Detection of genetic determinants of potentially oncogenic representatives of the intestinal microbiota as biomarkers of colorectal cancer

Full Text

Введение

Колоректальный рак (КРР) является 3-м по распространённости видом рака и 2-й по значимости причиной смертности от рака в мире [1]. Обращает на себя внимание тренд на рост заболеваемости КРР среди лиц моложе 50 лет [2]. Для выявления онкологических заболеваний толстой кишки применяются неинвазивные (тест на скрытую кровь в стуле, гваяковый тест и фекальный иммунохимический тест (ФИТ)) и инвазивные (гибкая ректороманоскопия, колоноскопия) методы диагностики. Очевидными преимуществами неинвазивных методов диагностики являются их простота и доступность для скрининговых обследований лиц из групп риска.

Использование в скрининговых исследованиях методов неинвазивной диагностики, таких как ФИТ, позволяет добиться снижения смертности от КРР на 27% [3]. Метаанализ результатов 4 рандомизированных контролируемых исследований продемонстрировал, что применение гваякового теста и гибкой ректороманоскопии способствует снижению смертности от КРР на 18 и 26% соответственно [4].

Однако существенным недостатком неинвазивных методов является их невысокая диагностическая чувствительность на ранних стадиях заболевания. Так, чувствительность ФИТ на I стадии КРР составляет 68% (95% ДИ 57–78%), на II — 92% (95% ДИ 87–96%), на III — 82% (95% ДИ 73–89%) [5]. Таким образом, существует необходимость расширения арсенала доступных неинвазивных методов для скрининга КРР.

В качестве диагностических маркеров КРР могут выступать особенности количественного и качественного состава микробиоты, что подробно рассмотрено в обзорах, посвящённых роли кишечной микробиоты в развитии и диагностике онкологических заболеваний кишечника [6, 7]. Многочисленные исследования выявили изменения в составе микробиома кишечника, ассоциированные с развитием КРР, что позволяет предположить возможность использования идентификации отдельных представителей кишечного микробиома в качестве самостоятельного метода неинвазивной диагностики КРР или дополнения к существующим неинвазивным методам.

Первая модель классификации, основанная на микробных маркерах кишечника и позволявшая отличать пациентов с КРР от контроля, была предложена G. Zeller и соавт. [8]. Алгоритм классификации включал данные об относительной численности 22 видов микроорганизмов (МО), однако по крайней мере половину предсказательной силы модели определяли всего 4 вида: два вида Fusobacterium, Porphyromonas asaccharolytica и Peptostreptococcus stomatis, представленность каждого из которых была повышена при КРР.

Авторы из Китайского университета Гонконга разработали диагностическую модель, демонстрирующую специфичность 81,2% и чувствительность 93,8% при сочетании ФИТ и 4 бактериальных маркеров (ген-маркер “m3” “Lachnoclostridium” sp., Fusobacterium nucleatum, Hungatella hathewayi (базоним: Clostridium hathewayi) и Bacteroides clarus) [9]. В более раннем исследовании экспериментальная модель на основе 23 МО семейств Oscillospiraceae (гетеротипический синоним: Ruminococcaceae) и Lachnospiraceae, родов Bacteroides, Porphyromonas, Parabacteroides, Collinsella и семейства Enterobacteriaceae выявила в выборке из 490 пациентов 91,7% случаев КРР по сравнению с 75,0% случаев, выявленных с помощью ФИТ [10].

К числу МО, наиболее тесно ассоциированных с КРР, относятся как некоторые патобионты полости рта, так и кишечные бактерии. Первые, помимо уже упомянутых представителей родов Fusobacterium, Porphyromonas и Peptostreptococcus, включают Parvimonas micra, Gemella morbillorum, Tannerella forsythia и некоторые другие виды [11]. Кишечные бактерии чаще всего представлены энтеротоксигенными штаммами Bacteroides fragilis, патогенными и условно-патогенными бактериями семейства Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella pneumoniae, Citrobacter rodentium), а также Campylobacter jejuni, Morganella morganii, Enterococcus faecalis, Clostridioides difficile и др. [12].

На основании результатов обзора литературы были отобраны МО, наиболее часто ассоциированные с КРР по данным исследований. К числу потенциально онкогенных МО мы отнесли колибактин-продуцирующие энтеробактерии, несущие гены clbA и clbB в составе острова патогенности pks, фрагилизин-продуцирующие Bacteroides fragilis, несущие ген bft, пародонтопатогенные бактерии Fusobacterium nucleatum и Porphyromonas gingivalis [6]. Дополнительным фактором в пользу включения указанных МО в список потенциальных онкогенов послужила их связь со стадийностью (прогрессированием) КРР, прогнозом/выживаемостью и резистентностью к терапии у пациентов с КРР [13, 14].

С учётом вероятных региональных, этнических и прочих особенностей количественного и качественного состава кишечной микробиоты, актуальна оценка распространённости указанных выше потенциально онкогенных МО среди населения России и их роли в развитии КРР.

Целью настоящего исследования является оценка возможности использования генетических детерминант потенциально онкогенных МО в качестве маркеров КРР, основанная на сопоставлении их распространённости в группах пациентов с КРР, факультативными предраковыми состояниями и пациентов без патологии кишечника.

Материалы и методы

На базе клинических подразделений Клиники им. Петра Великого СЗГМУ им. И.И. Мечникова и Городского онкологического диспансера Санкт-Петербурга в 2022–2024 гг. проведено исследование «случай–контроль». В исследовании приняли участие 215 человек: группа из 70 пациентов с диагностированным КРР (группа КРР); группа из 70 пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (язвенный колит, болезнь Крона — группа ВЗК); 75 участников без диагностированной патологии кишечника (контрольная группа). Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов и было одобрено на заседании Локального этического комитета СЗГМУ им. И.И. Мечникова (протокол № 10 от 03.11.2021).

В группе пациентов с КРР распределение по стадиям онкологического процесса с учётом классификации TNM было следующим: 0 стадия — 1 пациент; I стадия — 17 пациентов; II — 13 пациентов; III — 37 пациентов; IV — 12 пациентов.

Критерии включения в исследование пациентов из группы КРР: возраст старше 18 лет; установленный впервые на основании данных анамнеза, физикального обследования, морфологического исследования опухолевого материала, данных инструментальных и лабораторных методов обследования диагноз КРР; получение от пациента клинического материала (кал).

Критерии включения в исследование пациентов из группы ВЗК: возраст старше 18 лет; установленный диагноз ВЗК.

Критерии включения в исследование пациентов из контрольной группы: возраст старше 18 лет; отсутствие диагностированных ВЗК и КРР.

Критерии исключения для всех групп исследования: приём антибактериального препарата за последние 30 дней и/или прохождение эндоскопического исследования (колоноскопии, ректороманоскопии) за последние 14 дней до сдачи клинического материала (кал).

Образцы клинического материала, полученные от участников исследования, до проведения молекулярно-генетических исследования хранили при температуре –20ºС.

ДНК из образцов фекалий для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) выделяли методом сорбции на магнитных частицах с использованием набора реагентов «MetaFec» («Raissol»). В постановке ПЦР были применены последовательности праймеров, использованные ранее для идентификации потенциально онкогенных МО (табл. 1).

 

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров для идентификации потенциально онкогенных МО

Table 1. Nucleotide sequences of primers for identification of potentially oncogenic microorganisms

Детектируемый ген Target gene	Номер доступа в GenBank GenBank Accession number	Прямой праймер/обратный праймер Forward primer/reverse primer	Источник Source
Ген clbA pks+ (поликетидсинтаза) E. coli The clbA pks+ (polyketide synthase) gene of E. coli	CP155641.1	5'-CTCCACAGGAAGCTACTAAC-3' 5'-CGTGGTGATAAAGTTGGGAC-3'	[15]
Ген clbB pks+ (поликетидсинтаза) E. coli Тhe clbB pks+ (polyketide synthase) gene of E. coli	CP155641.1	5'-GCAACATACTCGCCCAGACT-3' 5'-TCTCAAGGCGTTGTTGTTTG-3' probe FAM (5'-CAAGGTGCGCGCTAGGCTGT-3');	[16]
Ген фрагилизина (bft), синтезируемого энтеротоксигенным B. fragilis Тhe fragilisin (bft) gene synthesized by enterotoxigenic B. fragilis	AF103902.1	5'-GAACCTAAAACGGTATATGT-3' 5'-GTTGTAGACATCCCACTGGC-3'	[15]
Ген адгезина fadA F. nucleatum fadA adhesion protein gene of F. nucleatum	DQ012973.1	5'-GCAGTTTCTGCTTCAGCATTT-3' 5'-TGCTTGAAGTCTTTGAGCTCTTT-3'	[17]
Ген биоплёнкообразования fimA P. gingivalis fimA gene for biofilm formation of P. gingivalis	AB195793.1	5'-TGCGACGCTATATGCAAGAC-3' 5'-TCTTCAAAACCACGCTGATG-3'	[17]

 

Для идентификации потенциально онкогенных МО была проведена количественная ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (термоциклер «Bio-Rad CFX96») для clbB pks+ и качественная ПЦР (термоциклер «Bio-Rad T100 Thermal Cycler») с электрофоретической детекцией для остальных маркеров.

Случаев неспецифической амплификации выявлено не было.

Валидацию результатов амплификации маркерных генов проводили методом капиллярного секвенирования ампликонов на приборе «GenomeLab GeXP» («Beckman Coulter, Inc.»), при этом во всех случаях были получены последовательности, соответствующие последовательностям целевых фрагментов маркерных генов, представленным в GenBank (табл. 1). Аликвоты тотальной ДНК из первых 5 образцов биологического материала, в которых были получены положительные результаты ПЦР, после подтверждения специфичности амплификации секвенированием были использованы в качестве положительных контролей, а в качестве отрицательного контроля служила стерильная деионизированная вода.

Для статистической обработки данных была использована программа «R» («RStudio»). Для количественной оценки связи потенциально онкогенных МО с КРР определяли показатели отношения шансов (ОШ) и 95% доверительные интервалы (ДИ) к ним. Чувствительность, специфичность и ДИ были рассчитаны с помощью программы «Epitools»¹. Статистически значимыми считали результаты при p < 0,05.

Результаты

Исследование образцов клинического материала методом ПЦР позволило определить частоты обнаружения генетических маркеров потенциально онкогенных МО у пациентов с КРР на различных стадиях заболевания и в группах сравнения (рисунок). У пациентов с КРР выявлена более высокая распространённость потенциально онкогенных маркеров по сравнению с пациентами с ВЗК и участниками контрольной группы. Прослеживается прямая связь между стадией онкологического заболевания и распространённостью потенциально онкогенных маркеров, в частности ДНК F. nucleatum, а также обращает на себя внимание более высокая частота обнаружения пародонтопатогенных МО на поздних стадиях онкологического процесса. На ранних стадиях опухоли превалируют колибактин-продуцирующие бактерии, несущие ген clbB острова патогенности pks.

 

Распространённость потенциально онкогенных МО у пациентов с КРР на различных стадиях заболевания и в группах сравнения.

The prevalence of potentially oncogenic microorganisms in patients with CRC at various stages of the disease and in comparison groups.

 

В ходе исследования «случай–контроль» отмечена ассоциация отдельных потенциально онкогенных представителей микробиома кишечника с КРР (табл. 2). Так, наличие гена bft энтеротоксигенного B. fragilis значимо различается в группах пациентов с ВЗК и пациентов с КРР и ассоциировано с микробиомом пациентов с КРР (ОШ = 3,25; 95% ДИ 1,16–10,6; p = 0,033). Кроме того, обнаружена более высокая распространённость данного гена у пациентов с КРР по сравнению с пациентами с ВЗК, а в образцах от участников контрольной группы ген фрагилизина энтеротоксигенного B. fragilis не обнаружен.

 

Таблица 2. Представители кишечного микробиома, ассоциированные с КРР

Table 2. Representatives of the intestinal microbiome associated with CRC

Детектируемый ген Target gene	КРР, n (%) CRC, n (%)	ВЗК, n (%) IBD, n (%)	Контроль, n (%) Control, n (%)	ОШ (95% ДИ) | OR (95% CI)
				КРР/ВЗК CRC/IBD	КРР/контроль CRC/Control	КРР + ВЗК/контроль CRC + IBD/Control	КРР/ВЗК + контроль CRC/IBD + Control
Ген фрагилизина bft энтеротоксигенного B. fragilis Fragilisin bft gene of enterotoxigenic B. fragilis	14 (20%)	5 (7,1%)	0 (0%)	3,25 (1,16–10,6)	∞	∞	7 (2,55–22,5)
Ген адгезина fadA F. nucleatum fadA adhesion protein gene of F. nucleatum	31 (44%)	14 (20%)	4 (5,3%)	3,18 (1,52–6,9)	14,1 (5,13–50,1)	8,41 (2,89–24,46)	5,61 (2,87–11,3)
Ген биоплёнкообразования fimA P. gingivalis fimA gene for biofilm formation of P. gingivalis	13 (19%)	2 (2,9%)	0 (0%)	7,75 (2,03–50,9)	∞	∞	16,3 (4,33–106)
Ген clbA острова патогенности pks E. coli Тhe gene clbA of the pks pathogenicity island of E. coli	7 (10%)	9 (13%)	3 (4,0%)	0,75 (0,25–2,15)	2,67 (0,71–12,8)	3,09 (0,87–10,99)	1,23 (0,44–3,21)
Ген clbB острова патогенности pks E. coli Тhe gene clbB of the pks pathogenicity island of E. coli	13 (19%)	6 (8,6%)	3 (4,0%)	2,43 (0,9–7,31)	5,47 (1,49–20,14)	3,77 (1,08–13,18)	3,44 (1,39–8,51)

Примечание. ∞ — в связи с нулевым значением знаменателя рассчитать показатель ОШ не представляется возможным.

Note. ∞ — due to the zero value of the denominator, it is not possible to calculate the OR indicator.

 

По данным проведённого исследования установлено, что наличие ДНК пародонтопатогенного МО F. nucleatum ассоциировано с КРР, и частота её обнаружения различается в группе случаев и контрольных группах. У пациентов с ВЗК наличие ДНК другого пародонтопатогенного МО — P. gingivalis (ОШ = 7,75; 95% ДИ 2,03–50,9; p = 0,009) ассоциировано с КРР.

Частота идентификации ДНК F. nucleatum была выше у пациентов с КРР (44%) по сравнению с пациентами с ВЗК (22%) и участниками контрольной группы (5,3%). Была обнаружена высокая частота выявления ДНК P. gingivalis у пациентов с КРР (в 19% образцах) по сравнению с пациентами с ВЗК (в 2,9% образцах), ДНК P. gingivalis не обнаружена у участников контрольной группы.

В ходе исследования обнаружено, что наличие гена clbB острова патогенности pks энтеробактерий (ОШ = 5,47; 95% ДИ 1,49–20,14; p = 0,015) ассоциировано с КРР и позволяет отделить микробиом пациентов с этой патологией от микробиома участников контрольной группы. Детектируемый ген clbB острова патогенности pks энтеробактерий обнаружен в 19% образцах пациентов с КРР, в 8,6% — у пациентов с ВЗК, в 4% — у участников контрольной группы. Напротив, частота идентификации гена clbA не различалась в группах сравнения. Ген clbА выявлен в 10% образцах у пациентов с КРР, в 13% — у пациентов с ВЗК, в 4% — у участников контрольной группы.

У пациентов с КРР частота обнаружения маркеров потенциально онкогенных МО не зависела от локализации опухоли: детекция F. nucleatum в опухоли дистального расположения — в 14 случаях, проксимального расположения — в 15; P. gingivalis — в 5 и 7 случаях; гена clbB острова патогенности pks энтеробактерий — в 6 и 7 случаях; гена clbА — в 2 и 5 случаях; гена фрагилизина bft энтеротоксигенного B. fragilis — в 6 и 7 случаях соответственно. Не выявлено значимых различий, связанных с морфологическим типом опухоли (обнаружение F. nucleatum в 18 случаях высокодифференцированной опухоли, в 13 случаях низкодифференцированной опухоли; P. gingivalis — в 6 и 7 случаях; гена clbB острова патогенности pks энтеробактерий — в 7 и 6 случаях; гена clbА — в 4 и 3 случаях; гена фрагилизина bft энтеротоксигенного B. fragilis — в 6 и 8 соответственно). Таким образом, детекция маркеров потенциально онкогенных МО позволяет различать КРР вне зависимости от локализации и морфологического типа опухоли.

С учётом полученных данных, нами рассчитаны показатели чувствительности и специфичности диагностического теста, позволяющего различить микробиомы пациентов с КРР и микробиомы пациентов с ВЗК и участников контрольной группы при отдельном и совместном обнаружении генетических детерминант потенциально онкогенных МО (табл. 3). Оптимальным (по сочетанию чувствительности и специфичности) представляется вариант тестирования, при котором учитывается факт идентификации ДНК хотя бы 1 из 5 потенциальных микробных онкомаркеров.

 

Таблица 3. Характеристика чувствительности и специфичности идентификации потенциально онкогенных МО для диагностики КРР

Table 3. Characterization of sensitivity and specificity of identification of potentially oncogenic microorganisms for the diagnosis of CRC

Параметр метода диагностики Parameter of the diagnostic method	КРР, n CRC, n	ВЗК + контроль, n IBD + control, n	Чувствительность, % (95% ДИ) Sensitivity, % (95% CI)	Специфичность, % (95% ДИ) Specificity, % (95% CI)
Обнаружение гена clbА Detection of the clbA gene	7	11	10 (5–19)	92 (86–95)
Обнаружение гена фрагилизина bft энтеротоксигенного B. fragilis Detection of the fragilisin bft gene of enterotoxigenic B. fragilis	14	5	20 (12–31)	97 (92–99)
Обнаружение гена адгезина fadA F. nucleatum Detection the fadA adhesion protein gene of F. nucleatum	31	18	44 (33–56)	88 (81–92)
Обнаружение гена биоплёнкообразования fimA P. gingivalis Detection the fimA gene for biofilm formation of P. gingivalis	13	2	19 (11–29)	99 (95–99)
Обнаружение гена clbB Detection of the clbB gene	13	9	19 (11–29)	94 (89–97)
Обнаружение 1 и более МО Detection of 1 or more microorganisms	36	27	51 (39–64)	81 (74–87)
Обнаружение 2 и более МО Detection of 2 or more microorganisms	22	10	31 (21–44)	93 (88–97)
Обнаружение 3 и более МО Detection of 3 or more microorganisms	12	4	17 (9–28)	97 (93–99)
Обнаружение 4 и более МО Detection of 4 or more microorganisms	6	3	9 (3–18)	98 (94–100)
Обнаружение 5 и более МО Detection of 5 or more microorganisms	2	2	3 (0,35–10,00)	99 (95–100)

 

Обсуждение

В настоящем исследовании мы оценили распространённость потенциально онкогенных МО, ассоциированных с КРР, среди жителей российского мегаполиса с диагностированными КРР, ВЗК и лиц без патологии кишечного тракта.

Известно, что B. fragilis является комменсальным представителем микробиоты кишечника. В желудочно-кишечном тракте представлены как нетоксигенные штаммы B. fragilis (не связанные с КРР) [18], так и энтеротоксигенные B. fragilis, синтезирующие фрагилизин — токсин, который расщепляет белок клеточной адгезии Е-кадгерин, нарушая кишечный барьер и способствуя развитию диареи [19]. Кроме того, данный токсин может активировать реализацию сигнального пути Wnt/β-катенина, способствуя пролиферации клеток, индукции выработки медиаторов воспаления и канцерогенезу [20]. Токсин B. fragilis кодируется геном bft с 3 изотипами (bft 1, bft 2, bft 3), который расположен на острове патогенности (PAI) и фланкирован генами, кодирующими белки мобилизации и представляющими собой последовательности конъюгативных транспозонов CTn86 и CTn9343. Нетоксигенные штаммы B. fragilis не обладают островом патогенности, но при наличии конъюгативных транспозонов у некоторых штаммов PAI может переходить от энтеротоксигенного B. fragilis к нетоксигенным штаммам B. fragilis [21]. Установлена роль энтеротоксигенного B. fragilis в качестве «водителя» в модели «водитель–пассажир», которая заключается в повреждении бактериями-«водителями» эпителиальной ДНК, что приводит к развитию канцерогенеза и изменению микробного сообщества, далее в процессе онкогенеза «водители» вытесняются комменсальными бактериями-«пассажирами», обладающими стимулирующими опухоль свойствами [22]. Энтеротоксигенные штаммы B. fragilis способны ингибировать экзосомальную микроРНК miR-149-3p, опосредующую межклеточные взаимодействия путём модуляции дифференцировки клеток Th17, способствуя воспалению и канцерогенезу в кишечнике [23].

Выявленная в ходе нашего исследования ассоциация энтеротоксигенного B. fragilis с КРР подтверждена в разных этнических когортах. К примеру, в популяции жителей Ирана частота детекции гена bft в биопсийных образцах толстой кишки пациентов с КРР варьировала от 30,5 до 47% по сравнению с участниками контрольной группы — до 6,25% биопсийных образцов [24, 25]. При этом среди пациентов из Тегерана с язвенным колитом обнаружена более высокая распространённость энтеротоксигенного B. fragilis в образцах биопсии по сравнению с лицами без патологии кишечника [26]. В канадской и французской когортах пациентов с КРР была выявлена высокая распространённость энтеротоксигенного B. fragilis (до 32% образцах) по сравнению с лицами контрольной группы [15, 19]. Результаты европейского проспективного исследования питания и рака (EPIC) показали, что в европейской когорте IgA- и IgG-серопозитивность к энтеротоксигенному B. fragilis и генотоксичной E. coli была значимо связана с развитием КРР [27].

F. nucleatum является грамотрицательным неспорообразующим облигатным анаэробным МО семейства Fusobacteriaceae и доминирующим МО в биоплёнках зубного налёта [28]. F. nucleatum способствует канцерогенезу и метастазированию посредством множества механизмов: способствует размножению миелоидных супрессорных клеток; ускоряет апоптоз Т-клеток, подавляет пролиферацию Т-клеток, тем самым организуя микроокружение опухоли, способствующее онкогенезу и метастазированию; вызывает экспрессию белка молекулярной структуры S100A9 и запускает активацию макрофагов M2 посредством ядерного фактора-κB, тем самым активизируя пролиферацию и миграцию опухолевых клеток; стимулирует пролиферацию регуляторных Т-клеток Foxp3⁺ и ингибирование пролиферации и функции эффекторных Т-клеток, препятствуя противоопухолевому иммунному ответу; вызывает секрецию циркулирующих экзосом, усиливая инвазию опухоли; кроме того, описана возможная роль F. nucleatum в резистентности при иммунотерапии и химиотерапии опухолей [29]. Ключевым фактором вирулентности/онкогенности F. nucleatum является адгезин FadA, регулирующий экспрессию аннексина А1 посредством E-кадгерина. Индукция аннексина А1, являющегося модулятором Wnt/β-катенина, специфически стимулирует клетки колоректальной карциномы, способствуя прогрессированию КРР [30]. Кроме того, F. nucleatum стимулирует воспалительные и антиапоптотические реакции в клетках КРР посредством высвобождения АДФ-гептозы и активации оси ALPK1/TIFA [31]. Недавно охарактеризована отдельная клада Fna C2 F. nucleatum, ассоциированная с КРР, которая обладает повышенной вирулентностью [32].

По мнению J. Jones и соавт., именно F. nucleatum и энтеротоксигенный B. fragilis представляют собой два ключевых патобионта, способствующих онкогенному перепрограммированию эпителиальных клеток кишечника [11].

P. gingivalis является анаэробной бактерией полости рта, вызывающей хронический пародонтит. За последнее десятилетие выявлены механизмы, с помощью которых P. gingivalis способствует прогрессированию опухоли, стимулирует клеточную инвазию и метастазирование опухолевых клеток. Данные механизмы включают усиление экспрессии провоспалительных факторов и матриксных металлопротеиназ, которые разрушают базальные мембраны и внеклеточный матрикс эпителия кишечника [33].

По данным исследований обнаружена связь между наличием пародонтопатогенных бактерий в образцах фекалий и биопсийном материале с КРР. В исследовании «случай–контроль» с использованием метагеномного секвенирования выявлено, что частота детекции Fusobacterium была выше у больных КРР (31,9% против 11,7% у контрольной группы) и развитие КРР связано с наличием F. nucleatum (ОШ = 4,11; 95% ДИ 1,62–10,47; p = 0,004) и P. gingivalis (ОШ = 5,17; 95% ДИ 1,75–15,25; p = 0,001) [34]. В проведённом во Франции исследовании выявлено, что распространённость F. nucleatum среди пациентов с КРР (70,4%) была выше по сравнению с лицами без патологии кишечника [19].

P. gingivalis и F. nucleatum, бактерии полости рта, относящиеся к так называемым «красному» и «оранжевому» комплексам, способны не только индуцировать хроническое воспаление, но и способствовать онкогенезу как в полости рта, так и в кишечнике, обладая, возможно, синергетическим действием [35].

Следует также отметить, что все три онкогенные бактерии (F. nucleatum, B. fragilis и P. gingivalis) потенциально связаны не только с развитием КРР, но и с худшим прогнозом для пациентов (более низкой выживаемостью) [13, 14]. Кроме того, результаты нашего исследования свидетельствуют о наличии прямой связи между стадией онкологического процесса и распространённостью пародонтопатогенных МО F. nucleatum и P. gingivalis.

Различными авторами также обнаружена связь колибактин-продуцирующих генотипов энтеробактерий с КРР. Колибактин — генотоксин, вызывающий двухцепочечные разрывы ДНК, остановку клеточного цикла, хромосомную нестабильность в эукариотических клетках. Он синтезируется сборочной линией нерибосомной поликетидсинтазы (pks), состоящей из 19 генов (от clbA до clbS), расположенных на геномном острове размером 54 т. п. н. [36]. Островок pks присутствует в геномах K. pneumoniae, K. aerogenes (базоним: Enterobacter aerogenes), Citrobacter koseri, в филогенетических группах E. coli [19]. Инфицирование может происходить на ранних этапах онтогенеза: известно, что передача колибактин-продуцирующих генотипов энтеробактерий происходит в перинатальном периоде при прохождении через родовые пути (ген clbВ выявлен у 87,5% детей, родившихся естественным путём, у 12,5% — путём кесарева сечения) и в результате грудного вскармливания [37]. Частота детекции гена clbN была выше у пациентов с КРР (49,4%) по сравнению с участниками контрольной группы (24%; p < 0,005), при этом высокая распространённость (72,2%) обнаружена на последней стадии (IV) по сравнению с КРР стадии I/II (42,3%; р < 0,05) и КРР III стадии (43,2%; р < 0,05) [19]. В исследовании на японской когорте (543 случаев колоректальной неоплазии (22 КРР и 521 аденома), 425 участников контрольной группы) pks⁺-E. coli обнаружена в 32,6% образцах фекалий у пациентов с колоректальной неоплазией и в 30,8% — у участников контрольной группы [38]. Также среди канадской когорты обнаружено, что частота колонизации бактериями pks⁺ не различалась среди участников контрольной группы (42%) и пациентов с КРР (46%), примечательно, что pks⁺-бактерии были распространены на поздних стадиях КРР (40/79; 52%) по сравнению с ранней стадией опухоли (3/15; 20%; р < 0,05) [15]. В когортном исследовании pks⁺-E. coli обнаружена в 9,44% (111/1175) биопсийных образцах пациентов с КРР, при этом ДНК pks⁺-E. coli обратно пропорционально связано со стадией опухолевого процесса (p = 0,008) [16]. В ходе нашего исследования выявлена высокая распространённость гена clbB острова патогенности pks⁺-E. coli на I стадии онкологического процесса.

Заключение

Результаты проведённого исследования позволяют заключить, что КРР у пациентов крупного мегаполиса ассоциирован с наличием в составе кишечного микробиома генов потенциально онкогенных бактерий, в частности видоспецифических генов пародонтопатогенов F. nucleatum, P. gingivalis, гена токсина-фрагилизина bft B. fragilis, гена поликетидсинтазы clbB острова патогенности pks энтеробактерий. Полученные результаты согласуются с современными представлениями о патогенетической роли этих бактерий и/или их токсинобразующих штаммов при КРР.

Молекулярно-генетическая детекция вышеуказанных генетических детерминант потенциально онкогенных МО может быть применена в качестве метода неинвазивной диагностики КРР вне зависимости от локализации и морфологического типа опухоли как отдельно, так и совместно с другими рекомендованными тестами.

С учётом имеющихся данных о связи данных бактерий со стадийностью/прогрессированием КРР, прогнозом/выживаемостью и резистентностью к иммунотерапии и химиотерапии, можно предположить возможность их использования в качестве неинвазивных биомаркеров для прогнозирования течения и исходов КРР, ответа на противоопухолевую терапию, а в перспективе для разработки соответствующих онкопрофилактических мероприятий, включая персонифицированную коррекцию дисбиоза полости рта и кишечника и/или их санацию.

 

¹ Epitools – Epidemiological Calculators.

About the authors

Viktoriya N. Shumilova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Author for correspondence.
Email: tori.lovas@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-4271-6530

postgraduate student, Department of epidemiology, parasitology and desinfectology, epidemiologist, Epidemiological department

Россия, Saint Petersburg

Artemij E. Goncharov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov; Institute of Experimental Medicine

Email: tori.lovas@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5206-6656

D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of functional genomics and proteomics of microorganisms, Professor, Department of epidemiology, parasitology and desinfectology

Россия, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Daniil V. Azarov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov; Institute of Experimental Medicine

Email: tori.lovas@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2483-5144

Cand. Sci. (Med.), assistant, Department of epidemiology, parasitology and desinfectology, research associate, Laboratory of functional genomics and proteomics of microorganisms

Россия, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Stanislav I. Sitkin

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov; Institute of Experimental Medicine; Almazov National Medical Research Centre

Email: tori.lovas@gmail.com
Scopus Author ID: 0000-0003-0331-0963

Cand. Sci. (Med.), Head, Epigenetics & metagenomics research group, Institute of Perinatology and Pediatrics, Associate Professor, Department of propaedeutics of internal diseases, gastroenterology and dietetics named after S.M. Ryss, leading researcher

Россия, Saint Petersburg; Saint Petersburg; Saint Petersburg

Elgudzha L. Latariya

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: tori.lovas@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9569-8485

Cand. Sci. (Med.), Associate Professor, Department of faculty surgery named after I.I. Grekov, Vice-rector for clinical work

Россия, Saint Petersburg

Batyrbek I. Aslanov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: tori.lovas@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6890-8096

D. Sci. (Med.), Associate Professor, Head, Department of epidemiology, parasitology and disinfectology; Head, Research laboratory of molecular epidemiology and bacteriophage research

Россия, Saint Petersburg

Mikhail A. Bobrakov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: tori.lovas@gmail.com
ORCID iD: 0009-0003-3003-8886

surgeon, oncologist, assistant, Department of hospital surgery named after V.A. Oppel

Россия, Saint Petersburg

Rustem E. Topuzov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: tori.lovas@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8168-6187

Cand. Sci. (Med.), surgeon, oncologist, Associate Professor, Department of hospital surgery named after V.A. Oppel

Россия, Saint Petersburg

References

Supplementary files