Serological methods for detection of the causative agent of tularemia and their evaluation

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Основные направления разработки диагностических препаратов предусматри-
вают расширение возможностей индикации возбудителя за счёт появления высоко-
чувствительных новых и усовершенствованных методов и препаратов, что способс-
твует эффективному эпидемиологическому мониторингу инфекционных болезней.
В настоящее время для индикации возбудителя туляремии применяют ряд диа-
гностических серологических методов, в основе которых лежит высокоселективное
взаимодействие «антиген-антитело»: реакция непрямой гемагглютинации (РНГА),
реакция иммунофлуоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА) без/с
применением магноиммуносорбентов (МИС), микрогравиметрический анализ
(МГА), анализ поверхностного плазмонного резонанса (ППР).
Стремительное развитие биотехнологии в последние годы привело к появлению
новых методов исследования, однако хорошо известная РНГА до сих пор остается
актуальной в диагностике инфекций. Такой метод выявления взаимодействия анти-
ген-антитело обладает высокой чувствительностью и простотой постановки [4, 7].
Широкое распространение получили методы, основанные на применении антител,
меченных маркерами — флуорохромами, которые позволяют с помощью люминес-
центного микроскопа проводить высокочувствительные определения исследуемой
пробы в РИФ. Этот метод достаточно прост, экономичен, может использоваться
в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний, особенно в тех случаях, ког-
да обычная бактериоскопия оказывается безрезультатной [8, 10]. Наиболее часто
применяются методы с использованием антител, иммобилизованных с фермен-
тами — ИФА, принципы и особенности которого подробно описаны в работе [2].
Увеличение чувствительности анализа и выявляемости возбудителя возможно при
предварительном селективном концентрировании патогенов на МИС с последую-
щей постановкой диагностических реакций [5, 6]. Перспективным методом детек-
ции возбудителей является МГА с применением пьезобиосенсорных (ПБ) устройств,
позволяющих быстро реализовать процесс достоверного распознавания анализиру-
емых молекул в образовавшемся комплексе антиген-антитело. При создании ПБ
используются пьезокварцевые резонаторы (ПКР), работающие не только в вакуу-
ме и на воздухе (статический режим), но и в жидкости (проточно-инжекционный
режим) [1, 3]. Они характеризуются простотой в эксплуатации, а также наличием
автоматической системы сбора информации [9]. Одним из эффективных способов
выявления антигенов в режиме реального времени является метод ППР в проточных
ячейках. Он позволяет с высокой чувствительностью количественно определять по-
верхностную концентрацию антител и наличие антигенов, вступающих в реакцию с
находящимися на поверхности молекулами-мишенями [Isakova A. et al., 2018].
Цель работы — сравнительный анализ и оценка серологических методов выяв-
ления возбудителя туляремии.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
В работе использовали коммерческие и экспериментальные диагностичес-
кие препараты производства Ставропольского противочумного института: «Набор
реагентов диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуноглобулиновый
жидкий»; «Иммуноглобулины флуоресцирующие туляремийные сухие»; «Набор
реагентов тест-система диагностическая для выявления возбудителя туляремии в
иммуноферментном анализе»; «Набор реагентов тест-система иммуноферментная
магноиммуносорбентная для выявления возбудителя туляремии»; «Тест-система
микрогравиметрическая биосенсорная для выявления возбудителя туляремии». Для
постановки ППР применяли экспериментальные серии биосенсоров (Институт фи-
зической химии и электрохимии).
Исследования проводили на культурах гомологичных Francisella tularensis
Miura, F. tularensis 890 Аз, F. tularensis Sсhu, F. tularensis 15 НИИЭГ, выращенных на
желточной среде Мак-Коя в течение 24 ч при 37°С, инактивированных хлорофор-
мом (для всех методов, кроме РИФ) и гетерологичных штаммов Brucella abortus 544,
B. melitensis 16-M, B. suis 1330, выращенных на печёночном агаре в течение 48 ч при
37°С, Yersinia enterocolitica 178, 383 — на агаре Хоттингера в течение 48 ч при 37°С и
инактивированных формалином (для всех методов, кроме РИФ). Штаммы получа-
ли из лаборатории коллекции патогенных микроорганизмов Ставропольского про-
тивочумного института.
Эксперименты проводили с чистыми обеззараженными культурами F. tularensis
(тест-штаммами), штаммами гетерологичных микроорганизмов и в модельных опы-
тах на 3 л водопроводной воды с 200 г садовой земли, контаминированной различ-
ными концентрациями F. tularensis. Индикацию возбудителя осуществляли метода-
ми РНГА, РИФ, ИФА, ИФА с МИС, МГА, ППР.
РНГА проводили традиционным макро- и микрометодом в лунках планшета
полистиролового круглодонного с визуальным учетом результатов. РИФ ставили на
фиксированных мазках гомологичных F. tularensis и гетерологичных штаммов. Учет
результатов осуществляли по 4-крестовой системе на люминесцентном микроскопе
Primo Star iLED («Carl Zeiss», Германия). За положительный результат принимали
специфическое свечение не менее трех микробных клеток возбудителя туляремии с
яркостью 3-4 креста.
Постановка ИФА включала сенсибилизацию планшет туляремийными имму-
ноглобулинами, проведение анализа и учет результатов. Проведение ИФА с МИС
осуществляли путем селективного концентрирования возбудителя туляремии на
МИС (магнитная матрица с иммобилизованными туляремийными антителами) с
последующим взаимодействием с иммунопероксидазным туляремийным коньюга-
том, отмывкой от несвязавшихся компонентов, введением хромогенной смеси. Учет
результатов в традиционном ИФА (на планшетах) и ИФА с МИС проводили на фо-
тометре Multiscan FC (ЗАО «Термо Фишер Сайентифик», США) при длине волны
450 нм с соблюдением следующих условий: среднее значение ОП отрицательного
контроля не более 0,2; значение ОП в лунке с положительным контролем в 2 и более
раз превышала ОП отрицательного контроля.
Постановка МГА включала: иммобилизацию туляремийных антител на золотой
подложке ПКР, взаимодействие с антигеном с использованием жидкостной ячейки
и перистальтического насоса (P-1 FPLC LKB Pharmacia), учет результатов по сдвигу
частот на устройстве для измерения параметров и настройки пьезоэлектрических ре-
зонаторов CPNA-330 (НПФ ЗАО «ЭТНА», Россия) с программным обеспечением.
ППР проводили путем иммобилизации туляремийных антител на позолочен-
ном стеклянном чипе, дальнейшем взаимодействии с антигеном с использованием
перистальтического насоса (BT100-1F, LONGER Precision Pump) и учетом результа-
тов на ППР-спектрометре Biosuplar 6 («Mivitec», Германия) по сдвигу резонансной
кривой ППР, который пропорционален количеству частиц антигена, взаимодейс-
твующих с антителами.
Статистическую обработку полученных результатов выполняли, определяя кри-
терий Стьюдента, с использованием программы Microsoft Excel 2010.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
Один из широко и давно применяемых методов иммуноанализа — РНГА.
В состав набора входит основной компонент — диагностикум эритроцитарный туля-
ремийный иммуноглобулиновый жидкий 5 % и все необходимые ингредиенты для
постановки реакции. При проведении экспериментов с чистыми обеззараженными
культурами F. tularensis были получены положительные результаты в РНГА при на-
личии в пробе 5105 — 1106 м.к./мл (t=1) и выше. При контроле специфичнос-
ти с гетерологичными штаммами гемагглютинация отсутствовала. Для постановки
200 анализов (макрометодом) или 2000 анализов (микрометодом) в РНГА достаточ-
но 5 мл 5 % взвеси эритроцитарного диагностикума. Достоинства метода: высокая
специфичность и чувствительность; простота постановки; требуется минимальное
количество компонентов; низкая стоимость набора; визуальный учет (нет необхо-
димости в дорогостоящем оборудовании и ингредиентах); экспрессность при иссле-
довании микрометодом (2-2,5 ч).
Широкое распространение получил и метод флуоресцирующих антител. РИФ
ставили с применением иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих ту-
ляремийных. При проведении экспериментов с чистыми обеззараженными культу-
рами F. tularensis были получены положительные результаты в РИФ при наличии в
пробе 5105 — 1106 м.к./мл (t=0,78) и выше. При контроле специфичности отсутс-
твовало свечение с гетерологичными штаммами. Одной ампулы с препаратом в объ-
еме 0,5 мл с активностью в РИФ 1:32 достаточно для проведения 400 анализов в дуб-
ликате. Достоинства метода: высокая специфичность и чувствительность; простота
постановки; возможность обнаруживать антиген в люминесцентном микроскопе
по интенсивности свечения и морфологии; экспрессность. Основным недостатком
РИФ является ее субъективность.
Одним из наиболее эффективных и часто используемых методов лабораторной
диагностики является ИФА. Основной компонент тест-системы — иммунофер-
ментный конъюгат туляремийный иммуноглобулиновый сухой. Чувствительность
метода с тест-штаммами составила 5105 — 1106 м.к./мл (t=0,72) при отсутствии
перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Одной ампулы с иммуно-
пероксидазным конъюгатом с активностью 1:400 достаточно для проведения 200
анализов в дубликате. Достоинствами метода является его экспрессность при ус-
ловии использования заранее сенсибилизированнных планшет; возможность од-
новременного исследования большого количества проб; высокая специфичность и
чувствительность. К недостаткам можно отнести необходимость применения толь-
ко химически чистой посуды для исключения ложноположительных результатов, а
также длительность анализа при необходимости предварительной сенсибилизации
планшет (16-18 ч при температуре 4-6 °С или 3 ч при температуре 36 °С).
Исследования водопроводной воды с контаминированными взвесями F. tularensis
в РНГА, РИФ И ИФА дали отрицательные результаты, так как выявляемая
концентрация возбудителя была ниже порога чувствительности анализов.
Известно, что выявить патогены в водных объектах сложно, так как их концен-
трация может быть существенно ниже пороговой чувствительности методов специ-
фической индикации. Для обеспечения концентрирования F. tularensis из проб воды
большого объёма использованы туляремийные МИС с последующим выявлением
возбудителя в ИФА. МИС с иммобилизованными антителами селективно сорбируют
возбудитель туляремии, а окончательная его идентификация возможна как в полевых,
так и в стационарных лабораториях. При проведении экспериментов с чистыми обез-
зараженными культурами F. tularensis и в модельных опытах были положительные ре-
зультаты при наличии в объеме пробы 1102 — 1103 м.к. (t=1) и выше. Достоинства
ИФА с МИС: экспрессность (отсутствие этапа сенсибилизации планшет); высокая
чувствительность и возможность выявления возбудителя в загрязненных объектах
окружающей среды за счет селективного концентрирования патогена.
Были сконструированы экспериментальные серии пьезоэлектрических био-
сенсоров для обнаружения возбудителя туляремии в МГА. В состав тест-системы
входят ПБ (ПКР с золотыми электродами, активирован и иммобилизован туляре-
мийными иммуноглобулинами) и все необходимые реагенты для постановки МГА.
При проведении экспериментов, возбудитель специфически связывался с иммоби-
лизованными на поверхности пластины ПБ иммуноглобулинами с образованием
иммунокомплексов. Далее измеряли частоту колебаний и результат оценивали по
сдвигу частот в Гц (разности частотных характеристик) ПБ до и после его взаимо-
действия с возбудителем туляремии. Положительным считали сдвиг частот в сторо-
ну уменьшения на 20 Гц и более. В качестве отрицательного контроля использовали
ПБ в разводящей жидкости, не содержащей антиген. В результате установлено, что
чувствительность метода составила 1103 — 1104 м.к./мл (t=0,62). При постанов-
ке МГА с гетерологичными штаммами получены отрицательные результаты (сдвиг
частот уменьшился на 3-5 Гц), что свидетельствует о специфичности препарата. При
проведении анализа с контаминированными пробами в модельных опытах получе-
ны также отрицательные результаты в связи с загрязнением проб (присутствием в
исследуемой взвеси частиц садовой земли), что мешало корректному проведению
анализа. Достоинства метода: высокая чувствительность при отсутствии реакции с
гетерологичными штаммами; быстрота постановки и получения результатов анали-
за — 15 мин; информативность — графические и табличные данные. ПБ позволяют
осуществлять прямую регистрацию биохимических взаимодействий рецепторных
молекул без дополнительного введения меток (флуоресцентных, ферментных и др.),
что выгодно отличает их от аналогичных устройств. Недостатками являются отсутс-
твие возможности исследовать одновременно несколько проб, в результате необхо-
димо затрачивать время на подготовку жидкостной ячейки для следующей пробы, а
также дороговизна ПБ, так как он состоит из ПКР с золотыми электродами.
Метод ППР в проточных ячейках позволяет с высокой чувствительностью ре-
гистрировать реакцию антиген-антитело в режиме реального времени. В процессе
осаждения антигена на поверхности ППР-сенсора происходит взаимодействие с
антителами и меняются оптические свойства приповерхностного слоя. Таким об-
разом, измеряя величину сдвига минимума кривой ППР, можно определять повер-
хностную концентрацию антител и наличие в растворах возбудителя, вступающего
в реакцию с находящимися на поверхности молекулами-мишенями. Постановку и
учет результатов проводили с помощью ППР-спектрометра, оснащенного плоской
двухкамерной проточной ячейкой. Исследуемые растворы прокачивали через обе
камеры измерительной ячейки с помощью перистальтического насоса со скоростью
960 мкл/мин. Адсорбция возбудителя на поверхности чипа сопровождалась изме-
нением оптических параметров поверхностного слоя жидкости, что приводило к
росту сигнала ППР-спектрометра, измеряемого в условных единицах. Установлено,
что чувствительность метода составила 1102 — 1,0103 м.к./мл (t=0,78), что в 1000
раз превышает чувствительность методов РНГА, РИФ и ИФА при отсутствии пере-
крестных реакций с гетерологичными штаммами. При постановке ППР в модель-
ных опытах получены отрицательные результаты в связи с загрязнением проб, что
мешало корректному проведению анализа. Достоинство метода: высокая чувстви-
тельность при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами;
быстрота постановки и получения результатов анализов; информативность.
Основные сравнительные характеристики методов, применяемых для индика-
ции возбудителя туляремии, представлены в табл.
Таким образом, после проведения сравнения серологических методов диагнос-
тики можно заключить, что каждый из них имеет как достоинства, так и недостатки.
Например, в полевых условиях или в районах, в которых отсутствует дорогостоя-
щее оборудование, проведение диагностики туляремии возможно с использованием
высокочувствительного метода РНГА без применения инструментального учета ре-
зультатов реакции. Не менее чувствительными, но требующими соответствующего
оборудования являются РИФ и ИФА. Более чувствительные инструментальные ме-
тоды — МГА и ППР, но их не рентабельно использовать при скрининговых иссле-
дованиях из-за их дороговизны. Для выявления возбудителя туляремии в водоёмах
с низкой концентрацией возбудителя, в т.ч. загрязненных, эффективным является
метод ИФА с МИС, т.е. выявление возбудителя в ИФА после его селективного кон-
центрирования на магнитной матрице.

About the authors

I. V. Zharnikova

Stavropol State Institute for Plague Control

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15, р.т. (8652)26-03-12

Russian Federation

V. I. Efremenko

Stavropol State Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Russian Federation

T. V. Zharnikova

Stavropol State Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Russian Federation

S. A. Kurcheva

Stavropol State Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Russian Federation

S. M. Kalnoy

Stavropol State Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Russian Federation

D. V. Еfremenko

Stavropol State Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15 Russian Federation

A. A. Isakova

Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry

Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation

A. V. Indenbom

Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry;
Moscow Institute of Physics and Technology (State University)

Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation

References

Supplementary files