APPLICATION OF MULTIPLEX-PCR FOR BIFIDOBACTERIA AND PROPIONIBACTERIA GENUS IDENTIFICATION

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Основную часть биомассы культивируемой кишечной микробиоты человека составляют облигатно анаэробные бактерии [1], идентификация которых классическим бактериологическим методом затруднена в силу необходимости создания строго бескислородной среды на всех этапах исследования, начиная от забора материала до окончательной идентификации [10]. Поэтому особое значение приобретают современные молекулярно-генетические способы определения таксономической принадлежности выделяемых микроорганизмов как с использованием стандартных методов генотипирования по последовательности гена малой рибосомальной РНК [5, 8], так и путем поиска особых родоспецифичных генов [9]. Современные методы видовой идентификации живых организмов предполагают достаточно затратный подход сек-венирования последовательностей, полученных при помощи ПЦР с неспецифическими праймерами [5]. В то же время, на первое место выходит родовая идентификация бактерий в условиях чрезвычайно распространенности горизонтального переноса генов у прокариот [6]. Наиболее доступным для целей первичной идентификации облигатных анаэробов представляется классический метод полимеразной цепной реакции с родоспецифичными праймерами и его модификации, ускоряющий и оптимизирующий рутинные исследования: двухфазная и множественная полимеразная цепная реакция (мультиплекс-ПЦР). В связи с изложенным, целью нашей работы стало создание ПЦР тест-системы определения культивируемых бактерий класса Actinobacteria, относящихся к двум родам, наиболее широко представленным среди облигатно-анаэробной микробиоты в кишечнике человека: Bifidobacterium и Pronionibacterium. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы 8 штаммов бактерий Bifidobacterium spp. и 6 штаммов бактерий рода Propionibacterium из коллекции штаммов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза, идентифицированных по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам с помощью тест-системы «АНАЭРО-тест 23», «^a^ema», Чехия. Для создания экспериментальной идентификационной ПЦР тест-системы был подготовлен перечень генов малой рибосомальной РНК из опубликованных к настоящему моменту геномов видов бифидобактерий и пропионибактерий, описанных в биотопах человека [7]. В базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank осуществлен подбор двух пар праймеров родоспецифичного диапазона и проведена проверка сконструированных олигонуклеотидов на отстутствие само- и взаимокомпле-ментарности и возможности формирования шпилечных вторичных структур с использованием программного обеспечения «Lasergene 7.1» («DNASTAR, Inc.», США). Верификацию специфичности полученных олигонуклеотидов производили с помощью сервиса Standard Nucleotide BLAST («National Library of Medicine», США). Последовательность и длина полученных праймерных пар, размер ожидаемых ампли-конов представлены в табл. Выделение матричной ДНК каждого исследуемого штамма для ПЦР проводили с использованием 0,1 мл смеси реагентов «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», Россия) в программируемом твердотельном термостате «Терцик МС-2» (ООО «ДНК-технология», Россия) в течение 20 мин. при 98°С с последующим центрифугированием в микроцентрифуге «5415 D» («Eppendorf», Германия) при 16100 g в течение 0,5 мин. Полученный супернатант вносился в подготовленную реакционную смесь для ПЦР в объеме 5 мкл. Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл приготовлялась из набора праймеров и реагентов ООО «Синтол» в составе: 2 мкл 25 iM раствора магния хлорида, 2 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Б, 1,6 мкл 2,5 !M раствора дезоксирибонуклеотидтрифос-фатов, 0,5 мкл 10 мкМ смеси каждой пары праймеров, 0,2 мкл 5 ед/мкл раствора Taq-полимеразы и 8,2 мкл деионизованной воды. Реакцию проводилиь в ДНК-амплификаторе «Терцик МС-2». Температура этапа денатурации составила 92°C в течение 2 - 10 сек, температура фазы отжига варьировала в диапазоне от 65 до 72°C в течение 2 - 10 сек, температура фазы элонгации находилась в пределах 70 - 72°C, длительность элонгации - от 5 до 30 сек [4]. Количество циклов реакции составило от 25 до 30 [2]. Получаемые ампликоны подвергали агарозному гель-электрофорезу [3]. С этой целью 18 мкл раствора, содержащего амплифицированную ДНК, смешивали с 5 мкл 10-кратного буфера с бромфеноловым синим и вносили в лунки 2% агарозного геля. Электрофорез проводился в TBE-буфере однократной концентрации с 50 мкг/мл этидия бромида при напряженности поля 10 в/см в течение 17 мин. Визуализация результатов разделения нуклеиновых кислот проводилась в проходящем УФ-свете с длиной волны 312 нм на установке гель-документирования «Vilber Lourmat» (Франция). Экспериментальным контролем специфичности ПЦР тест-системы послужил модельный штамм облигатно-аэробного Micrococcus luteus № 2665 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича), поскольку род Micrococcus филогенетически наиболее близок к изучаемым бактериям и принадлежит к тому же классу Actinobacteria. РЕЗУЛ ЬТАТЫ На первом этапе настройка тест-системы проводилась в режиме классической ПЦР с одной парой праймеров на пробу с поэтапным подъемом температуры отжига от 65°C. Использование алгоритма ПЦР с температурой отжига 68°C в количестве 30 циклов показало положительный Праймеры, использованные в работе результат и отсутствие не специфических продуктов реакции во всех пробах с одной парой праймеров как для бифидобактерий, так и в случае пропионибактерий. В контрольных отрицательных пробах с ДНК-матри- ПраймерыНуклеотидная последовательностьДлина праймеров, нукл.Длина амплико-нов, т. н. п. Bif FATGGGGTCGCGTCCTATCAGG210,6 Bif RGGGCCCCACAT CCAGCTT CGAG26 Prp FCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAAGA241,1 Prp RGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGAGA24 цей M. luteus ампликоны не П римечание. Bif - праймеры, родоспецифичные для обнаруживали Bifidobacterium spp., Prp - праймеры, родоспецифичные для „ Propionibacterium spp. В то же время мультиплексирование разных праймерных пар в одной пробе при данной температуре показало наличие неспецифических ампли-конов, образующихся в пробах с ДНК-матрицей бифидобактерий (рис. A). После дальнейшего повышения температуры до 70°C и дополнительного сокращения количества циклов ПЦР до 25 неспецифические ампликоны практически не выявляли (рис. B). Электрофореграмма результата множественной ПЦР с двумя парами праймеров при трехфазной ПЦР с температурой отжига 68°C (A) и двухфазной ПЦР с температурой отжига 70°C (B). Prp - с ДНК-матрицей Propionibacterium spр.; Bif - c ДНК-матрицей Bifidobacterium spр. Кроме того, тот факт, что применяемая температура отжига достигла области значений, оптимальных для работы Taq-полимеразы, позволил реализовать алгоритм двухфазной ПЦР, ликвидировав температурный переход от фазы отжига к элонгации цепей, что позволило достичь сокращения общего времени реакции до 45 минут. На следующем этапе работы проводилось последовательное сокращение времени фаз реакции до вышеуказанных минимумов, в результате которого установлено, что эффективность амплификации, определяемая по видимой яркости люминесценции окрашенных бромидом этидия ампликонов, практически не снижалась вплоть до 15 секунд времени, отводимого на синтез новых цепей ДНК как в случае ампликонов длиной до 0,6 тысяч нуклеотидных пар, получаемых на ДНК бифидобактерий, так и в случае ампликонов свыше 1,1 т. н. п., синтезируемых на ДНК-матрице пропионибактерий. Минимальное время элонгации, при котором детектировались ампликоны, при 30 циклах составило 7,5 секунд. Длительность фаз денатурации и отжига-элонгации удалось сократить до 6 и 16 сек соответственно. Этот факт открывает дополнительные возможности для сокращения времени реакции и ускорение анализа в целом. ОБСУЖДЕНИЕ Установлено, что предложенный алгоритм множественной двухфазной ПЦР позволяет в ускоренном режиме идентифицировать два основных рода культивируемых облигатно-анаэробных бактерий, выделяемых из кишечника человека, используя одну реакционную смесь на каждую анализируемую пробу. Данное усовершенствование в системе скрининговой идентификации облигатноанаэробных бактерий существенно сокращает затраты времени и расходных материалов на проведение анализа. Тот факт, что видимая эффективность амплификации не снижалась при сокращении времени элонгции в 2 раза, несмотря на то, что размер ампликонов, получаемых на ДНК-матрице пропионибактерий, превышает 1,1 т. н. п., позволяет использовать предложенный алгоритм для всего диапазона длин ампликонов, обычно получаемых при стандартном ПЦР-анализе. Таким образом, сочетание методов отбора сочетаний праймеров и тщательной калибровки как температурных, так и временных параметров ПЦР позволяет создавать тест-системы для скрининговой родовой идентификации двух родов внутри одного класса с использованием только одной рамки считывания достаточно большой длины (около 1,5 т. н. п.) либо для одновременной идентификации микроорганизма и выявления встречающегося в пределах данного таксона гомолога практически значимой генетической детерминанты.

About the authors

S. V Andryuschenko

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

N. B Perunova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

E. V Ivanova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

O. V Bukharin

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

References

Supplementary files