The study of neuraminidase immunity in protection against secondary bacterial pneumonia induced by  S. aureus  after influenza infection in mice

I. A. Leneva; Ленева И. А.; I. N. Falynskova; Фалынскова И. Н.; N. P. Kartashova; Карташова Н. П.; E. A. Glubokova; Глубокова Е. А.; A. V. Poddubikov; Поддубиков А. В.; O. A. Svitich; Свитич О. А.

doi:10.36233/0372-9311-2020-97-6-7

The study of neuraminidase immunity in protection against secondary bacterial pneumonia induced by S. aureus after influenza infection in mice

Authors: Leneva I.A.¹, Falynskova I.N.¹, Kartashova N.P.¹, Glubokova E.A.¹, Poddubikov A.V.¹, Svitich O.A.¹
Affiliations:
1. I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera
Issue: Vol 97, No 6 (2020)
Pages: 564-577
Section: ORIGINAL RESEARCHES
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/950
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-6-7
ID: 950

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Pneumonia often occurs secondary to influenza infection and accounts for a large proportion of the morbidity and mortality associated with seasonal and pandemic influenza outbreaks. We previously have shown that vaccination with Virus-like particles (VLPs) containing hemagglutinin (HA) of influenza virus reduces mortality caused by bacterial infections after an influenza infections in mice.

The aim of this work is to study whether this protective effect may be potentiated by supplementing the HA preparation with the influenza neuraminidase (NA).

Materials and methods. We studied the effect of Gag-VLPs with the influenza HA or NA from А/PR/8/34 alone or in combination, in a lethal BALB/c mouse model of S. aureus infection after vaccine-matched or mismatched influenza virus challenge.

Results. A cocktail of HA-Gag and NA-Gag-VLPs fully protected from weight loss, mortality and viral replication and significantly reduced the bacterial burden in the lungs of А/PR/8/34 infected animals. Immunization with this cocktail HA-Gag-VLPs 100 ng + NA-Gag-VLPs 20 ng also protected 60% of animals from mortality associated with secondary bacterial S. aureus infection following a heterologous H1N1 influenza virus challenge, and led to the significant protection from weight loss and pulmonary pathogen replication even in the absence of HA-inhibition and NA-inhibition antibodies.

Conclusion. Our results indicate that influenza vaccination may improve the outcome of a secondary bacterial pneumonia induced by S. aureus after influenza even when the virus is antigenically different from the vaccine strain. At the same time, in our model, the significance of the immunity to influenza virus HA was prevalent.

Keywords

influenza virus, Staphylococcus aureus, VLP, secondary bacterial pneumonia after influenza infection

Full Text

Введение

Большая часть смертельных исходов от гриппа обусловлена вторичными бактериальными осложнениями, среди которых ведущую роль занимают пневмонии. Смертность от вторичных пневмоний после гриппа ассоциирована с определенной группой бактерий, включающей Streptococcus pneumoniaе, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae и Streptococcus pyogenes [1][2][3]. Случаи развития постгриппозных бактериальных пневмоний особенно часто встречаются во время гриппозных пандемий [4], когда у большинства людей отсутствует иммунитет к новому штамму вируса гриппа (ВГ). Известно, что бактериальная суперинфекция, этиологическим агентом которой в большинстве случаев являлся S. pneumoniae, была основной причиной смертности во время пандемии «испанского гриппа» в 1918–1919 гг. Однако в пандемии 1957 и 1968 гг. превалирующим этиологическим агентом вторичных бактериальных пневмоний уже являлся S. aureus [5]. Также во время пандемии 2009 г. в США было показано, что 77 смертей в период с мая по август 2009 г. сопровождались бактериальными инфекциями почти в 30% случаев, 46% из которых были вызваны S. pneumoniae, 9% — S. aureus и 1% — H. influenzae. G. Palacios и соавт. (2009) исследовали образцы носоглоточных мазков почти у 200 больных пандемическим гриппом: H. influenzae была найдена в 52% образцов, S. pneumoniae — в 31%, S. aureus — в 18% [6]. В исследовании на контингенте 838 больных детей с тяжелым течением инфекции в США было показано, что в течение 72 ч после попадания в отделение интенсивной терапии у 33% детей развивалась бактериальная суперинфекция, в 26% случаев вызванная S. aureus, в 5,5% — S. pneumoniae и в 5% — H. influenzae [7]. Бактериемии наблюдались в 5% случаев, главной причиной для них послужил S. aureus [7]. Следует подчеркнуть, что почти половина S. aureus были представлены формами, резистентными к метициллину. В отношении S. aureus процесс создания вакцины далек от завершения [8], кроме того, все более широкое распространение мультирезистентных штаммов стафилококка делает применение антибиотиков неэффективным [9][10].

Вторичная бактериальная инфекция провоцируется гриппозной инфекцией за счет нарушения механизмов антибактериальной защиты организма [11][12][13]. Показано, что инактивированные гриппозные вакцины являются эффективным средством предотвращения вторичных бактериальных осложнений при условии использования вакцины, специфичной к вирусному штамму и вызывающей образование нейтрализующего антительного ответа [14][15][16]. Однако постоянный антигенный дрейф циркулирующих ВГ создает повторяющуюся ситуацию несовпадения антигенных свойств вакцины и штаммов вируса, что снижает или нивелирует эффективность сезонных вакцин. Результаты метаанализа клинических исследований на протяжении 47 сезонов показывают эффективность инактивированных гриппозных вакцин у взрослых людей на уровне 54–73% даже в случае антигенного соответствия препарата [17], однако этот показатель резко снижается при антигенном несоответствии вакцины [17] или в случае вакцинации пожилых людей [18][19].

Многочисленные исследования позволяют предполагать, что ведущую роль в предотвращении развития гриппозной инфекции играют нейтрализующие антитела к гемагглютинину (НА) вируса гриппа [20]. В случае несовпадения вакцинного штамма с циркулирующим наблюдается отсутствие адекватной защиты от первичной инфекции, что может приводить к незащищенности вакцинированных от бактериальных осложнений [17]. Нами ранее на экспериментальной модели вторичной бактериальной пневмонии мышей, индуцированной S. pneumoniae или S. aureus после гриппозной инфекции, показано, что вакцинация вирусоподобными частицами (ВПЧ), несущими НА ВГ, обеспечивает защиту от бактериальных суперинфекций после гриппозной инфекции, инициированной гомологичным, но не гетерологичным ВГ [21][22].

Целью настоящей работы являлось изучение роли иммунного ответа к белку ВГ — нейраминидазе (NA) в формировании резистентности к вторичной бактериальной пневмонии, индуцированной S. aureus после гриппозной инфекции. Для иммунизации мышей были использованы ВПЧ, несущие NA в качестве самостоятельного антигена, или их комбинация с ВПЧ, экспрессирующими НА ВГ. С целью провокации вторичной бактериальной инфекции использовали ВГ, отличный по антигенным свойствам от вируса, входящего в состав ВПЧ, что имитировало ситуацию несовпадения циркулирующих штаммов с вакцинными, имеющую место в природе.

Материалы и методы

Вирусоподобные частицы

Препараты ВПЧ, образованные комбинацией ретровирусного белка Gag с белками ВГ A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1), полученные с помощью конструирования бакуловирусного вектора, экспрессирующего ВПЧ при заражении клеток насекомых (Tnms42-клетки), были предоставлены M. Klausberger (Department of Biotechnology, University of Natural Resources and Life Sciences, Вена). HA-GagВПЧ содержали НА ВГ A/PR/8/34 (100 нг/0,2 мл), NA-Gag-ВПЧ — NA ВГ A/PR/8/34 (20 нг/0,2 мл), и Gag-ВПЧ («пустышки») не содержали белков ВГ.

Патогены

В опытах использовали ВГ, полученные из музея ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева»: А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) (далее A/PR/8/34) и реассортант NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009 (pdm2009 H1N1 2009) × A/PR/8/34 (H1N1) (2 : 6)), содержащий поверхностные белки НА и NA от вируса А/Калифорния/04/2009, а внутренние белки — от A/PR/8/34. Вирусы для заражения выращивали в 9-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) в течение 48 ч при 37ºС. После определения инфекционной активности вирусов путем титрования в РКЭ их использовали для инфицирования животных.

Для бактериального заражения использовали штамм S. aureus № 884, выделенный от пациента и полученный из Коллекции НИИВС им. И.И. Мечникова в лиофилизированном состоянии. Для получения живой культуры ампулу в стерильных условиях вскрывали и добавляли 1 мл питательного бульона (ФБУН ГНЦ ПМБ). Суспензию переносили в пробирку объемом 2 мл и инкубировали 4 ч при 37ºС. Затем осуществляли посев на скошенный питательный агар (ФБУН ГНЦ ПМБ). Пробирки с культурой инкубировали в течение 18 ч при 37ºС, по стандарту мутности определяли содержание бактерий в 1 мл объёма и в этот же день использовали для заражения животных.

РКЭ и животные

РКЭ получали из ООО «Майские просторы», Московская область. В исследованиях использовали мышей-самок линии BALB/c массой 12–14 г (ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, Филиал «Андреевка», Московская область). Содержание и манипуляции с животными соответствовали Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных¹.

Определение эффекта вакцинации в модели бактериальной пневмонии после гриппозной инфекции

Мышей рандомизированно распределяли по группам и иммунизировали внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл как коктейлем HA-Gag-ВПЧ + NAGag-ВПЧ с различным, включая увеличенное, содержанием в нем NA-Gag-ВПЧ, так и каждым компонентом по отдельности (HA-Gag-ВПЧ и NA-GagВПЧ). Коктейли ВПЧ готовили, смешивая два вида частиц непосредственно перед введением. Содержание белков в 0,2 мл препаратов (на одну мышь): HA-Gag-ВПЧ 100 нг, NA-Gag-ВПЧ 20 нг, коктейль HA-Gag-ВПЧ 100 нг + NA-Gag-ВПЧ 0,8 нг, коктейль HA-Gag-ВПЧ 100 нг + NA-Gag-ВПЧ 4 нг, коктейль HA-Gag-ВПЧ 100 нг + NA-Gag-ВПЧ 20 нг. Кроме того, группа животных одновременно с вакцинацией была инфицирована содержащей ВГ А/PR/8/34 аллантоисной жидкостью интраназально под легким наркозом (0,03 мл, 0,5 МЛД₅₀/мл). Животным контрольных групп вместо препаратов ВПЧ вводили по 0,2 мл стерильного 20 мM HEPES в соответствующие контролю сроки.

На 21-е сутки после иммунизации 3 мыши в каждой из изучаемых групп были гуманно умерщвлены и у них отобраны пробы крови для определения антигенной активности в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментного анализа (ИФА), которые были проведены после подготовки новых полученных сывороток крови. В этот же день мышей инфицировали интраназально под эфирным наркозом соответствующей вируссодержащей аллантоисной жидкостью (объем 0,03 мл, по 0,5 МЛД₅₀/мл).

На 4-е сутки после заражения 5 животных из каждой группы гуманно умерщвляли, у них забирали легкие для определения инфекционного титра вируса. На 5-е сутки после вирусного заражения оставшихся мышей инфицировали в объеме 0,03 мл интраназально под эфирным наркозом S. aureus.

На 8-е и 3-и сутки после вирусного и бактериального заражения соответственно у 5 животных из каждой группы забирали легкие для определения инфекционного титра вируса (путем титрования гомогенатов тканей легких на РКЭ) и бактериальной обсемененности. Наблюдение за животными проводили в течение 21 дня после вирусного заражения (рис. 1). Оценку протективной активности ВПЧ проводили, учитывая защиту ими животных от смертности и потери массы тела. Изменение массы тела рассчитывали отдельно для каждой мыши и выражали в процентах, принимая за 100% массу тела животного перед инфицированием. Для мышей каждой группы определяли среднее значение процента изменения массы тела.

Рис. 1. Дизайн исследования. Fig. 1. Study design.

Определение антигенной активности ВПЧ

Для оценки антигенной активности в отношении НА вируса гриппа в сыворотках крови определяли титры сывороточных антигемагглютинирующих антител в РТГА с 4 агглютинирующими единицами соответствующего вирусного антигена по стандартной методике².

Для обнаружения антител к NA использовали два метода. Первый метод основан на использовании низкомолекулярного субстрата MUNANA. К двукратным разведениям подготовленных сывороток (50 мкл), помещенным в 96 луночные планшеты с плоским дном для измерения флюоресценции («FluoroNunc»), добавляли предварительно определенные рабочие разведения NA-Gag-ВПЧ (50 мкл, 1 : 1024). Далее реакцию проводили, как описано ранее [23]. Кроме того, в сыворотках крови определяли титры вирусспецифических иммуноглобулинов классов А и G при помощи ИФА. В качестве антигенов использовали препарат очищенного рекомбинантного белка HA ВГ A/PR/8/34, содержащий НА в концентрации 1 мг/ мл, или препарат очищенного рекомбинантного белка NA ВГ A/PR/8/34, содержащий NА в концентрации 2 мг/мл, сорбированные на 96-луночные планшеты с плоским дном («Thermo Fisher») в течение ночи при 4°C. После отмывки планшетов (3 раза, 300 мкл ФСБ‐Tween) были добавлены серийные 1 : 2 разведения изучаемых сывороток (100 мкл), после инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре и отмывки планшетов (3 раза, 300 мкл ФСБ‐Tween) в каждую лунку планшета помещали 50 мкл меченного пероксидазой конъюгата в разведении 1 : 3000 (#A2304, «Sigma»). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре и 3 кратной отмывки планшеты были обработаны 100 мкл субстрата SIGMAFASTTM OPD («Sigma»), реакция была остановлена 25 мкл 3 M H₂SO₄. Оптическую плотность измеряли при λ = 490 нм на спектрофотометре «Tecan Infinite M1000 Microplate Reader» («Tecan»).

Определение инфекционного титра вируса в лёгких мышей

Для определения титра вируса готовили 10-кратные разведения суспензии легких мышей на среде Игла МЕМ и вводили по 100 мкл каждого разведения в аллантоисную полость 9-дневных РКЭ. Инфицированные РКЭ инкубировали во влажной среде при 37ºС в течение 48 ч, затем охлаждали при 4ºС в течение 4 ч. Отбирали 50 мкл аллантоисной жидкости, помещали в лунки круглодонного 96-луночного планшета и добавляли 50 мкл 0,5% суспензии куриных эритроцитов. Через 45 мин инкубации по реакции гемагглютинации определяли, в каких РКЭ размножился вирус, и рассчитывали ЭИД₅₀.

Определение обсемененности респираторных путей

Для определения бактериальной обсемененности из полученных образцов гомогенизированных легких готовили серийные разведения и осуществляли прямой высев на чашки Петри с агаром Мюллера–Хинтона. Учет колониеобразующих единиц (КОЕ) проводили после 18 ч инкубации при 37ºС. Количество выросших колоний умножали на степень разведения и коэффициент, обратный количеству посеянного материала, и выражали в lg КОЕ/мл.

Результаты

Определение антигенной активности препаратов ВПЧ

При изучении иммунного ответа после однократной иммунизации мышей препаратами HA-Gag-ВПЧ 100 нг, NA-Gag-ВПЧ или их комбинацией, взятыми в различных соотношениях (NAGag-ВПЧ 20, 4 или 0,8 нг), в сыворотке крови в РТГА (функциональные антитела) были выявлены различные титры антител к гомологичному вирусу A/PR/8/34 (H1N1). Наивысшие титры обнаруживались в группе мышей, иммунизированных монопрепаратом HA-Gag-ВПЧ. Иммунизация коктейлем с NA-антигеном приводила к снижению титра антигемагглютинирующих антител (табл. 1). В то же время данные ИФА показали близкие по значениям показатели IgG-ответа к НА во всех группах. У животных, зараженных сублетальной дозой вируса A/PR/8/34 (H1N1), титры РТГА превосходили показатели в группах, иммунизированных ВПЧ. Ни в одной из экспериментальных групп в РТГА не выявлено антител к гетерологичному штамму NIBRG-121 (H1N1) (табл. 1). Определение иммунного ответа к NA гомологичного вируса A/PR/8/34 (H1N1) путем реакции ингибирования нейраминидазной ферментативной активности с использованием низкомолекулярного субстрата MUNANA не выявило индукцию антител к NA ни в одной из групп, что совпадает с данными исследователей о возможности использования этого субстрата только для выявления моноклональных антител [24]. Иcпользование высокомолекулярного субстрата в ELILA позволило выявить в сыворотке крови антитела к NA только у животных, вакцинированных NA-Gag-ВПЧ, а также у животных, зараженных сублетальной дозой вируса A/PR/8/34 (H1N1). При использовании коктейля ВПЧ с NAи HA-антигенами индукция антител к NA не была выявлена, а увеличение содержания NA-Gag-ВПЧ в коктейле не приводило к обнаружению антител, специфичных к NA, в ферментативном тесте при использовании субстрата ELILA.

Таблица 1. Изучение антигенной активности ВПЧ (вирусоподобных частиц) с HA-Gag-ВПЧ и NA-Gag-ВПЧ, а также коктейля HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ после вакцинации

Table 1. Study of the antigenic activity of HA-Gag-VLPs and NA-Gag-VLPs, as well as their cocktail (HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs) after vaccination

Группа Group	Антитела к НА Antibodies to HA			Антитела к NA Antibodies to NA
	РТГА reaction of inhibition of hemagglutination		ИФА ELISA	ингибирование активности NA inhibition of neuraminidase activity		ИФА ELISA
	A/PR/8/34 (H1N1)	NIBRG-121xp (H1N1)	M	MUNANA	ELILA	M
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 0,8 нг HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 0.8 ng	< 10, 20, 10, < 10	<10, <10, <20, <10	800	<10, <10, <10, <10	<10, <10, <10, <10	350
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 4 нг HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 4 ng	20, < 10, < 10, 10	<10, <10, <10, <10	650	<10, <10, <10, <10	<10, <10, <10, <10	500
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 20 ng	40, 20, 40, 20	<10, <10, <10, <10	450	<10, <10, <10, <10	<10, <10, <10, <10	900
HA-Gag-ВПЧ HA-Gag-VLPs	40, 80, 40, 80	<10, <20, <10, <10	425	<10, <10, <10, <10	<10, <10, <10, <10	175
NA-Gag-ВПЧ 20 нг NA-Gag-VLPs 20 ng	10, 10, 10, 10	<10, <10, <10, <10	200	<10, <10, <10, <10	40, 20, 40, 40	881
Сублетальная доза A/PR/8/34 Sublethal A/PR/8/34	80, 160, 160, 160	< 10, < 10, 20, <20	800	<10, <10, <10, <10	80, 160, 80,40	530
Gag-ВПЧ Gag-VLPs	<10, <10, <10, <10	<10, <10, <10, <10	50	<10, <10, <10, <10	<10, <10, <10, <10	He определяли Did not determine
20 mM HEPES (контроль) 20 mM HEPES (control)	<10, <10, <10, <10	<10, <10, <10, <10	50	<10, <10, <10, <10	<10, <10, <10, <10	150

Протективная эффективность ВПЧ при индукции инфекции гомологичным и гетерологичным вирусами

Для изучения эффекта ВПЧ, содержащих HA и NA, а также их коктейля с различным, включая увеличенное, содержанием в нем NA-Gag-ВПЧ на модели вторичной бактериальной пневмонии, вызванной S. aureus, для индукции гриппозной инфекции было использовано заражение как гомологичным A/PR/8/34, так и гетерологичным NIBRG-121xp ВГ. В группах невакцинированных животных, инфицированных соответствующими вирусами и бактериями (отрицательные контроли, 20 мM HEPES + NIBRG-121xp + S. aureus; 20 мM HEPES + A/PR/8/34 + S. aureus), наблюдалась полная гибель животных при большой потере веса, при этом размножение вируса и бактерий в легких было самым высоким среди всех изученных групп (табл. 2, 3, рис. 2, 3).

Рис. 2. Влияние вакцинации коктейлем HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ в разных дозах и каждым компонентом коктейля в отдельности на выживаемость (а) и изменение веса (б) животных на модели вторичной бактериальной пневмонии, индуцированной S. aureus, после гриппозной инфекции гетерологичным NIBRG-121xp (H1N1) ВГ.

Fig. 2. The effect of vaccination with the HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs cocktail at different doses and each cocktail component separately on survival (а) and weight change (b) of animals in a model of secondary bacterial pneumonia induced by S. aureus after influenza infection with heterologous NIBRG-121xp (H1N1) influenza virus.

Рис. 3. Влияние вакцинации коктейлем ВПЧ (HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ) в разных дозах и каждым компонентом коктейля в отдельности на выживаемость (а) и изменение веса (б) животных на модели вторичной бактериальной пневмонии, индуцированной S. aureus, после гриппозной инфекции гомологичным A/PR/8/34 (H1N1) ВГ. Fig. 3. The effect of vaccination with the HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs cocktail at different doses and each cocktail component separately on survival (а) and weight change (b) of animals in a model of secondary bacterial pneumonia induced by S. aureus after influenza infection with homologous A/PR/8/34 (H1N1) influenza virus.

Таблица 2. Изучение вирусоподобных частиц с HA-Gag-ВПЧ и NA-Gag-ВПЧ, а также их коктейля разного состава на модели вторичной бактериальной пневмонии, индуцированной S. aureus, после гриппозной инфекции гетерологичным вирусом NIBRG-121xp (H1N1)

Table 2. Study of HA-Gag-VLPs, NA-Gag-VLPs, as well as their cocktail of different composition on the model of secondary bacterial pneumonia induced by S. aureus after influenza infection with a heterologous virus NIBRG-121xp (H1N1)

Группа Group	Выживаемость Survival		Средняя продолжительность жизни, сут Mean day to death, days	Титр вируса в легких животных, lg ЭИД _50/0,1_мл Lung viral titer, lg EID _50/0.1ml		Плотность бактерий в легких животных, log КОЕ/мл, 7-е сутки после вирусной инфекции Bacterial density, lg CFU/ml, 7 days after viral infection
Группа Group	выжившие/ общее число survival/total	выживаемость, % survival rate, %		4-е сутки после инфекции day 4 after viral infection	7-е сутки после инфекции day 7 after viral infection
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 0,8 нг + NIBRG-121xp + S. aureus HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 0.8 ng + NIBRG-121xp + S. aureus	3/10 (p = 0,065169)	30	10,6	5,37 ± 0,47	6,2 ± 0,44	4,66 ± 0,54
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 4 нг + NIBRG-121xp + S. aureus HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 4 ng + NIBRG-121xp + S. aureus	4/10 (p = 0,024770)	40	12,2	5,5 ± 0,58	6,4 ±1,14	3,46 ± 1,94
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг + NIBRG-121xp + S. aureus HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 20 ng + NIBRG-121xp + S. aureus	6/10 (p = 0,001735)	60	14,6	4,25 ± 0,5	5± 1	1,00 ± 1,41
HA-Gag-ВПЧ + NIBRG-121xp + S. aureus HA-Gag-VLPs + NIBRG-121xp + S. aureus	4/10 (p = 0,024770)	40	12,6	4,75 ± 0,96	7± 1	1,84 ± 1,68
NA-Gag-ВПЧ 20 нг + NIBRG-121xp + S. aureus NA-Gag-VLPs 20 ng + NIBRG-121xp + S. aureus	0/11	0	7,1	6,25 ± 0,5	6,2 ± 0,45	4,26 ± 0,68
Сублетальная доза A/PR/8/34 + NIBRG-121xp + S. aureus Sublethal A/PR/8/34 + NIBRG-121xp + S. aureus	6/10 (p = 0,001735)	60	15,2	3 ± 0,82	1,9 ±0,22	1,94 ± 1,78
Gag-ВПЧ + NIBRG-121xp + S. aureus Gag-VLPs + NIBRG-121xp + S. aureus	2/10 (p = 0,150950)	20	10,2	6,75 ± 0,5	7,6 ± 0,89	5,54 ± 0,96
Отрицательный контроль (буфер + NIBRG-121xp + S. aureus) Negative control (buffer + NIBRG-121xp + S. aureus)	0/11	0	8,5	6,5 ± 0,58	7,8 ± 0,45	5,62 ± 0,53
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг + NIBRG-121xp HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 20 ng + NIBRG-121xp	5/6 (p = 0,000012)	83	17,6	4,25 ± 0,5	2,8 ±0,84	—
Вирусный контроль (буфер + NIBRG-121xp) Virus control (buffer + NIBRG-121xp)	4/5 (p = 0,000053)	80	17,2	6,5 ± 0,58	2,6 ± 0,55	—
Бактериальный контроль (буфер + S. aureus) Bacterial control (buffer + S. aureus)	5/5	100	> 16	—	—	1,74 ± 1,24

Примечание, p < 0,05 рассматривается как достоверное отличие от контроля.

Note. р < 0.05 is considered as a significant difference from control.

Таблица 3. Изучение вирусоподобных частиц с HA-Gag-ВПЧ и NA-Gag-ВПЧ, а также их коктейля разного состава на модели вторичной бактериальной пневмонии, индуцированной S. aureus, после гриппозной инфекции гомологичным вирусом A/PR/8/34 (H1N1)

Table 3. Study of HA-Gag-VLPs, NA-Gag-VLPs, as well as their cocktail of different composition on the model of secondary bacterial pneumonia induced by S. aureus after influenza infection with the homologous virus A/PR/8/34 (H1N1)

Группа Group	Выживаемость Survival		Средняя продолжи- тельность жизни, сут Mean day to death, days	Титр вируса в легких животных, Lung viral titer, Ig EID_50/0.1_ml		Плотность бактерий в легких животных, log KOE/ml. 7-е сутки после вирусной инфекции Bacterial density, Ig CFU/ml, 7 days after viral infection
Группа Group	выжившие/ общее число survival/total	выживаемость, % survival rate, %		4-е сутки после инфекции day 4 after viral infection	7-е сутки после инфекции day 7 after viral infection
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг + A/PR/8/34 HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 20 ng + A/PR/8/34	5/5	100	> 16	0	0	—
Вирусный контроль (буфер + A/PR/8/34) Virus control (buffer + A/PR/8/34)	5/5	100	> 16	5,25 ± 0,5	3,0 ± 0,7	—
HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг + S. aureus HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 20 ng + S. aureus	5/5	100	> 16	—	—	1,68 ± 1,56
Бактериальный контроль (буфер + S. aureus) Bacterial control (buffer + S. aureus)	5/5	100	> 16	—	—	1,74 ± 1,24
Положительный контроль (HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг + A/PR/8/34 + S. aureus) Positive control (HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 20 ng + A/PR/8/34 + S. aureus)	5/5	100	> 16	0	0	1,28 ± 1,76
Отрицательный контроль (буфер + A/PR/8/34 + S. aureus) Negative control (buffer + A/PR/8/34 + S. aureus)	0/10	0	8,4	5,25 ± 0,5	7,2 ± 0,84	7,28 ± 1,92

При вакцинации Gag-ВПЧ, не содержащими вирусных белков, смертность незначительно отличалась от таковой в группах отрицательного контроля и составляла 80% при инфекции обоими вирусами. Также титры вируса и концентрация бактерий в легких не отличались практически от таковых в группах невакцинированных животных (табл. 2, 3, рис. 2, 3). Общая гибель с большой потерей веса наблюдалась при вакцинации ВПЧ, содержащими только NA A/PR/8/34 (NA-Gag-ВПЧ), при последующем заражении гетерологичным вирусом NIBRG-121xp и бактериальным патогеном. Несмотря на заражение гетерологичным вирусом, вакцинация ВПЧ, содержащими только НA A/PR/8/34 (НA-Gag-ВПЧ), защищала 40% животных от гибели, снижала потерю их веса и размножение вируса и бактерий в легких при последующем заражении S. aureus. При инфекции вирусом NIBRG-121xp коктейль ВПЧ с низким содержанием NA (HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ, 0,8 нг) защищал только 30% животных. Увеличение содержания частиц с NA (HA-Gag-ВПЧ + NA-GagВПЧ 20 нг) в коктейле приводило к повышению выживаемости животных до 60%. В этой группе защитный эффект был сравним с таковым у мышей, иммунизированных сублетальной дозой A/PR/8/34 с дальнейшей инфекцией NIBRG-121 с последующим заражением S. aureus (табл. 2, рис. 2). В группе положительного контроля после вирусной инфекции при заражении гомологичным вирусом A/PR/8/34 (H1N1) с последующей суперинфекцией S. aureus вакцинирование этим же коктейлем ВПЧ полностью предотвращало гибель мышей, потерю их веса и размножение вируса в легких на 4-е и 7-е сутки (табл. 3, рис. 3).

Исследование интерферонового профиля в легких мышей в период перед проведением бактериального заражения

Известно, что выработка интерферонов и активация Th1-лимфоцитов и клеточных компонентов адаптивного иммунитета при вирусной инфекции
может способствовать ослаблению ряда механизмов, участвующих в антибактериальном иммунитете, и являться триггером вторичной бактериальной инфекции. В связи с этим было изучено влияние иммунизации мышей ВПЧ, содержащими HA или NА, а также их комбинациями на выработку интерферонов-α, -β и -γ в легких мышей после вирусного заражения, перед проведением бактериального заражения (рис. 4). В качестве альтернативной группы сравнения были использованы мыши с постинфекционным иммунитетом после заражения сублетальной дозой вируса A/PR/8/34. Было показано, что иммунизация препаратом HA-Gag-ВПЧ + NAGag-ВПЧ 20 нг снижает до минимума выработку интерферонов I типа при заражении гомологичным вирусным штаммом, обеспечивая подавление репродукции вируса. В то же время при гетерологичном заражении ни один из вакцинных препаратов достоверно не снижал выработку интерферонов по сравнению с группой неиммунизированных животных. Единственным исключением являлась группа мышей с перенесённой гриппозной A/PR/8/34-инфекцией. Здесь наблюдалось снижение выработки интерферона-α до минимальных значений на фоне существенного снижения репродукции вируса в легких на 4-е сутки после заражения. Среди препаратов ВПЧ наименьшие показатели выработки интерферонов показал монопрепарат HA-Gag-ВПЧ (рис. 4). Таким образом, добавление нейраминидазного компонента в состав вакцинных препаратов не влияло на выработку интерферонов при заражении иммунизированных мышей гетерологичным штаммом ВГ.

Рис. 4. Влияние вакцинации HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ в разных дозах и каждым компонентом коктейля в отдельности на индуцированную заражением вирусами гриппа экспрессию интерферонов I/II типов в легких мышей.1 — HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 0,8 нг + NIBRG-121; 2 — HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 4 нг + NIBRG-121; 3 — HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг + NIBRG-121; 4 — HA-Gag-ВПЧ + NIBRG-121; 5 — NA-Gag-ВПЧ 20 нг + NIBRG-121; 6 — сублетальная доза A/PR/8/34 + NIBRG-121; 7 — Gag-ВПЧ + NIBRG-121; 8 — буфер + NIBRG-121; 9 — HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг; 10 — HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг + А/PR/8/34; 11 — буфер (неинфицированные мыши); 12 — буфер + А/PR/8/34. Fig. 4. The effect of vaccination with the HA-VLPs + NA-VLPs cocktail at different doses and each cocktail component separately on interferon (type I/II) expression in the lung of mice infected with influenza viruses. 1 — HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 0.8 ng + NIBRG-121; 2 — HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 4 ng + NIBRG-121; 3 — HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 20 ng + NIBRG-121; 4 — HA-Gag-VLPs + NIBRG-121; 5 — NA-Gag-VLPs 20 ng + NIBRG-121; 6 — sublethtal PR8 + NIBRG-121; 7 — Gag-VLPs + NIBRG-121; 8 — Buffer + NIBRG-121; 9 — HA-Gag-VLPs + NA-VLPs 20 ng; 10 — HA-Gag-VLPs + NA-Gag-VLPs 20 ng + А/PR/8/34; 11 — Buffer (uninfected mice); 12 — Buffer + А/PR/8/34.

Обсуждение

В настоящее время не существует вакцины для профилактики осложнений, вызванных S. aureus. При этом количество штаммов данного возбудителя, невосприимчивых к лечению антибиотиками, постоянно растет. Одной из профилактических стратегий борьбы с бактериальными пневмониями, стафилококковыми инфекциями и связанными с ними патологиями является вакцинация против гриппа. Ранее нами показано, что ВПЧ, несущие НА ВГ, полностью защищают животных от вторичных бактериальных пневмоний, индуцированных S. aureus, при условии первичной гриппозной инфекции, вызванной гомологичным вирусом [21]. Показано, что другие белки ВГ вовлечены в летальный синергизм вирус-бактериальных осложнений [25][26][27]. В частности, NA ВГ способствует бактериальной адсорбции на клетки эпителия путем модификации клеточных поверхностей и увеличения экспрессии рецепторов адгезии [24][26]. В свете того, что современные противогриппозные вакцины стандартизированы исключительно на основе содержания НА, особый интерес представляла оценка того, как включение в состав ВПЧ, помимо НА, также и NA ВГ будет влиять на антигриппозный иммунитет для снижения вторичных бактериальных осложнений при несовпадении циркулирующих штаммов с вакцинными.

Проведенные эксперименты на модели вторичной бактериальной пневмонии, индуцированной S. aureus, после гриппозной инфекции, вызванной гетерологичным вирусом, показали, что ВПЧ с NA в отдельности не проявляют протективных свойств. Вакцинация коктейлем ВПЧ, содержащим HA и NA, повышала защиту животных от гибели и потери массы тела только при увеличенном содержании NA в коктейле ВПЧ (HA-Gag-ВПЧ + NA-Gag-ВПЧ 20 нг). Наши результаты совпадали с данными V. Zurli и соавт. [28], которые продемонстрировали значительную защиту от вторичной инфекции S. aureus после гетерологичной вирусной инфекции CAL09 при иммунизации субъединичной вакциной, содержащей НА и NA ВГ А/PR/8/34. Совокупность полученных нами результатов позволяет заключить, что иммунный ответ к НА имеет превалирующее значение при защите от вторичной бактериальной суперинфекции, спровоцированной инфекцией гетерологичным по отношению к вакцинному препарату штаммом ВГ. Иммунный ответ только к NA не обеспечивал снижение летальности у животных, однако увеличение концентрации антигена NA в составе двухкомпонентной вакцины с НА способствовало достижению наивысших показателей снижения летальности при гетерологичном вирусном заражении.

Данные по протективной активности ВПЧ, полученные нами, отличались от данных по их антигенной активности. При иммунизации ВПЧ, содержащими коктейль НА и NA, в РТГА выявлено снижение количества антител к НА гомологичного вируса по сравнению с иммунизацией ВПЧ, содержащими только НА. Кроме того, в реакции антинейраминидазной активности мы наблюдали антитела к NA только при иммунизации ВПЧ, содержащими NA. Эти данные дают возможность предполагать, что добавление нейраминидазного компонента в вакцинный препарат может вызывать продукцию антител, интерферирующих с антителами, выявляемыми в реакции РТГА, а наличие анти-НА антител может ингибировать нейтрализующую активность NA-специфичных антител.

В то же время при изучении механизмов защиты и суррогатных маркеров чувствительности к вторичной бактериальной инфекции обнаружено, что показатели повреждения легких, предшествующие бактериальному заражению, лучше коррелируют с протективной активностью, чем титры антител к НА и NA, что, вероятно, обусловлено эффектом их взаимной интерференции, искажающей результаты изучения гуморального ответа к ВПЧ. Обогащение вакцинного препарата NA ведет к частичному улучшению его кросс-протективных свойств, но для достижения лучшего эффекта защиты, по-видимому, требуется включение в состав экспериментальной вакцины более высоких концентраций NA или включение в состав вакцинного препарата других консервативных антигенов ВГ, таких как белки PB1-f2 или NS1, обладающих иммунорегуляторными функциями.

При анализе интерферонового ответа у вакцинированных мышей при гриппозной инфекции оказалось, что парентеральная иммунизация ВПЧ, экспрессирующими НА и NA, предотвращает выработку интерферонов I и II типов только при условии индукции нейтрализующих антител к гомологичному вирусу, но не оказывает влияния при инфекции гетерологичным вирусом. Влияние иммунизации антигеном NA на снижение концентрации интерферонов I типа в легких при инфекции NIBRG-121xp было недостоверным и не превалировало над эффектом, достигаемым при иммунизации ВПЧ, экспрессирующими НА. Следует отметить, что индукция интерферонов при инфекции вирусом NIBRG 121xp была существенно ниже по сравнению с вирусом A/PR/8/34 (H1N1).

Важно отметить, что наивысшие титры антител к НА и NA гомологичного вируса и высокий протективный эффект при заражении гетерологичным вирусом наблюдались у мышей с постинфекционным иммунитетом в результате перенесенной инфекции вирулентным штаммом A/PR/8/34 (H1N1). Очевидно, что при отсутствии нейтрализующих антител данный эффект может быть связан с формированием Т-клеточного звена противовирусного иммунитета при естественной гриппозной инфекции. Известно, что респираторная инфекция или иммунизация живыми аттенуированными вакцинами способны формировать резидентные клетки памяти (Тrm), ассоциированные со слизистыми оболочками респираторного тракта, обладающие способностью обеспечивать кросс-протективную защиту в отношении гетерологичных ВГ [29]. Возможность индукции такого иммунитета с помощью ВПЧ при интраназальном введении требует дальнейшего изучения.

Заключение

Иммунный ответ к НА имеет превалирующее значение при защите от вторичной бактериальной суперинфекции, спровоцированной инфекцией гетерологичным по отношению к вакцинному препарату штаммом ВГ, иммунный ответ только к NA не обеспечивает снижение летальности у животных. В то же время обогащение ВПЧ NA приводит к частичному улучшению кросс-протективных свойств вакцинного препарата. По-видимому, для достижения лучшего эффекта защиты требуется включение в состав ВПЧ других, более консервативных антигенов ВГ, таких как PB1-f2- или NS1-белки.

1. Приказ Минздрава России от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации».

2. WHO manual. URL: http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/whocdscsrncs20025rev.pdf