In vitro study of the effect of Bifidobacterium bifidum probiotic strain DNA on the cell concentration and colonization properties of intestinal microsymbionts

Full Text

Введение

В настоящее время продолжается активное изучение кишечного микробиома. Это .вязано с многосторонним влиянием микробиоты на гомео­стаз макроорганизма, которое осуществляется за счет ее участия во всех видах обмена веществ [1], нейрофизиологических процессах [2], поддержа­нии иммунологической реактивности, реализации генетической программы человека [3]. Известно, что с качественными и количественными измене­ниями кишечной микробиоты связаны многие па­тологические состояния: метаболический синдром [4], колоректальный рак [5], атеросклероз [6]. Это не только предопределяет необходимость лечения основного заболевания, но и требует коррекции кишечного микробного сообщества. Основной за­дачей при коррекции является восстановление ко­личественного уровня индигенных микросимбион­тов — бифидобактерий и лактобацилл. Для этого назначаю пробиотические препараты [7]. Однако нередко коррекция с помощью пробиотиков явля­ется неэффективной или дает непродолжительный эффект. Пробиотические микроорганизмы, особен­но те, которые не заключены в кишечнораствори­мую капсулу, при прохождении через разные отде­лы желудочно-кишечного тракта гибнут, поэтому толстого кишечника достигает лишь небольшая часть их популяции. Нередко штаммы пробиотиче­ских микроорганизмов испытывают антагонизм со стороны нормобиоты человека и гибнут в межвидо­вой борьбе либо транзитом проходят через толсто­кишечный биотоп вследствие лиганд-рецепторной несовместимости [8]. В связи с этим для нормали­зации микроэкологического равновесия приорите­том является стимуляция роста и размножения соб­ственной микробиоты.

Факторами, стимулирующими активность би­фидобактерий, являются углеводы [9], ненасыщен­ные жирные кислоты, антиоксиданты, аминокисло­ты [10]. Однако большинство средств, оказываю­щих пребиотическое и метабиотическое действие, не обладают селективностью, что затрудняет кор­рекцию микроэкологических нарушений. Кроме то­го, некоторые препараты имеют противопоказания. В связи с этим востребованными являются сред­ства, способные стимулировать размножение и ко­лонизационные свойства только у бифидобактерий, но не у факультативной микробиоты.

В естественных условиях микроорганизмы формируют биопленки, которые представляют со­бой высокоорганизованное структурированное ми­кробное сообщество, характеризующееся высокой устойчивостью к неблагоприятным воздействиям [11][12]. В составе биопленок обнаруживаю вне­клеточные нуклеиновые кислоты [13], которые играют огромную роль в функционировании мно­говидовых бактериальных консорциумов. Данные биополимеры наряду с экзополисахаридами форми­руют межбактериальный матрикс [14]. При экзоген­ном воздействии и разрушении внеклеточных ДНК структура биопленки нарушается, что приводит к увеличению чувствительности бактерий к окружа­ющим неблагоприятным факторам [12]. Кроме то­го, биополимеры выполняют роль аутоиндукторов, позволяющих бактериям контролировать числен­ность популяции. Изучение структуры и механиз­мов функционирования биопленок патогенных и условно-патогенных микроорганизмов позволило разработать методы и способы борьбы с биопле­ночными инфекциями [15][16]. Так, ферментатив­ное разрушение внеклеточных нуклеиновых кислот используется для повышения чувствительности па­тогенных бактерий к антибиотикам [17].

Индигенная микробиота кишечника также за­ключена в полисахаридный матрикс. От стабиль­ности пристеночной бактериальной биопленки зависит здоровье человека, поэтому возникает не­обходимость изучения особенностей жизнедеятель­ности и способов управления популяцией бифидо­бактерий, основанных на естественных механизмах функционирования биопленочных микробных со­обществ.

Цель исследования — оценка in vitro влия­ния ДНК, выделенной из пробиотического штам­ма Bifidobacterium bifidum 791, на количественный уровень и адгезивные свойства фекальных изолятов бифидобактерий и условно-патогенных микроорга­низмов разных видов.

Материалы и методы

ДНК извлекали из штамма B. bifidum 791, по­лученного из Государственной коллекции нормаль­ной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габри­чевского. Использование штамма данного вида бы­ло связано с преобладанием среди бифидобактерий у детей с эубиозом B. bifidum и высокой частотой его встречаемости у взрослых людей [1].

Предварительно выращивали культуру B. bifidum 791 в течение 48 ч на жидкой Бифидум-среде (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск) при температуре культивирования 37⁰C. Содержание бифидобакте­рий в биомассе составило 10⁸ КОЕ/мл. Бульонную культуру помещали в стерильные центрифужные пробирки и отмывали трижды фосфатным буфером (3 мМ хлорида калия, 8 мМ гидрофосфата натрия, 140 мМ хлорида натрия, 2 мМ дигидрофосфата на­трия рН 7,2) от питательной среды. На каждом эта­пе отмывки культуры от питательной среды прово­дили центрифугирование при 3-4 тыс. об/мин.

Для ресуспендирования клеточной массы ис­пользовали буферную систему в объеме 2 мл на 1 г бактериальной массы. Взвесь бактерий в буферном растворе трехкратно обрабатывали ультразвуком в дезинтеграторе «TI-H20 MF3» («Elma») с частотой 40 кГц на протяжении 30 мин. Порционная дезин­теграция микробных клеток была направлена на разрушение их клеточных стенок с максимальной возможностью сохранения целостности внутрикле­точных структур. Далее при 5 тыс. об/мин проводи­ли центрифугирование.

Полученные супернатанты очищали от разру­шившихся бактериальных компонентов хромато­графически на Сефарозе CL-4B. Элюирование ДНК проводили физиологическим раствором.

Наличие двуцепочечной ДНК определяли при электрофорезе аликвоты образца объемом 10 мкл в 3% агарозном геле с применением бромистого этидия в качестве красителя. Электрофорез осущест­вляли при напряжении электрического поля 200 В в течение 15 мин.

С полученной ДНК снимали инфракрасные спектры на спектрофотометре «СФ-2000». Соглас­но методике [18] измеряли поглощение пробы при λ = 260 и λ = 280, что позволило определить чистоту образца и концентрацию ДНК.

Для определения характера воздействия выделенной ДНК в качестве тест-культур использовали B. bifidum (n = 10), B. infantis (n = 12), B. breve (n = 15), изолированные из кишечника взрослых относительно здоровых людей. Влияние раствора ДНК на размножение условно-патогенных кишечных микросимбионтов оценивали на кишечных изолятах Escherichia coli lac– (n = 8), Staphylococcus aureus (n = 10), Candida albicans (n = 10), Enterococcus faecalis (n = 8). Идентификацию всех микроорганизмов проводили на основании комплекса морфологических, культуральных и биохимических свойств. Биохимическую идентификацию вели с использованием коммерческих тест-систем «ENTERO-TEST» («Lachema»), «ANAERO-TEST 23» («Lachema»), «AUXOCOLOR» («BioRad»). Оценивали влияние раствора ДНК на специфическую адгезию, аутоагрегацию бифидобактерий и условно патогенных микросимбионтов. Показатели специфической адгезии изучали на модели эритроцитов человека 0(I) группы Rh+ [19]. Определяли индекс адгезии микроорганизмов (ИАМ). Низкоадгезивными считали микроорганизмы при ИАМ = 1,76–2,5; среднеадгезивными — при ИАМ = 2,51–4,0; высокоадгезивными — при ИАМ > 4,0. Аутоагрегацию бактерий (А) исследовали по методу [20]. Культуры относили к низкоагрегативным штаммам при А < 10%, к среднеагрегативным — при А = 10–40% и к высокоагрегативным — при А > 40%.

Изучали in vitro влияние выделенного фактора на бифидофлору и условно-патогенные микросимбионты. Бифидобактерии предварительно выращивали на плотной Бифидум-среде (все среды — производства ФБУН ГНЦ ПМБ) в анаэробных условиях с использованием газогенерирующих пакетов («Новое дело») и анаэростатов («BBL»). Факультативные бактерии выращивали на мясо-пептонном агаре, грибы — на среде № 2 Сабуро.

Брали 4 стерильные пробирки и разливали следующие ингредиенты:

• в первую пробирку помещали 9,5 мл жидкой Бифидум-среды и 0,5 мл раствора ДНК;
• во вторую пробирку — 8 мл среды и 2 мл раствора нуклеиновой кислоты;
• в третью пробирку — 7 мл среды и 3 мл раствора ДНК. Конечная концентрация ДНК в каждой пробирке в расчете на 1 мл составила 3,54, 14,15 и 21,23 мкг соответственно;
• в четвертую пробирку — жидкую Бифидум-среду в объеме 10 мл (контроль).

Во все пробирки вносили по одной колонии тест-культур (B. infantis, B. bifidum, B. breve) и культивировали 1 сут при 37ºС. Содержимое пробирок титровали от 10–1 до 10–9 КОЕ/г, затем проводили высев на плотную питательную среду. Чашки инкубировали в анаэробных условиях в течение 2 сут при 37.С, после этого в высевах из наибольшие раз­ведений подсчитывали колонии, результат выража­ли в КОЕ/мл.

Влияние раствора ДНК на факультативных представителей кишечного микробиоценоза изуча­ли аналогичным образом на мясо-пептонном бульо­не и жидкой среде Сабуро. После сокультивирова­ния раствора ДНК и условно-патогенных микроор­ганизмов проводили высев на плотные питательные среды. Лактозонегативные E. coli культивировали на среде Эндо, энтерококки — на энтерококкагаре, стафилококки — на желточно-солевом агаре, грибы c. albicans — на агаризированной среде №2 Сабуро.

Для обработки полученных данных использо­вали программный комплекс «PS IMAGO» («IBM SPSS Statistics»). Описательная статистика пред­ставлена средними значениями количественных по­казателей в виде медианы и значений 25-го и 75-го квартилей. Характер распределения данных оцени­вали с помощью визуального метода, путем постро­ения гистограмм. В связи с тем, что данные были распределены асимметрично, достоверность разли­чий оценивали, используя критерий U Манна-Уит­ни и критерий χ². Значимыми считали различия при р < 0,05.

Результаты

Выделенная ДНК по спектрофотометрическим характеристикам соответствовала ДНК высокой степени очистки, т.к. соотношение ОП₂₆₀/ОП₂₈₀ об­разца составило 1,88 [18]. В полученном растворе содержалось 70,75 мкг/мл двуцепочечной ДНК.

Установлено, что раствор ДНК с концентра­цией 3,54 мкг/мл не обладал способностью стиму­лировать размножение бифидобактерий, т.к. коли­чественное содержание тест-культур не отличалось от контрольной пробирки (таблица) (p = 0,61). Раствор с содержанием ДНК 14,15–21,23 мкг/мл стимулировал размножение B. bifidum и B. breve, т.к. их титры были на 2 lg КОЕ/мл выше, чем в контроле (p = 0,01). Однако он не влиял на размножение B. infantis, потому что количество бифидобактерий в опытных пробирках не отличалось от их содержания в контрольной пробе (p = 0,64).

При оценке влияния раствора ДНК на количественный уровень условно-патогенной микробиоты установлено отсутствие его стимулирующего влияния на E. coli lac–, S. aureus, C. albicans, E. faecalis. После соинкубирования факультативной микробиоты с ДНК B. bifidum 791 содержание вышеуказанных условно-патогенных бактерий не отличалось от контроля (p = 0,73).

Количественный уровень является важным, но не единственным фактором для формирования биопленок и поддержания стабильности микробного сообщества. Поддержание гомеостаза макроорганизма возможно только при контактном взаимодействии микросимбионтов и слизистой кишечника. Установлено, что выделенная ДНК не влияла на показатели специфической адгезии бифидобактерий. Среднее значение ИАМ бифидобактерий до культивирования с раствором ДНК для штаммов B. bifidum составило 2,71 (2,53; 3,43), для B. infantis — 3,2 (2,7; 3,54), для B. breve — 3,4 (2,9; 3,8), после культивирования бифидобактерий с раствором ДНК — 2,87 (2,67; 3,1), 3,3 (2,8; 3,5) и 3,1 (2,8; 3,3) соответственно (p = 0,8). При этом аутоагрегация фекальных штаммов B. bifidum увеличилась с 34,41 до 54,3% (p = 0,04), B. infantis — с 24,3 до 48,1% (p = 0,01), B. breve — с 28,4 до 45,6% (p = 0,05).

Количественное содержание Bifidobacterium spp. и условно-патогенных бактерий при культивировании in vitro с ДНК пробиотического штамма, lg КОЕ/мл, Me (LQ; UQ)
Quantitative content of Bifidobacterium spp. and opportunistic bacteria cultivated in vitro with DNA of probiotic strain, lg CFU/ml, Me (LQ; UQ))

Примечание. * Статистически значимые различия между опытом и контролем при достигнутом уровне значимости p = 0,01.
Note. * Statistically significant differences between experiment and control at the achieved significance level p = 0.01.

Раствор ДНК B. bifidum 791 не оказывал вли­яния на адгезивные свойства условно-патогенных микроорганизмов. Так, показатели адгезии до и после обработки раствором ДНК у E. coli lac- со­ставили 2,8 (2,7; 3,8) и 3,08 (2,7; 3,8) (р = 0,8), у S. aureus — 3,54 (2,72; 3,9) и 3,95 (2,9; 4,0) (р = 0,6), у E. faecalis — 3,1 (2,6; 3,3) и 3,48 (2,8; 3,5) (р = 0,8), у C. albicans — 2,1 (1,5; 2,2) и 3,08 (1,7; 3,2) (р = 0,6) . При этом установлено увели­чение показателей аутоагрегации у E. coli lac- с 10,9 до 25,3% (р = 0,05).

Обсуждение

Микробиота кишечника представляет собой многокомпонентное сообщество, которое функ­ционирует в виде биологических пленок [11][15]. Формирование биопленок рассматривают как ме­ханизм, позволяющий успешно выживать популя­циям в изменяющейся и неблагоприятной окру­жающей среде. Наиболее значимыми являются коммуникативные взаимодействия между микро­организмами [21], которые представляют собой целую систему, обеспечивающую популяционный ответ на любой экзогенный раздражитель. В ка­честве сигналов, модулирующих поведение всей популяции микроорганизмов, используются бакте­риальные метаболиты [21], а также продукты ми­кробного распада, например нуклеиновые кислоты [13][21]. Однако известно также, что бактерии еще при жизни способны выделять ДНК в межклеточ­ный матрикс биопленок [13][18]. Основное ее от­личие от ДНК, попавшей в матрикс из погибших клеток, — это одинаковый размер фрагментов, равный 21 000 кД. Такую ДНК рассматривают как продукт метаболизма бактерий.

В опытах in vitro показано, что выделенная из бульонной культуры B. bifidum 791 ДНК обладает бифидогенным эффектом. Стимуляция размноже­ния бифидобактерий, вероятно, обусловлена не­сколькими механизмами. Основной механизм — аутоиндукторная роль ДНК бифидобактерий с последующей активацией генов, ответственных за размножение [13][14]. Еще один механизм — стиму­ляция факторов колонизации за счет использования микробным сообществом внеклеточной ДНК как дополнительного источника нутриентов: фосфа­тов, связанного азота и углерода. Установлено, что в присутствии раствора ДНК увеличивается ауто­агрегация как бифидобактерий, так и некоторых условно-патогенных микросимбионтов, потому что ДНК представляет собой «липкую» молекулу, спо­собную связываться как с гидрофильными, так и с гидрофобными поверхностями бактериальных кле­ток [13]. Аутоагрегативные свойства микроорганиз­мов способствуют формированию микроколоний, что повышает возможность выживания бактерий при воздействии неблагоприятных условий. Увели­чение аутоагрегации индигенной микробиоты ведет к увеличению антагонизма бифидобактерий к ус­ловно-патогенным микроорганизмам, т.к. высоко­агрегативные бифидобактерии способны выводить из кишечника транзиторные бактерии, блокируя их взаимодействие с рецепторами слизистой оболочки [11]. Однако рост аутоагрегации E. coli lac- в при­сутствии раствора ДНК является нежелательным эффектом, поэтому данный компонент целесоо­бразно использовать после селективной деконтами­нации кишечника.

Заключение

Раствор ДНК пробиотического штамма B. bifidum 791 является бактериальным продуктом, кото­рый in vitro способен регулировать колтественный уровень и аутоагрегативные свойства фекальных изолятов B. bifidum, B. breve, что свидетельствует о перспективности использования данного компо­нента в качестве средства для коррекции кишечного микробиоценоза.

About the authors

Yulia V. Zakharova

Kemerovo State Medical University

Author for correspondence.
Email: yvz@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-3475-9125

Yulia V. ZakharovaM — Cand. Sci. (Med.), Assoc. Prof., Chair of microbiology, immunology and virology.

650056, Kemerovo

Россия

Andrey S. Sukhikh

Kemerovo State Medical University

Email: suhih_as@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-9300-5334

Andrey S. Sukhikh — Cand. Sci. (Pharm.), Assoc. Prof., senior researcher, Central research laboratory.

650056, Kemerovo

Россия

Lyudmila A. Levanova

Kemerovo State Medical University

Email: micro@kemsma.ru
ORCID iD: 0000-0002-5977-9149

Lydmila A. Levanova — D. Sci. (Med.), Assoc. Prof., Head, Chair of microbiology, immunology and virology.

650056, Kemerovo Россия

Ekaterina Yu. Plotnikova

Kemerovo State Medical University

Email: eka-pl@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-6150-1808

Ekaterina Yu. Plotnikova — D. Sci. (Med.), Prof., Professor of the Department of outpatient therapy, postgraduate training and nursing.

650056, Kemerovo Россия

References

Supplementary files