Molecular-genetic study of the RA-27/3 strain used for production of rubella vaccine

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Краснуха является контагиозным заболеванием средней тяжести и характери- зуется невысоким подьемом температуры, кореподобной сыпью и лимфоаденопа- тией. Вирус краснухи, вызывающий данное заболевание, относится к роду Rubivirus семейству Togaviridae [7, 14]. По нуклеотидной последовательности вирус краснухи разделен на две клады, вклю-чающие в себя 13 генотипов. К первой кладе относятся 10 генотипов (1a-1J), ко второй кладе — три (2A-2C). Генотипирование вируса крас- нухи проводится по нуклеотидной последова-тельности фрагмента кДНК области кодирующей белок оболочки E1 (позиция референсной последовательности генома: 8731-9469) длиной не менее 739 п.н [7, 14]. Эффективным средством профилактики заболевания является вакцинация. Для ее проведения было разработано девять вакцин на основе аттенуированных штаммов вируса краснухи [12]. Пять вакцин разработаны и производятся в Японии с использованием штаммов Matsuba, Matsuura, TCRB19, TO-336, KRT [11-13]. В КНР используется штамм BRD-2 [16]. Штаммы HPV-77 и Cendehill использова- лись для производства вакцин в США [6, 12]. Штамм RA-27/3 используется мно- гими производителями вакцины против краснухи, такими как, Merck &Co. Inc, GSK Biologicals, НПО «Микроген», Serum Institute of India (Индия), Institute of Immunology (Хорватия) [12, 13, 15]. Современные требования к производству вак- цинных препаратов, содержащих живые вакцинные штаммы вирусов, предполага- ют контроль генетической стабильности производственных штаммов, в том числе, вируса краснухи, что рекомендовано ICH и ГФ РФ XIII [1, 8]. Все производители, кроме Serum Institute of India (Индия) и Institute of Immunology (Хорватия), сдела- ли доступной информацию о нуклеотидной структуре производственных штаммов RA-27/3 вируса краснухи и об их генетической стабильности [12, 15]. Наличие ин- формации о нуклеотидной структуре штаммов позволяет применить молекулярно- генетические методы для контроля подлинности вакцинных штаммов, причем, не только на этапах производства, но и в готовых сериях вакцины. Регламентированный ГФ РФ XIII метод определения подлинности производственного штамма вакцины против краснухи, также, как производственных штаммов вакцин паротитной и ко- ревой, на самом деле, не позволяет подтвердить подлинность именно производс- твенного штамма. Метод нейтрализации вируса специфической иммунной сыво- роткой позволяет только подтвердить принадлежность исследуемого вакцинного штамма вируса к роду и семейству. Для вирусов кори, паротита и краснухи описан высокий серологический перекрест между штаммами — т.е. иммунная сыворотка, полученная к вакцинному штамму обладает вируснейтрализующей активностью по отношению к другим щтаммам семейства [3-5, 9, 10]. Ранее была продемонстрирова- на возможность использования метода полиморфизма длин рестрикционных фраг- ментов (Restriction fragment length polymorphism — RFLP) для дифференциальной диагностики и подтверждения подлинности вакцинного штамма вируса паротита «Ленинград-3» (НПО «Микроген») [2]. Целью настоящей работы было исследование структуры производственного и посевного штамма RA-27/3 вируса краснухи, используемого НПО «Микроген» для производства моновалентной и трехкомпонентной вакцин, а также изучение воз- можности применения молекулярно-генетических методов для подтверждения под- линности производственного штамма в готовой форме вакцины. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы В работе использован вирус краснухи штамм «Орлов» (генотип 2с), предостав- ленный СПб НИИ вакцин и сывороток. Штамм использовался в качестве контроля при проведении рестрикционного анализа вакцинных штаммов вируса краснухи. В работе использованы вакцины следующих производителей: Serum Institute of India (SII) — вакцина против кори, паротита и краснухи живая аттенуированная (четыре серии), вакцина против краснухи живая аттенуированная (одна серия). GlaxoSmithKlein Biologicals (GSK) — «Приорикс» — вакцина против кори, паро- тита и краснухи живая аттенуированная (три серии). Merck&Co., Inc (Merck) — «ProQuad», вакцина против кори, паротита, краснухи и ветряной оспы (одна серия). НПО «Микроген»: вакцина против краснухи живая аттенуированная (3 серии), вакцина паротитная (штамм «Ленинград-3») (1 серия), вакцина против кори живая аттенуированная (штамм «Ленинград-16») (1 серия). Производственный штамм ви- руса краснухи RA-27/3 (се-рия №2), посевной вирус штамм RA-27/3 вируса крас- нухи (серии №3, 4). Комбинированная вакцина против кори, краснухи и паротита «Вактивир» (серии М0015эк, М0020эк, М0021эк). Для выделения РНК из образцов использовали набор «РИБО-сорб» («АмплиСенс», Россия). Все работы по выделению РНК проводили согласно инс- трукции, прилагаемой к набору. Выделенная РНК находилась в объеме 50 мкл. Все эксперименты проводились с использованием ферментов и компонентов реакцион- ных смесей производства НПО «СибЭнзим» (Россия). Плазмида ДНК pUCRA27/1 (кат.№ D17). Плазмида содержит вставку фрагмен- та кДНК вируса краснухи, штамм RA-27/3, длиной 589 п.н., соответствующих по- зициям 3669-4538 п.н. в геноме вируса краснухи. Фрагмент имеет сайт рестрикции рестриктазой ZraI (или AatII), позволяющий получить фрагменты с длинами 251 п.н. и 338 п.н. Получение кДНК из препаратов РНК. Реакционная смесь при проведении ре- акции обратной транскрипции в объеме 50 мкл содержала: ОТ-ПЦР-смесь — реак- ционный буфер, смесь дНТФ, 50мМ MgCl2, специфические праймеры (кат.№ E317, № В309, №025) — 47,1 мкл; HS Taq полимераза (кат. №В309) — 0,4 мкл; M-MuLV ревертаза (кат.№Е317) — 0,5мкл; РНК исследуемого образца — 2 мкл. Реакцию про- водили в течение 30 мин при 450С. ПЦР-амплификация фрагментов ДНК длиной 589 п.н. и их гидролиз эндо- нуклеазой рестрикции ZraI. После прохождения реакции обратной транскрипции проводилась ПЦР в тех же пробирках, поскольку все необходимые компоненты ПЦР уже содержались в растворах, а матрицей могла служить кДНК, наработанная с вирусной РНК. Термоциклирование проводили в следующем режиме: предвари- тельный прогрев при 95°С — 3 мин, далее 35 циклов амплификации (95°С — 15 сек, 63°С — 20 сек, 68°С — 5 сек, 72°С — 40 сек). После прохождения ПЦР к 25 мкл полученной смеси добавляли 5 мкл буфера для рестрикции «ROSE» (кат.№B021) и 20 мкл воды, затем делили на две аликвоты по 25 мкл и к одной из них добавляли 1 мкл рестриктазы ZraI. После инкубации в течение 1 часа при 37°С пробы наносили на 1,5% агарозный гель и проводили электрофорез в 1хTAE-буфере. Для определения полных последовательностей производственного штамма и посевного вируса штамма RA-27/3 (НПО «Микроген») были синтезированы прай- меры, полностью перекрывающие последовательность генома вируса краснухи с шагом 500 п.н. Секвенирование проводили на приборе Prism 310 Genetic Analyzer с использова- нием набора BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Анализ данных секвенирования проводили с использованием программы Chromas 2.22 (Techne-lysium Pty Ltd, Австралия). Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Изучение первичной структуры полноразмерных геномов производственно- го штамма и посевного вируса штамма вируса краснухи RA-27/3 НПО «Микроген». Производственный штамм вируса краснухи RA-27/3 (серия №2) прошел 26 пасса- жей на культуре клеток WI-38 и три пассажа на клетках MRC-5. Посевной вирус штамм RA-27/3 (серия №3) прошел 26 пассажей на культуре клеток WI-38 и четы- ре пассажа на клетках MRC-5. Указанные серии были приготовлены в 2008 году. В 2012 году из производственного штамма (серия №2) была приготовлена серия №4 посевного вируса краснухи с тем же количеством пассажей, что и серия №3. В процессе производства вакцины посевной вирус проходит один пассаж на куль- туре клеток MRC-5. Пассажные истории штаммов RA-27/3, используемых GSK, Merck и НПО «Микроген», сопоставимы друг с другом [12, 15]. Результаты секвенирования кДНК производственного штамма (серия №2) пред- ставлены в GenBank (номер JF727653). Сравнительные результаты секвенирования кДНК посевного вируса (серии № 3 и 4) и кДНК штамма, полученной из готовой се- рии вакцины (номер в GenBank JF727654), приготовленной из серии №3 указанно- го посевного вируса, свидетельствуют о том, что нуклеотидные последовательности идентичны последовательностям производственного штамма. Полученные резуль- таты указывают на то, что штамм RA-27/3 НПО «Микроген» генетически стабилен на этапах производства вакцины. Сравнение полученных нуклеотидных последова- тельностей штамма RA-27/3 НПО «Микроген» с ранее опубликованным геномом штамма Wistar RA 27/3 Merck и GSK (GenBank FJ211587, FJ211588) продемонстри- ровало, что структурные последовательности штамма RA 27/3 НПО «Микроген» полностью идентичны штамму RA 27/3 указанных производителей [15]. Выбор фрагмента штамма краснухи RA-27/3, пригодного для подтверждения под- линности штамма методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Выбор фрагментов штамма RA-27/3 для дальнейшего использования RFLP осуществлял- ся по следующим критериям: А- анализ множественного выравнивания референ- сных последовательностей всех генотипов вируса, включая вакцинные штаммы; B — существование доступной отечественной эндонуклеазы рестрикции, узнающей сайт, содержащий нуклеотидную замену; C — отсутствие сайта узнавания подобран- ной рестриктазы в окрестности выявленной замены, так как дополнительный сайт может затруднить выявление нужного фрагмента после гель-электрофореза; D — уникальность замены, что проверяется при помощи программы BLAST с учетом всех неполных последовательностях из геномов вируса краснухи, внесенных в базу данных GenBank. Анализ структуры геномов штаммов вируса краснухи в области гена белка Е1 (8731-9469 п.н.). Данный участок (739 п.н.) генома вируса краснухи используется для генотипирования, поэтому для него имеется наибольшее количество первич- ных структур, выложенных в GenBank. В настоящем исследовании было проведено множественное выравнивание референсных последовательностей всех 13 геноти- пов вируса краснухи с последовательностью штамма RA-27/3 НПО «Микроген». В результате анализа было обнаружено, что фрагмент гена белка Е1 (8731-9469 п.н.) не содержит одиночных замен, присущих только штамму RA27/3, пригодных для использования в дифференциации методом RFLP. Надежная дифференци- ация штамма RA27/3 от других вакцинных и диких штаммов возможна только при использовании нескольких (не менее четырех) эндонуклеаз рестрикции для гидролиза ПЦР-продукта с участка 739 п.н. В связи с этим, был проведен анализ всех известных полных геномов вируса краснухи с целью выявить подходящие отличия последовательности штамма RA27/3 вне участка, используемого для оп- ределения генотипов. Анализ первичной структуры полноразмерных геномов штаммов вируса краснухи, представленных в базе данных GenBank. Для проведения анализа были выбраны 44 полноразмерных последовательности геномов штаммов и изолятов вируса красну- хи, которые включают представителей всех имеющихся генотипов, последователь- ности вакцинных штаммы японских и китайских производителей вакцины и после- довательности штамма RA27/3 от Merck, GSK и НПО «Микроген». Множественное выравнивание позволило обнаружить несколько нуклеотидных замен, присущих только штамму RA27/3. В результате проведенного анализа были отобраны две спе- цифические для штамма RA27/3 (НПО «Микроген», Merck и GSK) однонуклеотид- ные замены, наиболее пригодные для их дифференциации от остальных известных штаммов вируса краснухи. В позиции 2950 геном штамма RA-27/3 содержит замену C→T, что приводит к образованию сайта CATCC/GGATG узнавания эндонуклеаз рестрикции FokI и BstF5I, которые являются изошизомерами, узнающими одина- ковую последовательность, но расщепляющие ДНК в разных позициях (гетероши- зомеры). Таким образом, указанный сайт эндонуклеазы рестрикции могут быть ис- пользованы для проведения RFLP. В позиции 4220 геном штамма RA27/3 содержит замену А→G, что приводит к образованию сайта GACGTC узнавания эндонуклеаз рестрикции AatII и ZraI (гетерошизомеры по данному сайту). Из трех найденных вариантов дифференциации штамма RA27/3 преимуществом обладает последний вариант с использованием ПЦР-продукта участка, включающего в себя замену в позиции 4220 и одной из рестриктаз ZraI или AatII. Так как сайт GACGTC встреча- ется реже сайта CATCC, это упрощает анализ продуктов гидролиза. Остальные два варианта как c использованием сайта CATCC в позиции 2950, так и с использовани- ем нескольких эндонуклеаз рестрикции для расщепления ПЦР-продукта с участка 739 п.н. могут быть зарезервированы на будущее и применены в случае обнаружения диких изолятов вируса краснухи, не отличимых от штамма RA27/3 в тесте на при- сутствие сайта GACGTC в позиции 4220. Выбор праймеров для амплификации выбранного участка генома с сайтом GACGTC в позиции 4220 и расчет длин фрагментов, образующихся при гидролизе ПЦР-продук- та. Для амплификации фрагмента, содержащего сайт GACGTC, были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать фрагмент 589 п.н. — microRUf 5’ GGC TGG CCC AGG CGT ACT ACG A 3’ ; microRUr 5’ CGG CCG TCC CAA AGG TTG CA 3’ . В результате проведения ПЦР с использованием кДНК из штаммов виру- са краснухи и данных праймеров должен образоваться ампликон длиной 589 п.н. Нуклеотидная последовательность этого фрагмента для штамма RA27/3 (варианты НПО «Микроген», Merck и GSK) приведена ниже. GGCTGGCCCAGGCGTACTACGACGACCTCGAGGTGCGCCGCCTCGGG GATGACGCCATGGCCCGGGCGGCCCTCGCATCAGTCCAACGCCCTCGCAA AGGCCCTTACAATATCAGGGTATGGAACATGGCCGCAGGCGCTGGCAAGAC CACCCGCATCCTCGCTGCCTTCACGCGCGAAGACCTTTACGTCTGCCCCACC AATGCGCTCCTGCACGAGATCCAGGCCAAACTCCGCGCGCGCGATATCGACG TCAAGAACGCCGCCACCTACGAGCGCGCGCTGACGAAACCGCTCGCCGCCTA CCGCCGCATCTACATCGATGAGGCGTTCACTCTCGGCGGCGAGTACTGCGCG TTCGTTGCCAGCCAAACCACCGCGGAGGTGATCTGCGTCGGTGATCGGGACC AGTGCGGCCCACACTACGCCAATAACTGCCGCACCCCCGTCCCTGACCGCTG GCCTACCGAGCGCTCACGCCACACTTGGCGCTTCCCCGACTGCTGGGCGGC CCGCCTGCGCGCGGGGCTCGATTATGACATCGAGGGCGAGCGCACCGGCAC CTTCGCCTGCAACCTTTGGGACGGCCG Расщепление этого фрагмента эндонуклеазой рестрикции ZraI (или AatII) при- ведет к образованию фрагментов с длиной 251 п.н. и 338 п.н. в случае использования в качестве матрицы кДНК штамма RA27/3 (НПО «Микроген», Merck и GSK). При расщеплении ампликонов, полученных в ПЦР с использованием кДНК от других штаммов вируса краснухи, фрагмент 589 п.н. будет иметь несколько отличающуюся структуру и не будет расщепляться ферментами ZraI и AatII. В качестве положитель- ного контроля при проведении реакции возможно использование плазмиды ДНК pUCRA27/1 (НПО «СибЭнзим», Россия). Плазмида содержит вставку фрагмента кДНК вируса краснухи, штамм RA-27/3, длиной 589 п.н., соответствующих пози- циям 3669-4538 п.н. в геноме вируса краснухи. Фрагмент имеет сайт рестрикции рестриктазой ZraI (или AatII), позволяющий получить фрагменты с длиной 251 п.н. и 338 п.н. Результаты ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией рестриктазой ZraI в образцах, содержащих штаммы краснухи. Для выделения РНК и последующего проведения ОТ-ПЦР с рестрикцией использовали штаммы вируса краснухи и образцы готовых форм вакцины различных производителей, как описано в разделе Материалы и ме- тоды. Результат ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией производственного штамма RA-27/3 НПО» «Микроген» представлен на рис. 1.

Рис. 1. Расщепление ПЦР-продуктов 589 п.н., амплифицированных из кДНК плазмиды и прозводственного штамма RA-27/3 НПО «Микроген». М — маркер длины фрагментов 100 bp (НПО «СибЭнзим»); K — контрольные нерасщепленные продукты ПЦР; ZraI — продукты гидролиза ампликонов рестриктазой ZraI.

При амплификации получен ам- пликон с предполагаемой расчетной длиной 589 п.н. При рестрикции полученного ампликона рестриктазой ZraI получены два фрагмента с расчетной длиной 251 п.н. и 338 п.н. При проведении ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией штамма «Орлов» (гено- тип 2С) вируса краснухи ампликон расчетной длины получен, однако результат рес- трикции — отрицательный. При рестрикции полученного ампликона рестриктазой ZraI фрагменты с расчетной длиной 251 п.н. и 338 п.н. не получены. Это связано с тем, что штамм краснухи «Орлов» не содержит сайт рестрикции ZraI в фрагменте генома с 3969 по 4538 н.о. При проведении ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией производственного штамма, посевных серий вакцинного штамма и готовых серий вакцины против краснухи и комбини-рованной вакцины НПО «Микроген» была получена картина, аналогичная представ-ленной на рис. 1. При проведении ОТ-ПЦР и последующей рестрикции всех серий вакцин против краснухи производства Serum Institute of India, GSK, Merсk визуально результат совпадал с полученным для штамма RA-27/3 НПО «Микроген» (рис. 2).

Рис. 2. Результаты ОТ-ПЦР и RFLP образов вакцин различных производителей, содержащих и не содержащих штамм RA-27/3 вируса краснухи. Дорожки 1, 18: М — маркер длин фрагментов 100 bp (НПО «СибЭнзим»); 2 — плазмида pUCRA27/1 (результат ОТ-ПЦР), 3 — RFLP ампликона плазмиды; 4 — ОТ-ПЦР штамма «Орлов», 5 — RFLP ампликона штамма «Орлов»; 6 — ОТ-ПЦР посевного штамма RA-27/3 НПО «Микроген»; 7 — RFLP ампликона посевного штамма RA-27/3 НПО «Микроген»; 8 — вакцина паротита; 9 — вакцина кори; 10 — ОТ-ПЦР готовой серии вакцины краснухи RA-27/3 НПО «Микроген»; 11 — RFLP ампликона готовой серии вакцины краснухи НПО «Микроген»; 12 — ОТ-ПЦР готовой серии вакцины краснухи Serum Institute of India; 13 — RFLP ампликона готовой серии вак- цины краснухи Serum Institute of India; 14 — ОТ-ПЦР готовой серии вакцины краснухи GSK; 15 — RFLP ампликона готовой серии вакцины краснухи GSK; 16 — ОТ-ПЦР готовой серии вак- цины краснухи Merck; 17 — RFLP ампликона готовой серии вакцины краснухи Merck.

При проведении ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией вакцин паротитной и против кори производства НПО «Микроген» фрагмент длиной 589 п.н. амплифици- рован не был, т.е. результат был отрицательным. Таким образом, выбранные праймеры позволяют провести ОТ-ПЦР всех РНК выделенных из образцов, содержащих вирус краснухи, и получить ампликон разме- ром 589 п.н. (рис. 2). Только те фрагменты, которые содержат сайт рестрикции для рестриктазы ZraI, характерный для штамма RA-27/3, при проведении рестрикции позволяют получить два фрагмента длиной 251 п.н. и 338 п.н. Таким образом, предложенный для апмлификации с последующей рестрикцией фрагмент штамма RA-27/3 позволяет подтвердить подлинность штамма не только на этапах производства, но и в готовой форме вакцины, независимо от производи- теля. Исследование структуры гена белка протеиназы p150 штамма вируса красну- хи RA-27/3 готовых серий вакцины различных производителей. Для штаммов вируса краснухи, используемых в Японии, показано, что изменение их биологических свойств в ходе аттенуации может быть связано с изменениями аминокислот в ге- не p150 [11]. Сравнение последовательностей гена p150 готовых серий краснушной вакцины НПО «Микроген», полученных при проведении данного исследования, продемонстрировало совпадение структур между собой и их гомологичность пос- ледовательностям штамма RA-27/3 GSK и Merck (по данным GenBank). Поскольку данные о последовательности штамма RA-27/3 SII в GenBank отсутствуют, было проведено изучение структуры гена p150 в готовых формах вакцин разных произ- водителей — НПО «Микроген», GSK, Merck и SII. Результаты секвенирования гена p150 готовых серий НПО «Микроген», GSK и Merck продемонстрировали полное совпадение последовательностей между исследованными образцами и их гомоло- гичность структурам, представленным указанными производителями для штамма RA-27/3 в GenBank. Для готовых серий SII выявлена замена в позиции 1691 — G→A. Данная замена приводит к изменению кодона GCG в кодон ACG и, соответственно, к изменению аминокислоты аланин (неполярная) в аминокислоту треонин (поляр- ная). При расщеплении этого предшественника, аминокислотная замена аланин→ треонин унаследуется белком р150, содержащим протеазный домен и домен кэпи- рования. Эта замена не располагается в каком-либо из функциональных доменов белка р150 и, таким образом, ее роль в изменении структурных и биохимических характеристик белка р150 на данном этапе не ясна. Тем не менее, полученные ре- зультаты позволяют говорить о неполной гомологии штамма RA-27/3, используемо- го индийским производителем, со штаммом RA-27/3, используемым GSK, Merсk и НПО «Микроген». Таким образом, в результате проведенного исследования продемонстрированы: генетическая стабильность штамма вируса краснухи RA-27/3, используемого НПО «Микроген» для производства вакцин как моно-, так и комбинированной вакцины; гомологичность этого штамма со штаммами RA-27/3, используемыми GSK и Merck; возможность использования метода полиморфизма длин рестрикционных фрагмен- тов для подтверждения подлинности вакцинного штамма в готовой форме вакцины против краснухи.

About the authors

G. M. Ignatev

Scientific and Production Assotiation for Immunobiological Preparations «Microgen»;
Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immunobiological Products

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

E. V. Atrashevskaya

Scientific and Production Assotiation for Immunobiological Preparations «Microgen»

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

L. L. Suchanova

Scientific and Production Assotiation for Immunobiological Preparations «Microgen»

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

E. S. Sidorenko

Scientific and Production Assotiation for Immunobiological Preparations «Microgen»

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

N. A. Netesova

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»

Email: fake@neicon.ru

Koltsov-o, Novosibirsk Region

Russian Federation

References

Supplementary files