Influence of antibiotics on biofilm formation by  Streptococcus pyogenes in vitro

A. A. Adzhieva; Аджиева А. А.; T. A. Danilova; Данилова Т. А.; G. A. Danilina; Данилина Г. А.; N. V. Shevlyagina; Шевлягина Н. В.; A. G. Minko; Минко А. Г.; V. G. Zhukhovitsky; Жуховицкий В. Г.

doi:10.36233/0372-9311-64

Влияние антибиотиков на образование биоплёнки Streptococcus pyogenes в условиях in vitro

Авторы: Аджиева А.А.¹, Данилова Т.А.¹, Данилина Г.А.¹, Шевлягина Н.В.¹, Минко А.Г.¹, Жуховицкий В.Г.¹
Учреждения:
1. Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи
Выпуск: Том 98, № 1 (2021)
Страницы: 59-64
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 03.03.2021
Дата принятия к публикации: 03.03.2021
Дата публикации: 03.03.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/988
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-64
ID: 988

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель настоящей работы — изучение влияния антибиотиков оксациллина и цефазолина на рост культуры и образование биоплёнки штамма Streptococcus pyogenes 30М в условиях in vitro.
Материалы и методы. Формирование биоплёнок исследовали в световом и сканирующем электронном микроскопе, на стерильных покровных стёклах с использованием специальных питательных сред. Для выявления биоплёнки опытные образцы окрашивали водно-спиртовым раствором альцианового синего.
Результаты. Небольшие количественные дозы (0,01–0,1 мг) оксациллина и цефазолина, независимо от длительности их воздействия, не оказывали негативного влияния как на процесс формирования, так и на готовую стрептококковую биоплёнку. Увеличение количественных доз антибиотиков до 0,5 и 1,0 мг на стадии формирования биоплёнки стрептококка оказывало ингибирующее действие на рост микробных клеток и образование биоплёнки. При действии оксациллина и цефазолина в дозах 0,5 и 1,0 мг на сформированную биоплёнку сохранялась целостность стрептококковых цепочек и биоплёнки. При этом наблюдался эффект скручивания микробных цепочек в шарообразные формы с окрашенной биоплёнкой внутри. Кроме того, отмечалось стимулирующее воздействие цефазолина на готовую стрептококковую биоплёнку. При воздействии на сформированную биоплёнку высоких доз антибиотиков (2 мг и выше) наблюдался разрыв стрептококковых цепочек, при этом оксациллин оказывал разрушающее действие и на микробную биоплёнку. В аналогичных опытах с цефазолином биоплёнка сохранялась, несмотря на то что наблюдался также разрыв микробных цепочек.
Заключение. Выявлены значительные различия в действии испытанных антибиотиков как на зрелую биоплёнку штамма S. pyogenes 30М, так и на процесс её формирования.

Ключевые слова

биоплёнка, матрикс, оксациллин, цефазолин, микроскопия, S. pyogenes

Полный текст

Введение

Проблема резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП) остаётся актуальной. Известно, что быстрому распространению генов множественной резистентности способствуют мигрирующие элементы, в частности плазмиды, фаги, включающие данные гены в свой состав и передающие их другим бактериям.

Другим важным фактором, ответственным за повышенную устойчивость бактерий к АБП, являются биоплёнки — способ защиты, позволяющий бактериям выживать и размножаться в условиях макроорганизма [1]. Важным свойством биоплёнок является их способность к адгезии на различных биотических и абиотических поверхностных субстратах [2]. Структура биоплёнки — это непрерывный мультислой бактериальных клеток, заключённых в биополимерный матрикс. В состав матрикса входят белки, нуклеиновые кислоты, липиды, но его главный компонент — экзогенные полисахариды [3][4]. Матрикс защищает биоплёнку от повреждающих воздействий, в том числе факторов врождённого и приобретённого иммунитета, АБП. В результате биоплёнки значительно менее чувствительны к АБП, чем те же бактерии в планктонной форме, а способность бактерий к формированию биоплёнок является одной из причин хронизации инфекции [5][6].

Бактерии рода Streptococcus обладают наибольшей чувствительностью к АБП пенициллиновой группы и в то же время наименее чувствительны или умеренно чувствительны к цефалоспоринам 1–2-го поколения [7]. В связи с этим представляло определённый интерес изучить влияние на рост культуры и биоплёнкообразование Streptococcus pyogenes оксациллина и цефазолина — представителей вышеназванных групп АБП.

Цель исследования — изучение влияния оксациллина и цефазолина на рост культуры и формирование биоплёнки штамма S. pyogenes 30M (Пражская коллекция) в условиях in vitro.

Материалы и методы

Рост культуры и процесс формирования биоплёнок исследовали с помощью световой и электронной микроскопии на стерильных покровных стёклах с использованием специальных питательных сред. Покровные стёкла предварительно тщательно промывали, сначала в щелочном растворе детергента, затем в проточной воде, и выдерживали в смеси Никифорова для обезжиривания; стерилизовали в сухо-жаровом шкафу при 180°C в течение 1,5–2,0 ч. Суточную культуру штамма S. pyogenes 30M пересевали на бульон Тodd Hewitt Broth (THB) с 0,5% экстракта дрожжей и культивировали при 37°C в течение 24 ч. Полученную суспензию штамма S. pyogenes 30M доводили до концентрации микробных клеток, соответствующей 1,0 по шкале мутности McFarland с помощью бульона THB c 0,5% экстракта дрожжей; 100 мкл этой суспензии, содержащей 5,0 × 10⁷КОЕ/мл штамма S. pyogenes 30M, наносили на стерильное покровное стекло размером 24 × 24 мм. Покровные стёкла с суспензиями в стерильных чашках Петри (55 мм) помещали в полиэтиленовые пакеты с полосками смоченной фильтровальной бумаги для создания влажной камеры.

В работе использовали следующие количества оксациллина и цефазолина («Синтез»): 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мг. Готовили водный раствор АБП с концентрацией 200 мг/мл, который разводили таким образом, чтобы в 10–20 мкл раствора АБП содержалась необходимая опытная доза препарата. Затем препарат добавляли к 80–90 мкл суспензии с 5,0 × 10⁷ КОЕ/мл штамма S. pyogenes 30M, нанесённой на стерильное покровное стекло. В контрольных опытах без воздействия АБП на покровное стекло помещали 100 мкл микробной суспензии, содержащей ту же концентрацию микробных клеток исследуемого штамма.

Исследования проводили в двух вариантах: в первом изучали влияние определённых доз АБП на рост культуры и формирование биоплёнки стрептококка, во втором — влияние тех же доз АБП на готовую сформированную биоплёнку того же микроорганизма. В первом варианте на покровное стекло наносили одновременно микробную суспензию (80–90 мкл) и водный раствор с определённой дозой АБП (в объёме 10–20 мкл). Инкубировали 48 ч при 37°C по вышеописанной методике. Во втором варианте на покровное стекло наносили 80–90 мкл микробной суспензии, содержащей 5,0 × 107 КОЕ/мл исследуемого штамма микроорганизма. Через 48 ч инкубации при 37°C по вышеописанной методике на это же стекло наносили водный раствор с необходимой количественной дозой АБП (в объёме 10–20 мкл) и продолжали процесс инкубации в тех же условиях. Длительность действия оксациллина и цефазолина составляла 2, 4 и 24 ч. По окончании инкубации покровные стекла с биоплёнкой промывали дистиллированной водой, фиксировали над пламенем и окрашивали в течение 2–3 мин 1% спиртовым раствором альцианового синего («БиоВитрум»), предварительно разведенным дистиллированной водой в соотношении 1: 9 [8].

Препараты просматривали в световом микроскопе «Axiostar plus» («Zeiss») при общем увеличении ×400. Для сканирующей электронной микроскопии препараты фиксировали формалином в течение 24 ч. Фиксированные образцы биоплёнок S. pyogenes крепили на алюминиевые столики и напыляли золотом (толщина слоя 5 нм) в модуле для напыления «SPI-Module Sputter Coater» («SPI Supplements»). Для анализа образцов использовали двулучевой ионноэлектронный сканирующий микроскоп «Quanta 200 3D» («FEI Company») в режиме высокого вакуума при ускоряющем напряжении 5–10 кВ.

Результаты

Результаты исследований показали, что в нормальных условиях выращивания, без воздействия АБП, клетки S. pyogenes образуют биоплёнку голубоватого цвета, состоящую из полисахаридного матрикса, окружающего стрептококковые цепочки (рис. 1, а).

При исследовании в сканирующем электронном микроскопе выявлена многослойная структура биоплёнки, которая была неравномерной и варьировала от одной до нескольких клеток. Экзоматрикс более четко виден на участках скоплений микроорганизмов (рис. 1, б).

В опытах по изучению воздействия оксациллина и цефазолина на рост культуры и процесс формирования биоплёнки показано, что небольшие дозы антибиотика (0,01, 0,05 и 0,1 мг) не оказывали негативного воздействия как на целостность стрептококковых цепочек, так и на микробную биоплёнку независимо от длительности его воздействия — 2, 4 и 24 ч (рис. 1, а). В то же время при действии АБП в дозах 0,5 и 1,0 мг наблюдалось подавление роста микробных клеток. При световом микроскопировании можно было видеть отдельные кокки и обрывки стрептококковых цепочек по всему полю зрения. Эффект действия АБП в данном количественном диапазоне на стадии роста и формирования биоплёнки стрептококка наблюдался уже после 4-часовой экспозиции. Дальнейшее повышение дозы АБП (до 2 мг и более) и времени их воздействия (4 ч и дольше) на стадии формирования биоплёнки стрептококка приводило к полному подавлению микробного роста и, как следствие, отсутствию биоплёнки.

Рис. 1. Микрофотография цепочек и биопленок S. pyogenes тип 30М, выращенных на среде THB c 0,5% экстракта дрожжей.а — световая микроскопия, цепочки кокков, окруженные биопленкой; окраска альциановым синим, ×400; б — сканирующая электронная микроскопия, многослойная структура клеток, плотно прилегающих друг к другу и частично объединенных экзоматриксом.

Fig. 1. Chains and biofilms of S. pyogenes type 30M grown on Tood Hewitt Broth medium with 0.5% yeast extract.
a — light microscopy, cocci chains surrounded by biofilm; stained with Alcian Blue, ×400; b — scanning electron microscopy, the multilayer structure of bacterial cells that are tightly adjacent to each other, partially united by an exomatrix.

В опытах по изучению воздействия оксациллина и цефазолина на сформированную биоплёнку установлено, что малые дозы АБП (0,01, 0,05 и 0,1 мг), независимо от времени их воздействия, не нарушали целостность стрептококковых цепочек и готовой биоплёнки. В аналогичных опытах в диапазоне воздействия более высоких доз (0,5 и 1,0 мг) оба АБП также не нарушали целостность стрептококковых цепочек. Однако при этом стабильно наблюдался эффект скручивания последних в шарообразные формы, внутри которых хорошо просматривалась окрашенная биоплёнка (рис. 2). В этом диапазоне концентраций отмечено стимулирующее влияние цефазолина на сформированную биоплёнку. При световой и электронной микроскопии опытных образцов с цефазолином можно наблюдать увеличение слоя биополимерного полисахаридного матрикса зрелой биоплёнки, окружающего стрептококковые цепочки. В интервале воздействия самых высоких доз АБП (2 и 4 мг) на готовую биоплёнку наблюдался разрыв микробных цепочек на отдельные фрагменты. При этом под воздействием оксациллина отмечался не только разрыв стрептококковых цепочек, но и разрушение биоплёнки (рис. 3, а). В аналогичных опытах с цефазолином, несмотря на разрыв микробных цепочек, биоплёнка сохранялась (рис. 3, б).

Рис. 2. Микрофотография цепочек и готовой сформированной биоплёнки S. pyogenes 30М под воздействием низких доз АБП.а — оксациллин, 0,5 мг; б — оксациллин, 1,0 мг; в — цефазолин, 0,5 мг; г — цефазолин, 1,0 мг. Окраска альциановым синим, × 400.

Fig. 2. Chains and biofilm of S. pyogenes type 30M under the influence of the low doses of antibiotics. a — oxacillin, 0.5 mg; b — oxacillin, 1.0 mg; c — cefazolin, 0.5 mg; d — cefazolin, 1.0 mg. Stained with Alcian Blue, × 400.

Рис. 3. Микрофотография цепочек и сформированной биоплёнки S. pyogenes 30М под воздействием высоких доз АБП.а — оксациллин, 2,0 мг; б — цефазолин, 4,0 мг. Окраска альциановым синим, × 400.

Fig. 3. Chains and biofilm of S. pyogenes type 30M under the influence of high doses of antibiotics. a — oxacillin, 2.0 mg; b — cefazolin, 4.0 mg. Stained with Alcian Blue, × 400.

Обсуждение

Применение покровных стёкол в качестве абиотической поверхности даёт возможность наблюдать за процессом формирования биоплёнки в нормальных условиях и при воздействии различных препаратов, в том числе АБП, в отличие от методов, используемых нами в предыдущих исследованиях [9][10][11].

Исследование влияния оксациллина и цефазолина на процесс формирования и готовую биоплёнку показало, что оба АБП в дозах 0,5 и 1,0 мг, начиная с 4-часового воздействия, на стадии формирования биоплёнки стрептококка оказывают одинаковое ингибирующее действие на рост микробных клеток и образование биоплёнки. В то же время низкие дозы АБП, независимо от длительности их воздействия, не оказывали негативного влияния как на процесс формирования, так и на зрелую сформированную биоплёнку.

При увеличении доз оксациллина и цефазолина, воздействующих на готовую сформированную биоплёнку, до 0,5 и 1,0 мг сохранялась целостность биоплёнки и стрептококковых цепочек. Однако при этом наблюдался эффект скручивания последних в шарообразные формы с хорошо просматриваемой окрашенной биоплёнкой внутри. Следует отметить, что так называемый эффект скручивания стрептококковых цепочек в этом диапазоне концентраций в большей степени проявлялся под воздействием оксациллина. Цефазолин оказывает более «мягкое» воздействие на структуру стрептокковых цепочек в сравнении с оксациллином. Кроме того, в данном количественном диапазоне АБП отмечалось стимулирующее влияние цефазолина на зрелую сформированную стрептококковую биоплёнку. Данное обстоятельство, по-видимому, связано с действием цефазолина на продукцию полисахаридного компонента в составе биополимерного матрикса биоплёнки стрептококка. Следует отметить, что длительность воздействия цефазолина в этом количественном диапазоне на целостность стрептококковых цепочек и микробной биоплёнки существенно не влияла.

При воздействии на сформированную биоплёнку наиболее высоких доз АБП наблюдался разрыв стрептококковых цепочек, при этом оксациллин оказывал разрушающее действие и на микробную биоплёнку. В аналогичных опытах с цефазолином биоплёнка сохранялась, несмотря на то что разрыв стрептококковых цепочек тоже наблюдался.

Выявленные значительные различия в действии испытанных АБП как на зрелую биоплёнку штамма S. pyogenes 30М, так и на процесс её формирования в определённой степени коррелируют как с высокой чувствительностью стрептококков к АБП пенициллинового ряда, так и с определённой устойчивостью данного микроорганизма к цефалоспоринам 1–2-го поколения [7].