SPECIFIC IMMUNE RESPONSE TO CERTAIN CAPSULE POLYSACCHARIDES OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE IN HEALTHY BLOOD DONORS AND INDIVIDUALS IMMUNIZED WITH PNEUMOCOCCAL VACCINES

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В нашей стране зарегистрированы два типа пневмококковых вакцин: Pneumo-23 («Санофи Пастер», Франция) - полисахаридная, каждая доза которой содержит по 25 мкг каждого капсульного полисахарида, принадлежащим к 23 серотипам (1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F); Prevenar-13 («Пфайзер», США) содержит капсульные полисахариды тринадцати серотипов пневмококка (1, 3, 4, 5, 6А, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F), конъюгированных с генно-инженерным дифтерийным анатоксином. Доля каждого КПС составляет 2 - 4 мкг. В нашей стране также начата разработка пневмококковой вакцины на основе актуальных для территории РФ серотипов пневмококка. По данным литературы таковыми являются пневмококки 1, 2, 3, 4 и 14 серогрупп и 6А, 6В, 7F, 9N, 9V, 19A, 19F, 23F серотипов [1 - 3, 5]. Поскольку для контроля над распространением пневмококковой инфекции необходимо проводить мониторинг эффективности вакцинации, а очищенными КПС располагали лишь фирмы производители, ранее нами был использован иммуноферментный анализ, где в качестве иммуносорбента применяли полистирольные пластины, сорбированные вакцинными препаратами Pneumo-23 и Prevenar-7. На основании полученных результатов установлена эффективность вакцинации почти в 100% случаев [6]. Поскольку был прослежен только кумулятивный эффект вакцинации, необходимо было установить, к каким КПС в составе вакцин после иммунизации повышается уровень антител, а к каким нет, и как часто это происходит. Располагая в настоящее время препаратами очищенных КПС, наиболее часто встречающихся на территории РФ серогрупп и серотипов S.pneumoniae, мы провели исследование по оценки гуморального иммунного ответа (IgG) к 13 КПС пневмококка в ИФА у здоровых доноров крови и лиц, иммунизированных Pneumo-23 и Prevenar-13. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Капсульные полисахариды получали из культур свежевыделенных штаммов S. pneumoniae, выращенных на полусинтетической питательной среде. Этапы выделения включали: ультрафильтрацию и концентрирование, обработку ферментами, фенольную депротеинизацию и диализ. Полученные препараты содержали <5% денатурированного белка и <1% нуклеиновых кислот, основную долю составляли углеводы. Специфичность каждого КПС установлена с помощью РИЭФ и торможения иммуноферментного анализа, где каждый из препаратов давал «ракету» с соответствующей его серотипу гипериммунной кроличьей сывороткой, а в дозе 1 мкг/мл вызывал 100% торможение иммуноферментной реакции с теми же сыворотками в рабочем разведении 1:6400 - 1:12800. В исследовании использовали сыворотки 140 человек мужского и женского пола возрастом 20 - 55 лет, допущенных к сдачи крови; сыворотки 42 мужчин призывного возраста, кровь у которых брали до и через 1 - 2 месяца после плановой иммунизации вакциной Pneumo-23; сыворотки 5 лиц, часто и длительно болеющих бронхолегочными заболеваниями, кровь у которых забирали до и через 6 месяцев после двукратной вакцинации препаратом Prevenar-13. Исследование проводили в соответствии с национальным стандартом РФ (ГОСТ Р 52379-2005 «Национальная клиническая практика») и Международной практикой клинических исследований GCP. Сыворотки доноров исследовали только на наличие IgG к 13 КПС пневмококка. Сыворотки вакцинированных Pneumo-23 дополнительно исследовали на наличие антител к препарату Pneumo-23, а сыворотки иммунизированных Prevenar-13 - к препаратам Pneumo-23 и Prevenar-13. Анализ сывороток с иммуносорбентами на основе вакцинных препаратов проводили по [6]. Для анализа сывороток использовали метод твердофазного ИФА. С целью получения иммуносорбента (ИС) лунки отдельных полистирольных пластин («Greiner», Германия) сорбировали каждым из препаратов КПС (1, 3, 4, 6B, 6A, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F), растворенными в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) с рН 7,2 - 7,4 до концентрации 2 мкг/мл. Объем вносимого в лунку раствора КПС - 100 мкл. Длительность сорбции - 2 часа при 37°C и 16 - 18 часов при 8 - 10°C. После освобождения лунок от раствора антигена (АГ) в них вносили по 250 мкл ФСБ, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и оставляли на 30 мин при температуре 18 - 20°C. После освобождения от раствора в лунки вносили по 100 мкл рабочего разведения анализируемых сывороток (1:50 или 1:200) и выдерживали 60 мин при 18 - 20°С, отмывку лунок осуществляли физиологическим раствором, содержащим 4% Твина-20. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл рабочего разведения конъюгата (антитела диагностические против IgG человека, меченные перокси-дазой - производство ФНЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи), разведенного в ФСБ с БСА и инкубировали 30 мин при 18 - 20°С. После отмывки лунок пластин от несвязавшегося конъюгата вносили по 100 мкл субстратной смеси, содержащей ТМБ, и через 15 мин останавливали реакцию добавлением 50 мкл 0,9 М H2SO4. Оптическую плотность определяли при 450 нм на спектрофотометре «ЭФОС-9305» (ОАО «Сапфир», Москва). Результаты выражали в условных единицах (J), рассчитанных по формуле: J=[ОПаHaл.:(ОПк-+0,25)]х100. В качестве отрицательного контроля (К-) использовали пул сывороток 100 здоровых доноров станции переливания крови Москвы, стандартизованный по ОП в рабочем разведении 1:50 - 1:200. Разведение анализируемых сывороток достоверно не влияло на окончательный результат (p>0,05). Однако при разведении их 1:200 значения ОПК- находились в пределах 0,2 - 0,3. При этом фоновые значения (лунки без сывороток) для каждого КПС имели ОП<0,1. Поэтому в табл. представлены результаты при разведении 1:200. РЕЗУЛ ЬТАТЫ При анализе сывороток доноров (n=140) (табл. 1) было установлено, что уровень специфических антител к отдельным КПС в них находится в широком диапазоне значений - от 20 усл. ед. к КПС Pn-4 до 220 усл. ед. К КПС Pn-3. При этом средний нижний предел для большинства КПС составлял 30 - 40 усл. ед., а верхний - около 140 усл. ед. Расчет среднего значения уровня антител показал, что для большинства КПС он находился на уровне 70 усл. ед. (p>0,05). При этом для КПС Pn-3 J был больше 100 усл. ед., что связано с наличием лиц с высоким уровнем антител (АТ) к нему. Принимая во внимание высокий J для КПС Pn-3, расчет положительных реакций позволил выявить наличие диагностически значимого уровня АТ (J+28) только у 2/140 доноров (1,4%). Минимальная частота положительных реакций (0,7%) отмечена только у одного человека к КПС Pn-18C, а максимальная - у 6,4% доноров (9/140) к КПС Pn-9V Помимо указанных результатов данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о высокой специфичности ИФА (>90%). Проведенные исследования показали, что среди 140 доноров было только 14 человек (10,0±2,5%), у которых определяли диагностически значимый уровень IgG к одному или одновременно к нескольким КПС. Из них с одним из 13 КПС дали положительную реакцию 7 человек (5,0±1,8%). По одному человеку прореагировали с 2, 5, 6, 8 и 10 препаратами КПС (по 0,7%). У двух Таблица 1. Уровень IgG к отдельным капсульным полисахаридам S.pneumoniae у здоровых доноров №№ п/п Серотип или серогруппа КПС в составе ИС для ИФА Диапазон значений J (усл.ед) Средние значения J+5 (усл.ед.) Доля сывороток с Jcp.+25 (%) 1 Pn-1 30-150 73,0+27,3 4,3+1,7 2 Pn-3 40-220 109,0+41,1 14,0+1,0 3 Pn-4 20-130 65,0+22,2 2,9+1,4 4 Pn-6A 40-130 66,0+25,2 3,6+1,6 5 Pn-6B 20-160 65,0+24,7 2,1+1,2 6 Pn-7F 30-150 68,0+27,0 2,9+1,4 7 Pn-9N 30-110 51,0+20,4 3,6+1,6 8 Pn-9V 40-130 64,0+22,2 6,4+2,1 9 Pn-14 40-145 69,0+26,3 5,0+1,8 10 Pn18C 30-150 57,0+20,0 0,7+0,7 11 Pn19A 30-170 65,0+25,3 1,4+1,0 12 Pn19F 30-170 67,0+26,4 3,6+1,6 13 Pn-23F 40-160 58,0+27,3 3,6+1,6 человек выявили повышенный уровень АТ одновременно к четырем различным по специфичности КПС. При анализе сывороток людей, вакцинированных Pneumo-23 (табл. 2), было установлено, что в довакцинальном периоде уровень специфических АТ к отдельным КПС находился в более низком диапазоне значений (10 - 120 усл. ед.), чем у здоровых доноров. Среднее значение для большинства КПС в довакцинальном периоде составляло примерно 50 усл. ед., что ниже, чем у здоровых доноров (70 усл. ед.). В поствакцинальном периоде для большинства КПС пневмококка уровень АТ повышался не достоверно (p>0,05), в среднем на 30 усл. ед. Однако увеличение среднего значения J для КПС Pn-3, Pn-7F, Pn-4, Pn-18C и Pn-19F было в 1,7 - 1,8 раза. Для других КПС (Pn-6A, Pn-1, Pn-9V, Pn-14, Pn-23F) это увеличение было незначительным (1,1 - 1,3 раза). Помимо описанных был проведен анализ частоты повышения уровня антител к каждому КПС в поствакцинальном периоде. Установлено, что после вакцинации Таблица 2. Уровень IgG к отдельным капсульным полисахаридам S.pneumoniae и вакцины Pneumo-23 в дои поствакцинальном периоде (n=42) №№ п/п Серотип или серогруппа КПС в составе ИС для ИФА Диапазон значений J (усл.ед.) Средние значения J+5 (усл.ед.) Увеличение JoP. в поствакцинальном периоде (раз) Доля сывороток до после до после с повышенным уровнем АТ после вакцинации с пониженным или неизмененным уровнем АТ после вакцинации 1 Pn-1 20-110 4^ О 4^ О 52,0+23,6 68,0+20,4 1,3 68,0+20,4 28,6+7,0 2 Pn-3 20-90 40-160 45,0+12,0 80,0+26,4 1,8 90,5+4,5 9,5+4,5 3 Pn-4 100-110 40-170 58,0+20,9 100,0+31,8 1,7 81,0+6,1 19,0+6,0 4 Pn-6A ю о оо о 20-100 49,0+14,4 53,0+26,3 1,1 21,4+6,3 78,6+6,3 5 Pn-6B 20-110 20-150 46,0+15,7 68,0+31,2 1,5 69,0+7,1 31,0+12,8 6 Pn-7F 20-120 30-210 53,0+23,2 93,0+41,0 1,8 85,7+5,4 14,3+5,4 7 Pn-9N К) о оо о 40-120 48,0+14,5 66,0+24,5 1,4 59,5+7,6 40,5+7,6 8 Pn-9V 20-100 40-115 56,0+19,3 71,0+20,6 1,3 66,7+7,3 33,3+7,3 9 Pn-14 20-90 4^ О О 53,0+15,5 70,0+23,4 1,3 64,3+7,4 35,7+7,4 10 Pn18C 20-110 40-145 53,0+16,8 91,0+31,8 1,7 81,0+6,0 19,0+6,0 11 Pn19A 20-90 20-200 55,0+16,4 87,0+44,9 1,6 71,4+7,0 28,6+7,0 12 Pn19F 20-75 4^ О К) о 52,0+14,0 90,0+46,3 1,7 83,3+5,7 16,7+5,7 13 Pn-23F 20-110 40-150 58,0+17,6 77,0+25,4 1,3 73,8+6,8 26,2+6,8 14 Pneumo-23 20-110 20-260 60,0+20,4 183,0+48,6 3,0 92,9+4,0 7,1+4,0 Таблица 3. Уровень IgG к отдельным капсульным полисахаридам S.pneumoniae и вакцинам Pneumo-23 и Prevenar-13 в до- и поствакцинальном периоде (n=5) №№ п/п Серотип или серогруппа КПС в составе ИС для ИФА Диапазон значений J (усл.ед.) Средние значения J+5 (усл.ед.) Увеличение Jср. в поствакцинальном периоде (раз) Доля сывороток до после до после с повышенным уровнем АТ после вакцинации с пониженным или неизмененным уровнем АТ после вакцинации 1 Pn-1 75-150 90-170 81,0±45,1 104,0±41,0 1,3 4 1 2 Pn-3 50-145 70-160 89,0±38,1 104,0±46,9 1,2 3 2 3 Pn-4 60-110 70-170 78,0±21,7 120,0±44,4 1,5 4 1 4 Pn-6A 60-160 60-180 92,0±41,5 124,0±47,7 1,3 4 1 5 Pn-6B 60-150 60-190 93,0±38,0 115,0±49,5 1,2 3 2 6 Pn-7F 70-100 70-220 90,0±15,0 137,0±57,2 1,5 4 1 7 Pn-9N 60-140 60-160 88,0±33,0 96,0±38,5 1,1 1 4 8 Pn-9V 80-150 80-170 100,0±30,4 110,0±36,9 1,1 3 2 9 Pn-14 55-100 70-110 74,0±20,4 96,0±16,7 1,3 3 2 10 Pn18C 50-145 о оо о о\ 81,0±39,4 130,0±34,4 1,6 4 1 11 Pn19A 70-130 70-150 90,0±28,3 120,0±30,4 1,3 4 1 12 Pn19F 60-170 75-210 98,0±44,2 153,0±55,6 1,7 4 1 13 Pn-23F 75-150 75-170 93,0±32,5 116,0±43,2 1,2 3 2 14 Pneumo-23* 80-110** 100-140 92,0±13,0 119,0±16,7 1,3 5 0 15 Prevenar-13* 50-130** 130-170 76,0±31,3 154,0±16,1 2,0 5 0 П римечание. * Рабочее разведение сывороток для определения IgG к вакцинным препаратам 1:50; ** вакцина Prevenar-13 не содержит КПС 9N, а вакцина Pneumo-23 - КПС 6А. Pneumo-23 наиболее часто вырастал уровень IgG к КПС Pn-3 (90,5%), Pn-7F (85,7%), Pn-19F (83,3%), Pn-4 (81,0%), Pn-18C (81,0%), что, вероятно, свидетельствует о более высокой иммуногенности этих КПС в составе Pneumo-23. Наиболее слабым было повышение уровня АТ к КПС PN-6A, так как КПС этого серотипа пневмококка не входит в состав вакцины, а некоторое количество сывороток (21,4%) с повышенным уровнем АТ к нему может быть связано с перекрестными реакциями между КПС 6A и КПС 6В, которые отличаются лишь типом связи между моносахаридами. В дополнении к сказанному следует отметить, что 32 из 42 человек, вакцинированных Pneumo-23, не имели в поствакцинальном периоде увеличение уровня АТ хотя бы к одному из примененных в ИФА КПС пневмококка (76,1%). Один человек не имел повышенного уровня АТ к каждому из 13 КПС. Только 9 человек (21,4%) демонстрировали увеличение уровня АТ ко всем анализируемым КПС. При этом анализ тех же сывороток в ИФА, где в качестве антигена использована вакцина Pneumo-23, показал, что только у 3/42 (7,1%) человек в поствакцинальном периоде не увеличивался уровень АТ к ней. Сыворотки этих же людей не показывали увеличения уровня АТ к Pn-1 (сыворотка № 11), к Pn-1, 6A, 6B, 9V, 14, 18C (сыворотка № 9) и ко всем 13 КПС (сыворотка № 10). При анализе сывороток небольшой (n=5) группы лиц часто и длительно болеющих различными бронхо-легочными заболеваниями, вакцинированных Prevenar-13, получены следующие результаты (табл. 3). Уровень специфических АТ в довакцинальном периоде превышал диапазон значений у лиц первых двух групп. Особенностью было то, что нижний предел значений уровня АТ для большинства КПС был более высоким и составлял около 60 - 70 усл. ед. (у доноров - 30 - 40 усл. ед., у призванных на военную службу - 20 усл. ед.). Средние значения для всех КПС находились на уровне 90 усл. ед. Эти данные, на наш взгляд, указывают на то, что в довакцинальном периоде у лиц этой группы уже была встреча с пневмококковой инфекцией. При этом верхний предел диапазона в довакцинальном периоде повышался для всех использованных в ИФА КПС в среднем до 130 усл. ед. (100 - 170 усл. ед.). В поствакцинальном периоде средние значения уровня АТ повышались незначительно (на 30 усл. ед.). Максимальное увеличение среднего уровня специфических IgG (1,7 раза) наблюдали только к КПС Pn-19F, а минимальное - к КПС Pn-9N. При анализе всех сывороток наблюдали отсутствие нарастания уровня АТ к нескольким КПС одновременно: в сыворотке № 1 - к КПС Pn-3, 9N, 14; в сыворотке № 2 - к КПС Pn-6B, 9N; в сыворотке № 3 - к КПС Pn-7, 9N, 9V, 23F; в сыворотке № 4 - к 10 из 13 КПС, а увеличение уровня АТ наблюдали к КПС 7F, 14, 18C; в сыворотке № 5 - к КПС Pn-14 и 18C. Следует отметить, что вакцина Prevenar-13 не содержит КПС Pn-9N, вероятно, поэтому нарастание уровня АТ к этому полисахариду не было отмечено в 4 из 5 сывороток, а наличие антител в 1 сыворотке можно объяснить наличием общего углевода (маннозы) в составе иммунодоминантного участка структуры КПС Pn-9N и Pn-9V Анализ этих же сывороток в ИФА, где для сорбции на полистироле использовали коммерческие вакцины, позволил установить возросший уровень IgG в поствакцинальный период во всех сыворотках к обоим препаратам, причем, к прапарату Prevenar-13 в большей степени, чем к препарату Pneumo-23 (в 2 раза против 1,3 раза). ОБСУЖДЕНИЕ При исследовании сывороток крови использовали разработанный нами скрининговый иммуноферментный тест, в основе которого 13 иммуносорбентов, содержащие КПС, актуальные для территории РФ серогрупп/серотипов пневмококка (1, 3, 4, 6А, 6B, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F) [1, 2, 3, 5]. Специфичность теста (>90%) была определена при анализе сывороток здоровых доноров крови и низким уровнем специфических АТ к КПС Pn-6A у вакцинированных Pneumo-23 (вакцина не содержит КПС Pn-6A) и к КПС Pn-9N у вакцинированных Prevenar-13 (вакцина не содержит КПС Pn-9N). Специфичность каждого из КПС была предварительно доказана с помощью РИЭФ и реакции торможения ИФА. Наиболее высокий уровень IgG к 13 КПС пневмококка в довакцинальном периоде демонстрировали сыворотки часто и длительно болеющих людей (Тср=90 усл. ед.). В поствакцинальном периоде средний уровень АТ в них возрастал на 30 усл. ед. На втором месте по уровню АТ к КПС пневмококка были сыворотки доноров крови (Jcp.=70 усл. ед.), а на третьем - сыворотки крови лиц, призванных на военную службу (Тср=50 усл. ед.). После вакцинации Pneumo-23 уровень АТ в них также повышался в среднем на 30 усл. ед. Среди доноров крови уровень АТ выше диагностического уровня ([ср.+28 [4]) наблюдали у 14 человек, причем повышение было не только к одному КПС, но и к нескольким одновременно; 126 демонстрировали уровень специфических АТ в пределах нормы (90%). Можно предположить, что часть этих лиц переболела пневмококковой инфекцией ранее или была вакцинирована какой-либо пневмококковой вакциной, так как у одного из них был повышен уровень специфических АТ сразу к 10 из 13 КПС, использованных нами. Возможна также поликлональная активация иммунного ответа каким-либо другим агентом. Наиболее важным, на наш взгляд, результатом данных исследований была констатация того факта, что после иммунизации пневмококковыми вакцинами в сыворотках многих обследованных не было обнаружено повышение уровня антител к каждому из 12 - 13 использованных нами КПС (в состав Pneumo-23 не входит КПС Pn-6A, а в состав Prevenar-13 - КПС Pn-9N). Так, в группе призванных на военную службу, только у 9 из 42 человек наблюдали безусловный эффект вакцинации (в сыворотках был повышен уровень АТ ко всем КПС, использованных нами). В сыворотках 32 человек не было зафиксировано повышения уровня АТ к одному или нескольким КПС одновременно, а в сыворотке одного человека уровень АТ не повысился ни к одному КПС. Мы не владели сведениями об исходном иммунном статусе этих людей, однако можем предположить, что при неблагоприятной эпидемической ситуации определенная их часть не будет защищена от пневмококковой инфекции. Среди небольшой группы длительно и часто болеющих людей, вакцинированных препаратом Prevenar-13, не обнаружено ни одного человека, имевшего в поствакцинальном периоде повышение уровня специфических антител к 12 - 13 использованных нами КПС одновременно. Однако лица этой группы, в отличие от двух других, в довакцинальном периоде уже имели повышенный средний уровень антител почти ко всем КПС. Таким образом, установлено, что вакцинация коммерческими пневмококковыми вакцинами групп лиц с возможно измененным иммунным статусом или часто болеющих бронхо-легочными заболеваниями зачастую не приводит к повышению уровня специфических АТ ко всем КПС, входящим в состав вакцины. Использование же самих вакцин в качестве антигенов для ИФА оказывало сочетанный эффект и способствовало регистрации повышенного уровня АТ у 90 - 100% обследованных лиц. При разработке отечественной вакцины и ее клинических испытаниях должны, на наш взгляд, учитываться представленные результаты, которые могут способствовать правильному подбору лиц контрольной группы. Тем более, что ВОЗ требует в клинических испытаниях при регистрации новых вакцин определять эффективность каждого КПС в составе вакцины [7], а это, в свою очередь, требует определение уровня специфических антител в до- и поствакцинальном периоде. Авторы благодарят Л.К.Катосову, М.П.Костинова, Д.С.Воробьева, В.В.Рыбальченко за предоставленные материалы. Л ИТЕРАТУРА

About the authors

N. P Vaneeva

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

N. E Yastrebova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

References

Supplementary files