Influence of antibiotics on biofilm formation by  Streptococcus pyogenes in vitro

A. A. Adzhieva; Аджиева А. А.; T. A. Danilova; Данилова Т. А.; G. A. Danilina; Данилина Г. А.; N. V. Shevlyagina; Шевлягина Н. В.; A. G. Minko; Минко А. Г.; V. G. Zhukhovitsky; Жуховицкий В. Г.

doi:10.36233/0372-9311-64

Influence of antibiotics on biofilm formation by Streptococcus pyogenes in vitro

Authors: Adzhieva A.A.¹, Danilova T.A.¹, Danilina G.A.¹, Shevlyagina N.V.¹, Minko A.G.¹, Zhukhovitsky V.G.¹
Affiliations:
1. N.F. Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology
Issue: Vol 98, No 1 (2021)
Pages: 59-64
Section: ORIGINAL RESEARCHES
Submitted: 03.03.2021
Accepted: 03.03.2021
Published: 03.03.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/988
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-64
ID: 988

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. To study the effect of the antibiotics oxacillin and cefazolin on culture growth and biofilm formation of Streptococcus pyogenes type 30M in vitro.
Materials and methods. The formation of biofilms was studied in light and scanning electron microscope, on sterile cover glasses using special nutrient medium. To identify the biofilm, experimental samples were stained with alcohol-water solution of alcian blue.
Results. Small quantitative doses (0.01–0.1 mg) of oxacillin and cefazoline, regardless of the duration of the exposure, did not have a negative effect both on the biofilm formation process and the formed streptococcal biofilm. An increase in quantitative doses of antibiotics to 0.5–1.0 mg at the stage of formation of Streptococcus biofilm had an inhibitory effect on the growth of microbial cells and the formation of biofilm. The integrity of streptococcal chains and biofilm was preserved when oxacillin and cefazoline were applied at a quantity of 0.5–1.0 mg to the formed biofilm. However, in some cases, the twisting of the chains in spherical shape with visible colored biofilm inside was observed. In addition, there was a stimulating effect of cefazoline on the formed Streptococcal biofilm. When the formed biofilm was exposed to high doses of antibiotics (2 mg or higher), a break of streptococcal chains was observed, while oxacillin had a destructive effect on the microbial biofilm. In similar experiments with cefazolin, the biofilm was preserved, despite the fact that the destruction of microbial chains was also observed.
Conclusion. Significant differences were found in the effect of tested antibiotics on both the mature S. pyogenes type 30M biofilm and the biofilm formation process.

Keywords

biofilm, matrix, oxacillin, cefazolin, microscopy, Streptococcus pyogenes

Full Text

Введение

Проблема резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП) остаётся актуальной. Известно, что быстрому распространению генов множественной резистентности способствуют мигрирующие элементы, в частности плазмиды, фаги, включающие данные гены в свой состав и передающие их другим бактериям.

Другим важным фактором, ответственным за повышенную устойчивость бактерий к АБП, являются биоплёнки — способ защиты, позволяющий бактериям выживать и размножаться в условиях макроорганизма [1]. Важным свойством биоплёнок является их способность к адгезии на различных биотических и абиотических поверхностных субстратах [2]. Структура биоплёнки — это непрерывный мультислой бактериальных клеток, заключённых в биополимерный матрикс. В состав матрикса входят белки, нуклеиновые кислоты, липиды, но его главный компонент — экзогенные полисахариды [3][4]. Матрикс защищает биоплёнку от повреждающих воздействий, в том числе факторов врождённого и приобретённого иммунитета, АБП. В результате биоплёнки значительно менее чувствительны к АБП, чем те же бактерии в планктонной форме, а способность бактерий к формированию биоплёнок является одной из причин хронизации инфекции [5][6].

Бактерии рода Streptococcus обладают наибольшей чувствительностью к АБП пенициллиновой группы и в то же время наименее чувствительны или умеренно чувствительны к цефалоспоринам 1–2-го поколения [7]. В связи с этим представляло определённый интерес изучить влияние на рост культуры и биоплёнкообразование Streptococcus pyogenes оксациллина и цефазолина — представителей вышеназванных групп АБП.

Цель исследования — изучение влияния оксациллина и цефазолина на рост культуры и формирование биоплёнки штамма S. pyogenes 30M (Пражская коллекция) в условиях in vitro.

Материалы и методы

Рост культуры и процесс формирования биоплёнок исследовали с помощью световой и электронной микроскопии на стерильных покровных стёклах с использованием специальных питательных сред. Покровные стёкла предварительно тщательно промывали, сначала в щелочном растворе детергента, затем в проточной воде, и выдерживали в смеси Никифорова для обезжиривания; стерилизовали в сухо-жаровом шкафу при 180°C в течение 1,5–2,0 ч. Суточную культуру штамма S. pyogenes 30M пересевали на бульон Тodd Hewitt Broth (THB) с 0,5% экстракта дрожжей и культивировали при 37°C в течение 24 ч. Полученную суспензию штамма S. pyogenes 30M доводили до концентрации микробных клеток, соответствующей 1,0 по шкале мутности McFarland с помощью бульона THB c 0,5% экстракта дрожжей; 100 мкл этой суспензии, содержащей 5,0 × 10⁷КОЕ/мл штамма S. pyogenes 30M, наносили на стерильное покровное стекло размером 24 × 24 мм. Покровные стёкла с суспензиями в стерильных чашках Петри (55 мм) помещали в полиэтиленовые пакеты с полосками смоченной фильтровальной бумаги для создания влажной камеры.

В работе использовали следующие количества оксациллина и цефазолина («Синтез»): 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мг. Готовили водный раствор АБП с концентрацией 200 мг/мл, который разводили таким образом, чтобы в 10–20 мкл раствора АБП содержалась необходимая опытная доза препарата. Затем препарат добавляли к 80–90 мкл суспензии с 5,0 × 10⁷ КОЕ/мл штамма S. pyogenes 30M, нанесённой на стерильное покровное стекло. В контрольных опытах без воздействия АБП на покровное стекло помещали 100 мкл микробной суспензии, содержащей ту же концентрацию микробных клеток исследуемого штамма.

Исследования проводили в двух вариантах: в первом изучали влияние определённых доз АБП на рост культуры и формирование биоплёнки стрептококка, во втором — влияние тех же доз АБП на готовую сформированную биоплёнку того же микроорганизма. В первом варианте на покровное стекло наносили одновременно микробную суспензию (80–90 мкл) и водный раствор с определённой дозой АБП (в объёме 10–20 мкл). Инкубировали 48 ч при 37°C по вышеописанной методике. Во втором варианте на покровное стекло наносили 80–90 мкл микробной суспензии, содержащей 5,0 × 107 КОЕ/мл исследуемого штамма микроорганизма. Через 48 ч инкубации при 37°C по вышеописанной методике на это же стекло наносили водный раствор с необходимой количественной дозой АБП (в объёме 10–20 мкл) и продолжали процесс инкубации в тех же условиях. Длительность действия оксациллина и цефазолина составляла 2, 4 и 24 ч. По окончании инкубации покровные стекла с биоплёнкой промывали дистиллированной водой, фиксировали над пламенем и окрашивали в течение 2–3 мин 1% спиртовым раствором альцианового синего («БиоВитрум»), предварительно разведенным дистиллированной водой в соотношении 1: 9 [8].

Препараты просматривали в световом микроскопе «Axiostar plus» («Zeiss») при общем увеличении ×400. Для сканирующей электронной микроскопии препараты фиксировали формалином в течение 24 ч. Фиксированные образцы биоплёнок S. pyogenes крепили на алюминиевые столики и напыляли золотом (толщина слоя 5 нм) в модуле для напыления «SPI-Module Sputter Coater» («SPI Supplements»). Для анализа образцов использовали двулучевой ионноэлектронный сканирующий микроскоп «Quanta 200 3D» («FEI Company») в режиме высокого вакуума при ускоряющем напряжении 5–10 кВ.

Результаты

Результаты исследований показали, что в нормальных условиях выращивания, без воздействия АБП, клетки S. pyogenes образуют биоплёнку голубоватого цвета, состоящую из полисахаридного матрикса, окружающего стрептококковые цепочки (рис. 1, а).

При исследовании в сканирующем электронном микроскопе выявлена многослойная структура биоплёнки, которая была неравномерной и варьировала от одной до нескольких клеток. Экзоматрикс более четко виден на участках скоплений микроорганизмов (рис. 1, б).

В опытах по изучению воздействия оксациллина и цефазолина на рост культуры и процесс формирования биоплёнки показано, что небольшие дозы антибиотика (0,01, 0,05 и 0,1 мг) не оказывали негативного воздействия как на целостность стрептококковых цепочек, так и на микробную биоплёнку независимо от длительности его воздействия — 2, 4 и 24 ч (рис. 1, а). В то же время при действии АБП в дозах 0,5 и 1,0 мг наблюдалось подавление роста микробных клеток. При световом микроскопировании можно было видеть отдельные кокки и обрывки стрептококковых цепочек по всему полю зрения. Эффект действия АБП в данном количественном диапазоне на стадии роста и формирования биоплёнки стрептококка наблюдался уже после 4-часовой экспозиции. Дальнейшее повышение дозы АБП (до 2 мг и более) и времени их воздействия (4 ч и дольше) на стадии формирования биоплёнки стрептококка приводило к полному подавлению микробного роста и, как следствие, отсутствию биоплёнки.

Рис. 1. Микрофотография цепочек и биопленок S. pyogenes тип 30М, выращенных на среде THB c 0,5% экстракта дрожжей.а — световая микроскопия, цепочки кокков, окруженные биопленкой; окраска альциановым синим, ×400; б — сканирующая электронная микроскопия, многослойная структура клеток, плотно прилегающих друг к другу и частично объединенных экзоматриксом.

Fig. 1. Chains and biofilms of S. pyogenes type 30M grown on Tood Hewitt Broth medium with 0.5% yeast extract.
a — light microscopy, cocci chains surrounded by biofilm; stained with Alcian Blue, ×400; b — scanning electron microscopy, the multilayer structure of bacterial cells that are tightly adjacent to each other, partially united by an exomatrix.

В опытах по изучению воздействия оксациллина и цефазолина на сформированную биоплёнку установлено, что малые дозы АБП (0,01, 0,05 и 0,1 мг), независимо от времени их воздействия, не нарушали целостность стрептококковых цепочек и готовой биоплёнки. В аналогичных опытах в диапазоне воздействия более высоких доз (0,5 и 1,0 мг) оба АБП также не нарушали целостность стрептококковых цепочек. Однако при этом стабильно наблюдался эффект скручивания последних в шарообразные формы, внутри которых хорошо просматривалась окрашенная биоплёнка (рис. 2). В этом диапазоне концентраций отмечено стимулирующее влияние цефазолина на сформированную биоплёнку. При световой и электронной микроскопии опытных образцов с цефазолином можно наблюдать увеличение слоя биополимерного полисахаридного матрикса зрелой биоплёнки, окружающего стрептококковые цепочки. В интервале воздействия самых высоких доз АБП (2 и 4 мг) на готовую биоплёнку наблюдался разрыв микробных цепочек на отдельные фрагменты. При этом под воздействием оксациллина отмечался не только разрыв стрептококковых цепочек, но и разрушение биоплёнки (рис. 3, а). В аналогичных опытах с цефазолином, несмотря на разрыв микробных цепочек, биоплёнка сохранялась (рис. 3, б).

Рис. 2. Микрофотография цепочек и готовой сформированной биоплёнки S. pyogenes 30М под воздействием низких доз АБП.а — оксациллин, 0,5 мг; б — оксациллин, 1,0 мг; в — цефазолин, 0,5 мг; г — цефазолин, 1,0 мг. Окраска альциановым синим, × 400.

Fig. 2. Chains and biofilm of S. pyogenes type 30M under the influence of the low doses of antibiotics. a — oxacillin, 0.5 mg; b — oxacillin, 1.0 mg; c — cefazolin, 0.5 mg; d — cefazolin, 1.0 mg. Stained with Alcian Blue, × 400.

Рис. 3. Микрофотография цепочек и сформированной биоплёнки S. pyogenes 30М под воздействием высоких доз АБП.а — оксациллин, 2,0 мг; б — цефазолин, 4,0 мг. Окраска альциановым синим, × 400.

Fig. 3. Chains and biofilm of S. pyogenes type 30M under the influence of high doses of antibiotics. a — oxacillin, 2.0 mg; b — cefazolin, 4.0 mg. Stained with Alcian Blue, × 400.

Обсуждение

Применение покровных стёкол в качестве абиотической поверхности даёт возможность наблюдать за процессом формирования биоплёнки в нормальных условиях и при воздействии различных препаратов, в том числе АБП, в отличие от методов, используемых нами в предыдущих исследованиях [9][10][11].

Исследование влияния оксациллина и цефазолина на процесс формирования и готовую биоплёнку показало, что оба АБП в дозах 0,5 и 1,0 мг, начиная с 4-часового воздействия, на стадии формирования биоплёнки стрептококка оказывают одинаковое ингибирующее действие на рост микробных клеток и образование биоплёнки. В то же время низкие дозы АБП, независимо от длительности их воздействия, не оказывали негативного влияния как на процесс формирования, так и на зрелую сформированную биоплёнку.

При увеличении доз оксациллина и цефазолина, воздействующих на готовую сформированную биоплёнку, до 0,5 и 1,0 мг сохранялась целостность биоплёнки и стрептококковых цепочек. Однако при этом наблюдался эффект скручивания последних в шарообразные формы с хорошо просматриваемой окрашенной биоплёнкой внутри. Следует отметить, что так называемый эффект скручивания стрептококковых цепочек в этом диапазоне концентраций в большей степени проявлялся под воздействием оксациллина. Цефазолин оказывает более «мягкое» воздействие на структуру стрептокковых цепочек в сравнении с оксациллином. Кроме того, в данном количественном диапазоне АБП отмечалось стимулирующее влияние цефазолина на зрелую сформированную стрептококковую биоплёнку. Данное обстоятельство, по-видимому, связано с действием цефазолина на продукцию полисахаридного компонента в составе биополимерного матрикса биоплёнки стрептококка. Следует отметить, что длительность воздействия цефазолина в этом количественном диапазоне на целостность стрептококковых цепочек и микробной биоплёнки существенно не влияла.

При воздействии на сформированную биоплёнку наиболее высоких доз АБП наблюдался разрыв стрептококковых цепочек, при этом оксациллин оказывал разрушающее действие и на микробную биоплёнку. В аналогичных опытах с цефазолином биоплёнка сохранялась, несмотря на то что разрыв стрептококковых цепочек тоже наблюдался.

Выявленные значительные различия в действии испытанных АБП как на зрелую биоплёнку штамма S. pyogenes 30М, так и на процесс её формирования в определённой степени коррелируют как с высокой чувствительностью стрептококков к АБП пенициллинового ряда, так и с определённой устойчивостью данного микроорганизма к цефалоспоринам 1–2-го поколения [7].