции другими респираторными вирусами наблюдались в 41% случаев обнаружения аденовируса. В тех случаях, когда другие респираторные вирусы не обнаруживались (аденовирусная моноинфекция), определяли серотип аденовируса. За период с 2004 по 2014 гг. были выявлены аденовирусы шести серотипов вида С (1, 2, 5, 6, 57), трех серотипов вида B (3, 7, 14) и по одному серотипу видов E (4) и F (41). Аденовирусы видов B и C выявлялись примерно с равной частотой, реже и не во все месяцы встречался вид E. В двух случаях был обнаружен аденовирус F, ассоциированный с кишечной инфекцией. Среди различных серотипов чаще всего обнаруживался серотип 3 (34% моноинфекций), чуть реже - серотип 2 (20,9%), далее в порядке убывания частоты - серотипы 7 (12,4%), 6 (11,6%) и 4 (10,1%), и еще реже выявлялись другие серотипы. Установлено, что вид С встречался во все сезоны года, причем доля таких инфекций возрастала с мая по август, тогда как доля вида B была выше с сентября по март. Для вида Е не было обнаружено связи частоты встречаемости с определенным сезоном или месяцем. При оценке сезонности встречаемости разных серотипов не было обнаружено строгой зависимости. Средний возраст пациента с аденовирусной инфекцией составил 3 года 11 месяцев, медиана - 2 года 8 месяцев. Дети с аденовирусной инфекцией были разделены на 3 возрастные группы: младше года; от года до 7 лет; от 7 до 17 лет. Заболеваемость детей респираторной аденовирусной инфекцией менялась в зависимости от возраста: 73,1% инфицированных аденовирусом детей составляли дошкольники (группа 2), группы 1 и 3 составили 11,7% и 15,2% соответственно. В зависимости от возраста пациента изменялась и доля определенного вида аденовируса. Так, доля аденовируса вида С у детей до года составила 60%, у дошкольников - 53,6%, а у школьников - 21,4%, в то время, как доли аденовирусов вида B составили соответственно 30; 37,7 и 64,3%. Для вида Е не было обнаружено какой-либо зависимости от возраста пациента. В данном исследовании у больных взрослых аденовирусы были обнаружены только в 4 образцах, в 3 из которых идентифицирован вид B (серотипы 7 и 3), и в 1 - вид Е (серотип 4). Особый интерес представляет изучение ассоциации определенного серотипа аденовируса с клиническим проявлением респираторной аденовирусной инфекции. В данной выборке пациентов аденовирусная инфекция проявлялась в различных клинических формах, в большинстве случаев был поставлен диагноз ОРВИ (46%), реже бронхит (13%), ангина (9,7%) и пневмония (9,7%); 190 детей помимо респираторных, имели симптомы кишеч- Распространенность серотипов аденовируса при различных клинических ной инфекции, у 84 (44%) формах острой респираторной инфекции. Представлено количество образ- из них в назофаринге-цов из числа секвенированных, отнесенных к определенному серотипу Вид аденовируса, Серотип аденовируса Клинический диагноз C B E F 2 5 6 57 3 7 14 4 41 ОРВИ + ОКИ 1 1 1 8 2 1 Пневмония 1 3 6 4 Бронхит 1 1 2 3 1 4 Ангина 2 1 2 5 2 2 Отит 1 6 1 Ларинготрахеит 2 1 ОРВИ + конъюнктивит 1 1 Ринофарингит/фарингит 2 2 7 Трахеит 2 1 3 ОРВИ / ОРЗ 3 17 3 8 1 30 6 2 7 2 Здоровые дети 1 1 альных мазках были обнаружены различные вирусы, вызывающие респираторную инфекцию. Аденовирусная моноинфекция была выявлена у 7,4% таких детей, что достоверно выше, чем у детей без кишечных симптомов (p<0,025). Серотипы аденовируса в группах пациентов с различным топическим диагнозом представлены в табл. Наибольшим разнообразием клинических проявлений отличались серотипы 2 и 3, при этом в случае отитов серотип 2 являлся доминирующим. В группе ОРВИ с кишечными симптомами чаще обнаруживался серотип 3, в случае пневмоний чаще представлены серотипы 3 и 7, при трахеитах, фарингитах и ринофарингитах преобладал серотип 4 (вид Е). Аденовирусы, обнаруженные у здоровых детей, принадлежали к виду C серотипам 1 и 2. В процессе исследования этиологии острой респираторной инфекции у военнослужащих было выяснено, что четыре из пяти вспышек аденовирусной инфекции вызвал серотип 7. Он обнаруживался в декабре 2010 - январе 2011 гг., в декабре 2012 - январе 2013 гг., в январе-феврале 2014 гг. Во время вспышки в августе 2012 г. был обнаружен аденовирус серотипа 4. При этом аденовирус обнаруживался в 55 - 100% исследованных образцов. В аутопсийном материале шести умерших в 2013 и 2014 гг. от тяжелой пневмонии военнослужащих был выявлен аденовирус серотипа 7. При исследовании аутопсийного материала, поступившего в референс-центр ЦНИИЭ за 2014 г. из регионов РФ с целью определения этиологии тяжелой пневмонии, закончившейся летально, аденовирусы были обнаружены у 2 пациентов. В одном случае аденовирус был отнесен к серотипу 7, в другом случае - к серотипу 5. ОБСУЖДЕНИЕ Данная работа продемонстрировала высокую эффективность метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени при изучении этиологической структуры ОРВИ у детей и взрослых. За исследованные годы в этиологической структуре ОРВИ у детей превалировали респираторно-синцитиальный вирус (10,6% от всех исследованных образцов) и риновирусы (14,4%), у взрослых - вирус гриппа А (21% от исследованных образцов). Следует отметить, что в этиологической структуре больных взрослых отсутствовал респираторно-синцитиальный вирус, это, по-видимому, связано с тем, что выборка формировалась в год низкой активности респираторно-синцитиальной инфекции, когда у детей он также выявлялся гораздо реже по сравнению с предшествовавшим и последующим годами. В этиологической структуре данной выборки аденовирус занимает пятое место среди вирусов в этиологической структуре респираторных заболеваний у детей (3,9% случаев в виде моноинфекции и дополнительно 3% в составе сочетанной инфекции с другими респираторными вирусами) и седьмое - у взрослых (2,9% в виде моноинфекции). При этом 73,1% инфицированных детей составляли дошкольники. По результатам данного исследования были идентифицированы 9 серотипов 3 видов аденовирусов, вызывавших респираторные заболевания в течение 10 лет в Москве. Наиболее распространенными являлись виды B и С, как и в большинстве стран [8, 13, 19], несколько реже выявлялся вид E. В циркуляции аденовирусов B и C наблюдаются сезонные изменения: роль вида C в этиологии аденовирусных инфекций возрастает в теплое время года, а вида B - в холодное. Полученное распределение частот обнаружения различных серотипов аденовируса в целом схоже с таковым для ряда других стран [8, 13, 19]. Наиболее часто встречаются аденовирусы 3 и 2 серотипов. Серотип 3 был преобладающим и по результатам предыдущих российских исследований [1, 2], но в целом распределение видов и серотипов аденовируса изменилось. Так, доля вида B в структуре аденовирусных заболеваний по данным настоящего исследования ниже (46%), а доля вида С (41%) и Е (11%) выше, чем наблюдалась в исследовании конца 50-х годов прошлого века: 88; 10 и 0,6% соответственно [1, 2]. Наиболее часто респираторная аденовирусная инфекция обнаруживается у детей дошкольного возраста, некоторые авторы объясняют это наличием пассивного иммунитета у новорожденных и постинфекционного иммунитета у детей старшего возраста, что подтверждается иммунологической структурой населения [11]. Было обнаружено, что с увеличением возраста пациентов доля аденовирусных инфекций, вызванных видом С, уменьшается, а видом B - возрастает. Аденовирусы чаще обнаруживались в группе госпитализированных детей, чем у находившихся на амбулаторном лечении (7,5% vs 2,7% p<0,001), что может косвенно свидетельствовать о достаточно тяжелом течении аденовирусной инфекции. Аденовирусы серотипов 2 (вид С) и 3 (вид B) обнаруживались у детей с разнообразными топическими диагнозами респираторной инфекции, при этом в случае отитов доминирующим являлся серотип 2. Зарубежные авторы также отмечали, что не всегда прослеживается четкая зависимость между серотипом аденовируса и клинической картиной заболевания [1]. В группе ОРВИ с кишечными симптомами чаще обнаруживался серотип 3, в случае пневмоний преобладали серотипы 3 и 7 (вид В), при фарингитах и трахеитах чаще обнаруживался серотип 4 (вид Е). В группе детей, больных ОРВИ с симптомами острой кишечной инфекции, аденовирусы в назофарингеальных мазках обнаруживались чаще, чем у остальных пациентов (р<0,025). Аденовирусы, выявленные у 0,4% обследованных условно здоровых детей, принадлежали к виду C серотипам 1 и 2, что отмечали и другие авторы [6]. Это может быть связано с тем, что аденовирусы способны в течение нескольких месяцев после перенесенной инфекции оставаться в тканях [16]. Кроме того, возможна латентная инфекция лимфоидной ткани глоточного кольца, которую вызывают аденовирусы серотипов 1, 2, 5, реже 6 [10]. Использованный для диагностики набор реагентов преимущественно выявляет ДНК респираторных аденовирусов (В, С, Е), но может обнаруживать и другие виды, близкие по нуклеотидной последовательности гена гексона. Так, в нашем исследовании в двух случаях у детей, госпитализированных с ОРВИ, был обнаружен аденовирус F (серотип 41), ассоциированный с кишечной инфекцией. Известно, что аденовирусы этого серотипа нередко наряду с симптомами кишечной инфекции вызывают симптоматику ОРВИ. Серотипы 4 и 7 являлись причиной вспышек аденовирусной инфекции у военнослужащих, что отмечается и в других странах [7, 17, 20]. По-видимому, причиной служит отсутствие анамнестических антител к серотипам 4 и 7 у большинства людей призывного возраста, что подтверждается данными настоящего исследования относительно более низкой частоты обнаружения аденовирусов этих серотипов у детей по сравнению с серотипами 2 и 3. В случаях летального исхода от пневмонии у взрослых как военных, так и гражданских обнаруживался преимущественно серотип 7. Значение аденовирусов серотипа 7 в развитии тяжелых инфекций отмечают и другие авторы [9, 12]. В заключение следует сказать, что не являясь причиной крупных эпидемий, аденовирус круглогодично вызывает заболевания респираторного тракта у детей и взрослых, повышая свою активность с октября по декабрь. На пике активности аденовирусная инфекция обнаруживается у 10% заболевших ОРВИ. Вызывая разнообразные клинические формы, аденовирусная инфекция протекает достаточно тяжело, требует госпитализации, и в ряде случаев заболевание заканчивается летальным исходом, что, по-видимому, связано с более высокой вирулентностью определенных серотипов аденовируса и является основанием для более глубоких исследований в этой области. Авторы признательны сотрудникам больниц, поликлиник, а также 988 ЦГСЭН М.О., ЦГиЭ Роспотребнадзора в регионах РФ, организовывавшим и принимавшим участие в формировании банка биологического материала, и лично Малышеву Н.А., Вартанян Р.В., Ким С.С., Краснову П.П., Швец Е., Белошицкому Г.В., Зверевой З., Петуховой Е., Хлыповка Ю., Коновалову А.В., Магкоевой З.Г., Шелковской Л.П., Перевозчиковой Л.А., Андроновой М.М. Л ИТЕРАТУРА

About the authors

S. B Yatsyshina

Research Institute of Epidemiology

M. R Ageeva

Research Institute of Epidemiology

N. S Vorobieva

Research Institute of Epidemiology

A. V Valdokhina

Research Institute of Epidemiology

M. A Elkina

Research Institute of Epidemiology

A. V Gorelov

Research Institute of Epidemiology

V. V Maleev

Research Institute of Epidemiology

V. I Pokrovsky

Research Institute of Epidemiology

References

Supplementary files