Antibiotic sensitivity of cholera vibrions in biofilms formed on various substrates

Full Text

Введение

Биоплёнкообразование — важная часть жизненного цикла большинства бактерий. Холерные вибрионы могут образовывать биоплёнки на эпителии кишечника человека, что играет решающую роль в патогенезе и передаче инфекции [1]. Биоплёночные агрегаты, сформированные Vibrio cholerae в окружающей среде на биотических и абиотических поверхностях, включая хитин зоопланктона, пластик, стекло, обеспечивают сохранение и выживаемость возбудителя между эпидемическими сезонами и резко увеличивают его инфекциозность [2–4].

Последние десятилетия были отмечены значительным увеличением наших знаний о структуре, регуляции и функциях биоплёнок, о влиянии условий их формирования на происходящие в них физиологические и молекулярные процессы [5]. Доказано, что микробные сообщества, окружённые внеклеточным матриксом, по сравнению с планктонными клетками более защищены от неблагоприятных воздействий. В то же время степень этой защиты может зависеть от целого ряда факторов, включая поверхность образования и вид бактерий, формирующих биоплёнку [6, 7]. Сложные микробные взаимодействия, происходящие в смешанных поливидовых биоплёнках, наличие конкурентных взаимодействий способны изменять структурные и функциональные характеристики, химический состав биоплёнок, их подверженность дезинфицирующим средствам и антибиотикам [8]. Понимание механизмов развития сложных биоплёнок и их антибиотикочувствительности может помочь в поиске эффективных препаратов для борьбы с биоплёнкообразованием.

Цель работы — оценить эффективность антибактериальных препаратов (АБП) в отношении клеток V. cholerae в составе полимикробной биоплёнки, образованной на различных субстратах.

Материалы и методы

Для работы из Коллекции патогенных микроорганизмов Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора были получены штаммы: V. cholerae О1 El Tor (ctx⁺tcp⁺) №81, 19667, V. cholerae О1 El Tor (ctx^–tcp^–) № 20000, Escherichia coli QD 5003. Моделирование моно- и полимикробных биоплёнок in vitro проводили на фрагментах экзоскелета хитинового панциря широкопалого речного рака Astacus astacus либо пластиковых пластинках, которые помещали во флаконы с водопроводной автоклавированной водой (100 мл), контаминированные взвесью 10⁴ микробных клеток каждого штамма или в сочетании E. coli с V. cholerae 1 : 1, способом, описанным ранее [9, 10]. Флаконы выдерживали 4 сут при 28ºС. На 5-е сутки культивирования пластинки хитина или пластика с образовавшимися биоплёнками после трёхкратного промывания в физиологическом растворе переносили в пенициллиновые флаконы, содержащие двукратные разведения АБП в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера рН 7,7). В контрольный флакон с биоплёнкой АБП не добавляли. Через 24 ч выращивания в термостате (37ºС) делали отпечатки биоплёнок и высев по 0,1 мл планктонной культуры на пластинки с агаром Хоттингера (рН 7,7). Результат учитывали через 24 ч по наличию или отсутствию роста бактерий. Отнесение культур к чувствительным/устойчивым проводили в соответствии с МУК 4.2.2495-09, МУК 4.2.3745-22 и рекомендациями EUCAST «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Версия 2021–01», определяя минимальные подавляющие концентрации (МПК) препаратов [11–13].

В работе использованы препараты первого (доксициклин, триметоприм/сульфаметоксазол, фуразолидон — отечественного производства, налидиксовая кислота (невиграмон, «CHINOIN Pharmaceutical and Chemical Works Private, Co. Ltd.», Венгрия) и второго ряда (тетрациклин, левомицетин (хлорамфеникол), рифампицин, стрептомицин, ампициллин — отечественного производства), рекомендуемые для определения чувствительности/устойчивости V. cholerae [11, 12].

Наличие биоплёнок в полученных образцах подтверждали по визуализации экзополисахаридного матрикса в мазках-отпечатках или непосредственно на пластинках в световом микроскопе («Carl Zeiss Microscopy») с использованием окраски конго красным и фуксином («Интерхим»).

Культуры в мазках-отпечатках биоплёнок идентифицировали по морфологии колоний, тесту на оксидазу и реакции агглютинации на стекле с О1-холерной сывороткой.

Статистическую обработку результатов определения МПК АБП проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М) результатов трёх повторных опытов, ошибку среднего арифметического значения (m). Различия между значениями МПК планктонных и биоплёночных культур оценивали при помощи критерия Стьюдента при уровне значимости p ≤ 0,05.

Результаты

Все исследуемые культуры на 5-е сутки культивирования образовывали биоплёнки, что подтверждает полученные ранее данные о способности V. cholerae образовывать моновидовые и сложные биоплёнки на хитине и пластике [14–17].

Все планктонные культуры штаммов V. cholerae El Tor проявляли устойчивость к триметоприму/сульфаметоксазолу и фуразолидону. Токсигенные штаммы (ctx⁺tcp⁺) V. cholerae El Tor 19667 и V. cholerae El Tor 81 дополнительно были нечувствительны к налидиксовой кислоте. Планктонные клетки E. coli были чувствительны ко всем исследуемым АБП (табл. 1).

 

Таблица 1. Значения МПК АБП в отношении планктонных и биоплёночных культур, образованных на разных субстратах

Table 1. The values of the MICs of antibacterial drugs against planktonic and biofilm cultures formed on different substrates

АБП Antibacterial drug

Штамм | Strain

пограничные значения МПК, мг/л# MIC limit values, mg/liter#

V. cholerae О1 El Tor 19667

V. cholerae О1 El Tor 81

V. cholerae О1 El Tor 20000

E. coli QD 5003

ПК PC

БП BP

БХ BC

ПК PC

БП BP

БХ BC

ПК PC

БП BP

БХ BC

ПК PC

БП BP

БХ BC

S

R

cредние значения МПК, мг/л (М ± m) | average MIC values, mg/liter (М ± m)

Доксициклин Doxycycline

≤ 2

≥ 4

0,25***

4*

4*

0,25

32*

32*

0,5

16*

16*

0,5

32*

32*

Тетрациклин Tetracycline

≤ 4

≥ 8

0,5

16*

128*,**

0,5

16*

16*

0,5

32*

32*

0,5

16*

16*

Левомицетин Chloramphenicol

≤ 4

≥ 16

1,3 ± 0,3

128*

64*,**

4

128*

128*

4

128*

128*

2

256*

256*

Налидиксовая кислота Nalidixic acid

≤ 4

≥ 16

64

2048*

2048*

64

1024*

1024*

1

512*

512*

2

1024*

1024*

Стрептомицин Streptomycin

≤ 16

≥ 32

16

128*

128*

64

256*

256*

4

32*

32*

8

256*

256*

Ампициллин Ampicillin

≤ 4

≥ 16

4

1024*

1024*

4

128*

128*

4

16*

16*

4

256*

256*

Рифампицин Rifampicin

≤ 4

≥ 16

1,3 ± 0,3

32*

64*

4

128*

128*

2

128*

128*

2

128*

128*

Фуразолидон Furazolidone

≤ 4

≥ 16

16

128*

256*

32

512*

512*

16

64*

64*

4

64*

64*

Триметоприм/ сульфаметоксазол Trimethoprim/sulfamethoxazole

≤ 2/10

≥ 8/40

8/40

2048/10240*

2048/10240*

16/80

1024/5120*

1024/5120*

16/80

1024/5120*

1024/5120*

2/10

1024/5120*

1024/5120*

Примечание. Здесь и в табл. 2: S — чувствительный; R — устойчивый; ПК — планктонная культура; БП — биоплёнки, образованные на пластике; БХ — биоплёнки, образованные на хитине.

^#Согласно МУК 4.2.2495-09, МУК 4.2.3745-22.

*p ≤ 0,05 по сравнению с ПК; **p ≤ 0,05 по сравнению с БП.

Note. Here and in the Table 2: S — sensitive; R — resistant; PC — plankton crops; BP — biofilm cultures on plastic; BC — biofilm cultures on chitin.

^#According to Guidelines 4.2.2495-09 and 4.2.3745-22.

*p ≤ 0.05 when compared to PC; **p ≤ 0.05 when compared to BP.

 

В составе мономикробных бактериальных сообществ, независимо от субстрата образования, клетки V. cholerae и E. coli оказались менее восприимчивы к действию АБП, значения МПК которых достоверно увеличились (p ≤0,05) в сравнении со значениями для планктонных культур. До 256 раз возросли значения МПК препаратов, к которым штаммы были резистентны, а величина МПК антибиотиков, сохранявших активность в отношении планктонных культур, достигла показателей устойчивых (табл. 1). При этом уровень антибиотикоустойчивости исследуемых культур в биоплёнках, образованных на хитине и пластике, был одинаков, за исключением устойчивости к тетрациклину и левомицетину штамма V. cholerae О1 El Tor 19667, которая достоверно отличалась в 2–8 раз.

Полученные данные согласуются с наблюдениями зарубежных авторов о большей антибиотикоустойчивости штамма V. cholerae O139 MO10 (MTCC 3906) в составе биоплёнки в сравнении с его планктонной формой [18].

Антибиотикочувствительность E. coli и V. cholerae в составе сложных биоплёнок, образованных при их совместном культивировании, достоверно не отличалась от их чувствительности в моновидовых биоплёнках, полученных как на пластике, так и на хитине (табл. 2).

 

Таблица 2. Значения МПК АБП в отношении сложных биоплёночных культур, образованных на разных субстратах

Table 2. MICs values of antibacterial drugs against complex biofilm cultures formed on different substrates

АБП Antibacterial drug

Штамм | Strain

пограничные значения МПК, мг/л# MIC limit values, mg/liter#

V. cholerae О1 El Tor 19667 + E. coli QD 5003

V. cholerae О1 El Tor 81 + E. coli QD 5003

V. cholerae О1 El Tor 20000 + E. coli QD 5003

E. coli QD 5003

ПК PC

БП BP

БХ BC

ПК PC

БП BP

БХ BC

ПК PC

БП BP

БХ BC

ПК PC

БП BP

БХ BC

S

R

средние значения МПК, мг/л (М ± m) | аverage MIC values, mg/liter (М ± m)

Доксициклин Doxycycline

≤ 2

≥ 4

0,25***

4*

8*,***

0,25

32*

32*

0,5

16*

16*

0,5

32*

32*

Тетрациклин Tetracycline

≤ 4

≥ 8

0,5

16*

128*,**

0,5

16*

16*

0,5

32*

32*

0,5

16*

16*

Левомицетин Chloramphenicol

≤ 4

≥ 16

1,3 ± 0,3

128*

64*,**

4

128*

128*

4

128*

128*

2

256*

256*

Налидиксовая кислота Nalidixic acid

≤ 4

≥ 16

64

2048*

2048*

64

1024*

1024*

1

512*

512*

2

1024*

1024*

Стрептомицин Streptomycin

≤ 16

≥ 32

16

128*

256*

64

256*

256*

4

32*

32*

8

256*

256*

Ампициллин Ampicillin

≤ 4

≥ 16

4

1024*

1024*

4

128*

128*

4

16*

16*

4

256*

256*

Рифампицин Rifampicin

≤ 4

≥ 16

1,3 ± 0,3

32*

64*

4

128*

128*

2

128*

128*

2

128*

128*

Фуразолидон Furazolidone

≤ 4

≥ 16

16

128*

256*

32

512*

512*

16

64*

64*

4

64*

64*

Триметоприм/ сульфаметоксазол Trimethoprim/sulfamethoxazole

≤ 2/10

≥ 8/40

8/ 40

2048/10240*

2048/10240*

16/80

1024/5120*

1024/5120*

16/ 80

1024/5120*

1024/5120*

2/10

1024/5120*

1024/5120*

Примечание. ***p ≤ 0,05 по сравнению с моновидовой биоплёнкой.

Note. ***p ≤ 0.05 when compared to monospecies biofilm.

 

Исключение составил доксициклин, значения МПК которого в отношении штамма V. cholerae О1 El Tor 19667 в сложной биоплёнке, образованной на хитине, достоверно превышали (в 2 раза) значения МПК в сложной биоплёнке, образованной этим штаммом на данном субстрате.

Подсчёт КОЕ методом истощающих мазков-отпечатков показал, что в смешанных биоплёнках преобладали клетки V. cholerae (КОЕ было больше на 1–2 порядка). Возможно, это связано с большей скоростью формирования зрелой биоплёнки у V. cholerae, чем у E. coli [19].

Обсуждение

V. cholerae в составе моно- и полимикробных сообществ, в отличие от планктонных культур, обладали более высокой резистентностью к АБП. Данные литературы свидетельствуют о меньшей чувствительности биоплёнок V. cholerae, выращенных на хитине, к воздействию факторов окружающей среды, в частности к действию простейших, в сравнении с биоплёнками, образованными на абиотических поверхностях [20], однако в нашем исследовании повышение антибиотикоустойчивости на хитине показано лишь к тетрациклину и только у одного токсигенного штамма V. cholerae. В отношении других исследованных штаммов не выявлено зависимости антибиотикоустойчивости от субстрата, на котором образовалась биоплёнка. Данный факт требует продолжения аналогичных исследований, но, по всей видимости, субстрат не является определяющим в проявлении устойчивости к антибиотикам у бактерий в биоплёночных сообществах, ведь механизмы антибиотикорезистентности в биоплёнках имеют универсальный характер и не зависят от поверхности, на которой они образованы.

Одним из механизмов повышенной устойчивости биоплёнок является трёхмерная структура экзополисахаридного матрикса, ключевыми детерминантами которой служат матричные белки RbmA, RbmC и Bap1, регулирующая проникновение различных веществ в биоплёнку [21]. Большинство клеток биоплёнки находятся в стационарном состоянии и представляют собой спящие клетки-персистеры, имеющие фенотип, отличный от планктонных клеток, и являющиеся более устойчивыми к факторам окружающей среды [22]. Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости внутри биоплёнки может приводить к изменению белков внешней мембраны клеток, продукции ферментов, связанных с резистентностью, изменению в деятельности насосов оттока лекарственных препаратов [23]. Другой механизм — это приобретение генов множественной лекарственной устойчивости путём горизонтального переноса, частота которого в биоплёнке выше, чем в планктонном режиме роста [24, 25]. Генетическая адаптация и эволюция, происходящие в биоплёнках, приводят к отбору субпопуляций с большей способностью противостоять текущему и будущему воздействию антибиотиков [26]. В нашем исследовании нарастание устойчивости штаммов V. cholerae к стрептомицину, триметоприму/сульфаметоксазолу и налидиксовой кислоте в биоплёночной форме при наличии резистентности к данным АБП у планктонной формы подтверждает наличие в биоплёнках наряду с классическими типами устойчивости, характерными для планктонных форм бактерий, специфических вариантов резистентности, возникающих в биоплёнках.

В полимикробных сообществах межвидовые взаимодействия могут оказывать влияние на устойчивость к антимикробным средствам, наблюдаемую в биоплёнках из одного штамма [8, 27]. Присутствие разных партнёров делает структуру и функцию сообщества более сложными. В механизм защиты включаются межвидовые сигналы, физиология клеток и генетическая пластичность, связанная со структурным пространственным расположением и архитектурной дифференциацией [28]. Из-за конкурентных взаимодействий биологические характеристики и химический состав моновидовых и полимикробных биоплёнок может сильно различаться [29, 30]. Так, присутствие комменсальной E. coli увеличивало образование биоплёнок V. cholerae на границе раздела воздух–жидкость in vitro и образование многоклеточных скоплений, похожих на биоплёнку, в фекалиях мышей [31]. Таким образом, различные виды бактерий, входящих в состав биоплёнки, могут влиять на её архитектуру и функции. В нашем исследовании в полимикробных биоплёнках, образованных V. cholerae совместно с E. coli, в сравнении с монобиоплёнками, наблюдалось повышение устойчивости одного токсигенного штамма V. cholerae к доксициклину, что свидетельствует о том, что эффективность АБП в составе полимикробных сообществ зависит не только от вида бактерий, образующих биоплёнку, но и имеет индивидуальные штаммовые особенности.

Выводы

1. V. cholerae в составе биоплёнок, сформированных на биотических и абиотических поверхностях, обладают повышенной антибиотикоустойчивостью в сравнении с планктонной формой.
2. Различия в антибиотикорезистентности V. cholerae в составе моновидовых и сложных биоплёнок в меньшей степени зависят от субстрата образования и в большей степени носят индивидуальный характер, связанный с конкретным штаммом, образующим биоплёнку.

Заключение

Способность V. cholerae формировать на биотических и абиотических поверхностях биоплёнки, обладающие повышенной антибиотикоустойчивостью, подчеркивает опасность их распространения и сохранения в окружающей среде, создаёт дополнительные проблемы в отношении использования антибиотиков и требует разработки альтернативных стратегий снижения резистентности. При этом следует учитывать наличие межвидовых взаимодействий в сложных сообществах, состоящих из бактерий разных видов, которые могут регулировать устойчивость биоплёнок к воздействию внешних факторов, в том числе АБП, а также штаммовые различия.

About the authors

Nadezhda A. Selyanskaya

Rostov-on-Don Anti-Plague Institute

Author for correspondence.
Email: ppdn@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-0008-4705

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Department of microbiology of cholera and other acute intestinal infections

Россия, Rostov-on-Don

Svetlana V. Titova

Rostov-on-Don Anti-Plague Institute

Email: svetatitova@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-7831-841X

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Department of natural focal infections

Россия, Rostov-on-Don

Elena A. Menshikova

Rostov-on-Don Anti-Plague Institute

Email: super.monika2007@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6003-4283

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Department of microbiology of cholera and other acute intestinal infections

Россия, Rostov-on-Don

References

Supplementary files