Rapid diagnostics of genital herpes by loop-mediated isothermal amplification method with fluorescent detection

D. I. Smirnova; Смирнова Д. И.; O. A. Petrusha; Петруша О. А.; A. V. Gracheva; Грачёва А. В.; E. A. Volynskaya; Волынская Е. А.; V. V. Zverev; Зверев В. В.; E. B. Faizuloev; Файзулоев Е. Б.

doi:10.36233/0372-9311-2019-6-40-46

Rapid diagnostics of genital herpes by loop-mediated isothermal amplification method with fluorescent detection

Authors: Smirnova D.I.¹, Petrusha O.A.¹, Gracheva A.V.¹, Volynskaya E.A.¹, Zverev V.V.¹, Faizuloev E.B.¹
Affiliations:
1. I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Issue: Vol 96, No 6 (2019)
Pages: 40-46
Section: ORIGINAL RESEARCHES
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/493
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-6-40-46
ID: 493

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Due to the high clinical significance of herpesvirus diseases, the searching of fast and effective methods for their diagnosis remains relevant.

The aim of the study was to evaluate the diagnostic efficiency of the loop-mediated isothermal amplification of DNA with real-time fluorescent detection (RT-LAMP) with SYTO-82 dye on a model of herpes simplex virus (HSV) infection.

Materials and methods. A total of 44 urogenital swabs containing type 1 and type 2 HSV DNA and 43 swabs without HSV DNA, including 33 samples containing the DNA of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and herpesvirus type 6, were studied. For RT-LAMP, Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase, SYTO-82 dye, LAMP primers were used.

Results. The high efficiency of HSV DNA detection in the RT-LAMP reaction with SYTO-82 dye was shown. RT-LAMP in optimal conditions allowed to reduce reaction time for 2-3 times compared to real-time PCR (to 35 minutes). Analytical sensitivity of HSV type 1 and 2 detection in RT-LAMP was 103 copies of DNA/ml. The diagnostic sensitivity and specificity of the RT-LAMP diagnosis of HSV infection were 96% and 100%, respectively.

Discussion. RT-LAMP method has a high sensitivity and specificity comparable to RTPCR, while the risk of false positive results obtaining is minimal.

Conclusion. Thus, the reaction of RT-LAMP with SYTO-82 dye allows quickly, with high sensitivity and specificity to detect HSV DNA in clinical material and can be considered as a promising point-of-care testing method.

Keywords

loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP, SYTO-82, herpes simplex virus, point-of-care testing

Full Text

Введение

Герпесвирусные инфекции представляют собой группу широко распространённых антропонозных инфекционных болезней, вызываемых вирусами семейства Herpesviridae. Вирусы этого семейства способны персистировать и могут присутствовать в тканях хозяина в латентной форме на протяжении всей жизни. В России ежегодно около 20 млн человек переносят инфекции, вызванные вирусами простого герпеса 1-го (ВПГ-1) и 2-го типа (ВПГ-2), что превышает соответствующий показатель для гепатитов B, C, D и ВИЧ-инфекции. В европейских странах инфицированность ВПГ-1 достигает 50-80%, ВПГ-2 10-25% [1-3]. Герпесвирусы могут быть причиной тяжёлой клинической патологии, в ряде случаев приводящей к летальному исходу, особенно у лиц с выраженными нарушениями иммунитета. Наибольшую угрозу для здоровья представляют герпетические нейроинфекции, включая менингит и энцефалит (летальность достигает 20%, частота инвалидизации 50%), офтальмогерпес (развитие катаракты или глаукомы почти в 50% случаев), генитальный герпес (существенное снижение качества жизни), неонатальный герпес (уносит жизни до 80% инфицированных новорождённых) [2, 3]. ВПГ занимает важное место в группе возбудителей TORCH-инфекций, представляя серьёзную угрозу для репродуктивного здоровья населения [1, 2].

Для диагностики герпесвирусной инфекции можно использовать весь арсенал методов лабораторной диагностики: выделение вируса на чувствительных клеточных культурах, определение вирусного антигена с использованием различных иммунохимических методов, выявление ДНК вирусов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), определение специфических антител. Наиболее эффективно одновременное использование нескольких методов диагностики [1].

В то же время актуален поиск новых эффективных методов для быстрой и высокочувствительной диагностики на месте оказания медицинской помощи. В связи с этим заслуживают внимания методы изотермической амплификации нуклеиновых кислот, в том числе метод петлевой изотермической амплификации ДНК (LAMP), разработанный T. Notomi и соавт. [4]. Среди модификаций метода LAMP наибольший интерес представляет LAMP-анализ с детекцией в режиме реального времени (LAMP-РВ), поскольку он минимизирует риск контаминации ампликонами и позволяет оценивать количество исследуемой ДНК. Ранее И.П. Оскорбин и соавт. исследовали несколько интеркалирующих красителей ДНК на модельных образцах плазмидной, фаговой и бактериальной ДНК и показали, что в LAMP-РВ краситель SYTO-82 обеспечивает наибольшее соотношение сигнал/фон и наименьшее время появления сигнала (time-tothreshold, Tt) [5]. Нам представилось целесообразным исследовать диагностическую ценность LAMP-РВ с красителем SYTO-82 на клинических образцах от пациентов с генитальной герпесвирусной инфекцией.

Целью настоящей работы была оценка диагностической эффективности метода LAMP с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (LAMP-РВ) с красителем SYTO-82 на модели инфекции ВПГ.

Материалы и методы

Клинические образцы (урогенитальные соскобы) от пациентов с ВПГ-инфекцией (n = 44) и пациентов контрольной группы (n = 43) предоставлены клинико-диагностической лабораторией «ДиаЛаб Плюс» (Россия). Во всех образцах контрольной группы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) не была выявлена ДНК ВПГ, но 33 образца содержали ДНК одного из герпесвирусов цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр или вируса герпеса 6-го типа. Выделяли ДНК из клинических образцов с помощью набора реагентов «Мультиген-Реалекс» («Генлаб», Россия). Лабораторные штаммы ВПГ-1 (штамм VR3) и ВПГ-2 (штамм MS2) получены из коллекции вирусов ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.

Для дифференциального выявления ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2 в ПЦР-РВ использовали праймеры и зонды к гену белка gB, описанные в статье L. Namvar и соавт. [6]. Амплификацию проводили с использованием набора реагентов «2,5х реакционная смесь для ПЦР-РВ» (ООО «Синтол», Россия). Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала по 5 пмоль каждого праймера и 5 пмоль зонда. Температурно-временной режим: 95 °С 90 с (1 цикл), 95 °С 20 с, 58 °С 50 с (45 циклов).

Для постановки реакции LAMP были использованы наборы праймеров к гену gG (гликопротеин G) ВПГ-1 и ВПГ-2, описанные Y. Enomoto и соавт. (далее наборы праймеров EH1 и EH2 соответственно) [7]; к гену UL2 (урацил-ДНК-гликозилаза), описанные H. Kaneko и соавт. (далее наборы праймеров КН1 и КН2 соответственно) [8] и краситель SYTO-82 (Invitrogen, США). Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала 8 ед. ДНК-полимеразы Bst 2.0 WarmStart (BioLabs, Великобритания), 2,5 мкл 10х буфера для Bst полимеразы, MgSO4 8 мМ, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов 2 мМ каждого (ООО «Синтол», Россия), смесь праймеров по 5 пмоль праймеров F3 и B3, по 50 пмоль праймеров FIP и BIP, по 20 пмоль LPF и LPB, краситель SYTO-82 (1 мкМ). Температурно-временной режим: 65 °С 60 мин; 80 °С 10 мин. Для регистрации флуоресценции красителя SYTO-82 использовали цветовой канал HEX.

ПЦР-РВ и LAMP-РВ проводили в амплификаторе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия). Значения Tt и порогового цикла в ПЦР-РВ определяли автоматически с помощью программы RealTime_PCR v.7.7 («ДНК-Технология», Россия) на основе математического анализа формы кривой амплификации (метод геометрический). Все праймеры и зонды синтезированы в OOO «Синтол» (Россия). Визуальную детекцию результатов LAMP и ПЦР-РВ проводили методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием, а для LAMP также путём добавления 10 мкл раствора SYBR Green I (разведение 1 : 100) (кат. № S9430, Sigma-Aldrich) к 10 мкл продуктов реакции амплификации. Для достижения большей контрастности содержимое пробирок разбавляли водой в 5 раз.

Для оценки аналитической чувствительности LAMP и ПЦР анализировали последовательные 10-кратные разведения ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2 с известной концентрацией: от 1 х 10⁸ до 1 ^χ 10¹ копий/мл. Диагностическую чувствительность LAMP рассчитывали, определяя долю положительных результатов LAMP для клинических образцов, в которых методом ПЦР-РВ была обнаружена ДНК ВПГ. Диагностическую специфичность LAMP рассчитывали определением доли отрицательных результатов LAMP для клинических образцов, в которых методом ПЦР-РВ не была обнаружена ДНК ВПГ.

Достоверность различий между двумя независимыми результатами определяли по ί-критерию Стьюдента.

Результаты

Ранее в работах Y Enomoto и соавт. [7] и H. Kaneko и соавт. [8] показана высокая эффективность метода LAMP с электрофоретической детекцией результата в диагностике заболеваний, вызванных ВПГ-1 и ВПГ-2. Мы исследовали эффективность выявления герпесвирусной ДНК в клинических образцах методом LAMP-РВ с применением интеркалирующего красителя ДНК SYTO-82.

На первом этапе были синтезированы наборы праймеров EH1, KH1, EH2, KH2 [7, 8] и проверены в реакции LAMP с электрофоретической детекцией. На рис. 1 представлены результаты электрофоретического анализа ампликонов, полученных при LAMPанализе ДНК лабораторных штаммов ВПГ-1 и ВПГ-2 с помощью разных наборов праймеров. Продукты реакции распределились в геле в виде характерной «лесенки», что свидетельствует о положительном результате LAMP-анализа образцов вирусной ДНК и корректной работе всех наборов праймеров. В качестве дополнительного референсного метода была использована визуальная детекция результата с красителем SYBR Green I (рис. 2). Ярко-зелёная флуоресценция свидетельствует о положительном результате реакции, тогда как при отрицательном результате свечение отсутствует.

Рис. 1. Электрофоретический анализ LAMP-ампликонов в 1,5% агарозном геле. Дорожки: 1-3 ДНК ВПГ-1 с праймерами KH1; 5-7 ДНК ВПГ-1 с праймерами KH2; 9-11 ДНК ВПГ-2 с праймерами EH1; 13-15 ДНК ВПГ-2 с праймерами EH2.

Рис. 2. Визуальная детекция LAMP-ампликонов. Пробирки: 1-3 ДНК ВПГ-1; 4 отрицательный контроль; 5-7 ДНК ВПГ-2; 8 отрицательный контроль.

На следующем этапе сравнивали эффективность LAMP-РВ-амплификации с красителем SYTO-82 и разными наборами праймеров: EH1, KH1, EH2, KH2. На основе LAMP-РВ-анализа контрольных образцов ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2 было определено среднее значение Tt. Для ВПГ-1 с праймерами EH1 оно составило 8,17 ± 0,09 мин, с праймерами KH1 20,3 ± 0,3 мин (разница 12,1 мин; p < 0,0001). Для ВПГ-2 с праймерами EH2 27 ± 0,5 мин, с праймерами KH2 37,03 ± 2,1 мин (разница 10 мин;p < 0,05). В дальнейшей работе использовали только праймеры EH1 и EH2, позволившие на 10-12 мин сократить время выявления вирусной ДНК, и, следовательно, обеспечившие большую эффективность амплификации. Краситель SYTO-82 обеспечивал высокую эффективность разгорания флуоресцентного сигнала со значениями отношения сигнал-фон, достигающими 13-18 (рис. 3).

Рис. 3. Выявление ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2 наборами праймеров EH1 и EH2 в реакции LAMP-РВ. 1 ДНК ВПГ-1, праймеры EH1; 2 ДНК ВПГ-2, праймеры EH2; Kотрицательный контроль. По оси абсцисс время, мин; по оси ординат относительные единицы флуоресценции.

Для определения влияния температурного режима на эффективность амплификации была проведена LAMP-РВ при различной температуре от 57 до 67 °С с шагом 0,85 °С. Чёткой корреляции между температурой амплификации и Tt не прослеживалось, однако отмечена тенденция к положительному влиянию повышения температуры на эффективность амплификации.

С целью определения аналитической чувствительности LAMP-РВ были проанализированы последовательные разведения образцов ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2. Аналитическая чувствительность реакции LAMP-РВ с праймерами (EH1, EH2) была сопоставима с чувствительностью ПЦР-РВ и составила примерно 10³ копий/мл. При этом время выявления герпесвирусной ДНК на пределе чувствительности составляло для LAMP-РВ 25-30 мин, тогда как для ПЦР-РВ 75-80 мин. Таким образом, в реакции LAMP-РВ ответ может быть получен в 2,5-3 раза быстрее, чем в ПЦР-РВ.

Пробоподготовку клинических образцов для LAMP-диагностики проводили с помощью экспресс-набора «Мулитиген-Реалекс» («Генлаб», Россия), рекомендованного производителем для ПЦР-диагностики. Этот набор очень прост в использовании и позволяет проводить пробоподготовку быстро в течение 20 мин. Выделение ДНК происходит за счёт лизирующего реагента и сорбента, связывающего белки и низкомолекулярные компоненты клеток, благодаря чему они выпадают в осадок, тогда как ДНК остаётся в растворе. Выделенная ДНК используется без дополнительной очистки, что может стать причиной наличия в растворе ингибиторов ферментативных реакций. В нашей работе признаков ингибирования реакции LAMP-РВ не выявлено.

При LAMP-анализе клинических образцов, содержащих ДНК ВПГ (n = 44), было выявлено два несовпадения с данными ПЦР-РВ. Таким образом, диагностическая чувствительность LAMP составила 96%. При LAMP-анализе образцов, не содержащих ДНК ВПГ (n = 43), ложноположительных результатов не выявлено, диагностическая специфичность метода составила 100%. Также не было выявлено перекрёстных реакций с другими герпесвирусами человека (вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус, вирус герпеса 6-го типа), присутствующими в ряде клинических образцов.

Обсуждение

Наиболее часто в диагностике герпесвирусных заболеваний используется метод ПЦР, отличающийся высокой чувствительностью и специфичностью [2]. Метод ПЦР-РВ даёт надёжный результат, но требует относительно долгого времени ожидания ответа, особенно в случаях, когда необходимо доставить образец в удалённую лабораторию. Существенным недостатком метода ПЦР является сложность его применения вне специализированной лаборатории на месте лечения или в отдалённых от лаборатории населённых пунктах. Экспресс-методы иммунохроматографии или латекс-агглютинации очень просты и удобны в применении и позволяют быстро получить ответ в течение 10-15 мин, однако обладают недостаточной чувствительностью при выявлении герпесвирусного антигена.

Метод LAMP-РВ имеет высокие, сопоставимые с ПЦР-РВ чувствительность и специфичность, но при этом позволяет получать ответ в 2,5-3 раза быстрее. Одним из важных факторов высокой эффективности амплификации и достижения максимальной аналитической чувствительности LAMP-РВ является использование «петлевых» праймеров. Стандартный набор праймеров для постановки реакции LAMP состоит из четырёх олигонуклеотидов: пары внутренних (FIP и BIP) и пары наружных (F3 и B3). Однако в работах Y. Enomoto и соавт. [7] и H. Kaneko и соавт. [8] была использована дополнительная пара так называемых петлевых праймеров (LPF и LPB), обеспечивающих повышение эффективности амплификации [9]. В специальном эксперименте мы показали, что удаление из состава реакционной смеси петлевых праймеров более чем на полчаса увеличивает значение Tt.

Использование интеркалирующих красителей ДНК является эффективным подходом, позволяющим проводить не только визуальную детекцию продуктов LAMP, но также и флуориметрическую детекцию «по конечной точке» или в режиме реального времени [10]. В настоящей работе при детекции результатов LAMP-РВ с красителем SYTO-82 было отмечено высокое отношение сигнал-фон, достигающее значений 1318, что свидетельствует о высокой эффективности амплификации и гарантирует надёжную интерпретацию результата. Важно отметить, что детекция результатов LAMPРВ не требует открывания пробирок, что минимизируют риск получения ложноположительных результатов в результате контаминации реакционных смесей ампликонами. Определение в LAMP-РВ значения Tt позволяет также оценивать вирусную нагрузку в исследуемых образцах.

Реакция LAMP проходит при постоянной температуре за счёт использования ДНК-полимеразы термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus (Bst ДНК-полимераза), обладающей 5’-3’-ДНК-полимеразной активностью, способностью к замещению (вытеснению) цепей ДНК и без 5 -3 -экзонуклеазной активности. Благодаря этому данный метод не требует сложного и дорогого оборудования и позволяет использовать портативные анализаторы (весом менее 2 кг), включающие твердотельный термостат, оптический блок, встроенный или внешний компьютер.

Заключение

Метод LAMP-РВ с красителем SYTO-82 позволяет выявлять в клиническом материале ДНК ВПГ с чувствительностью и специфичностью, сопоставимой с ПЦР-РВ. Вместе с тем он обладает рядом преимуществ, которые открывают перспективы разработки на его основе наборов реагентов для диагностики инфекционных заболеваний на месте оказания медицинской помощи. Простая пробоподготовка и изотермические условия реакции LAMP-РВ позволяют проводить её с помощью портативных приборов и минимального набора инструментов, при этом продолжительность реакции LAMP-РВ в 2,5-3 раза меньше, чем у ПЦР-РВ. Краситель SYTO-82 не ингибирует реакцию LAMP и обеспечивает хороший прирост флуоресценции, что позволяет надёжно интерпретировать результат. Одним из факторов, ограничивающих применение метода в условиях России, является отсутствие отечественных портативных термостатируемых флуориметров.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.