IN VITRO DIAGNOSIS FOR EBOLA VIRUS DISEASE. A COMPARISON OF CURRENT TECHNIQUES AND DIAGNOSTIC ASSAYS

Full Text

Лихорадка Эбола — особо опасное заболевание человека и животных, этиологи-
ческими агентами которого являются вирусы рода Ebolavirus, принадлежащего к се-
мейству Filoviridae. В настоящее время род Ebolavirus насчитывает пять самостоятель-
ных видов: Заир эболавирус (Zaire ebolavirus, ZEBOV), Судан эболавирус (Sudan
ebolavirus, SUDV), Бундибугё эболавирус (Bundibugyo ebolavirus, BDBV), Таи Форест
эболавирус (Taï Forest ebolavirus, TAFV) и Рестон эболавирус (Reston ebolavirus, RESTV)
[25]. Вирусы ZEBOV, SUDV и BDBV при инфицировании человека вызывают острые
лихорадки, которые объединены в общую нозологическую форму, получившую на-
звание лихорадка Эбола [28]. Вирус TAFV также патогенен для человека, однако вы-
зывает лихорадочные состояния, напоминающие клинически лихорадку денге [30].
Вирус RESTV вызывает тяжелую геморрагическую лихорадку у приматов, но не па-
тогенен для человека [15].
Лихорадка Эбола характеризуется высокой летальностью, которая при отсутствии
надлежащего лечения варьируется по разным оценкам от 65 — 75% для ZEBOV до 55
— 58% для SUDV и BDBV [28, 31]. С эпидемиологической точки зрения лихорадка
Эбола является природно-очаговым зоонозом с контактным механизмом передачи.
При этом в качестве наиболее вероятного резервуара для ее возбудителей принято
рассматривать крыланов из подотряда Megachiroptera рукокрылых (Chiroptera), вклю-
чающего единственное семейство Pteropodidae [4]. Однако окончательно вопрос о
природном резервуаре вирусов рода Ebolavirus к настоящему времени не разрешен.
Впервые человечество столкнулось с лихорадкой Эбола в 1976 г., когда сначала в
Судане, а затем и в республике Заир (в настоящее время Демократическая респуб лика
Конго, ДРК) возникли вспышки, вызванные вирусами SUDV и ZEBOV. Наибольшее
количество пострадавших было зарегистрировано в республике Заир. Оно составило
318 случаев [12, 13]. В период с 1976 по 2013 гг. ВОЗ зарегистрировала 24 спорадические
вспышки лихорадки Эбола. При этом суммарное количество заболевших составило
1716 случаев, а летальность варьировалась в диапазоне от 25% до 90% [16]. Однако
вспышка 1976 г. в ДРК до недавнего времени считалась крупнейшей.
В декабре 2013 г. на территории республики Гвинея возникла вспышка лихорадки
Эбола, вызванная вирусом ZEBOV, которая распространилась на пять стран, включая
Гвинею, Либерию, Нигерию, Сенегал и Сьерра Леоне. Особенностью данной вспыш-
ки, переросшей в эпидемию, стало то обстоятельство, что территорией распростра-
нения инфекции стала западная Африка, где ранее циркуляция вирусов рода Ebolavirus
не наблюдалась. По этой причине и в силу плохого оснащения лабораторной службы
выявление возбудителя произошло с большой задержкой, что привело к запаздыванию
соответствующих противоэпидемических мероприятий и распространению инфекции
из сельской местности на городские территории с общим количеством населения
около 25 миллионов человек. Суммарное количество пострадавших в результате эпи-
демии 2013 — 2016 гг. составило 28 652, при этом 11 325 случаев закончилось летально
[22]. Фактически, будучи занесенным в городскую черту, вирус распространялся как
контактный антропоноз, при этом оценочное значение показателя базовой скорости
репродукции составило около 1,8 [24].
Эпидемия лихорадки Эбола 2013 — 2016 гг. продемонстрировала слабую готов -
ность как национальных, так и международных организаций здравоохранения к
оперативному реагированию на возникающие вызовы подобного типа. Понадобилось
более двух лет и усилия всего мирового сообщества, чтобы взять под контроль и лик-
видировать эту эпидемию. Одной из серьезных проблем оказалось и слабое развитие
средств лабораторной диагностики. Однако острая необходимость диктовала свои
условия, вследствие чего за короткий промежуток времени было разработано большое
количество как коммерчески доступных наборов для диагностики лихорадки Эбола,
так и in house диагностикумов, основанных на различных методологических подходах.
Данный обзор посвящен сравнению различных методов и средств диагностики лихо-
радки Эбола, применявшихся в ходе ликвидации эпидемии 2013 — 2016 гг. в Западной
Африке.
Принципы клинической лабораторной диагностики лихорадки Эбола. Лабораторная
диагностика инфекционных заболеваний базируется на двух принципиально разных
подходах: молекулярном, позволяющем выявлять нуклеиновые кислоты инфекцион-
ного агента в биологическом материале, и серологическом, основанном на выявлении
продуктов реакции антиген-антитело — взаимодействии антигена инфекционного
агента с антителами инфицированного макроорганизма. Оба подхода имеют право
на существование и в клинической практике дополняют друг друга в общем случае.
Однако при диагностике острых инфекций, таких как лихорадка Эбола, эффектив-
ность применения этих подходов существенно зависит от сроков проведения анали-
за. Это связано с запаздыванием развития иммунного ответа на внедрение возбуди-
теля в организм.
Клинический дебют заболевания при инфицировании вирусом Эбола сопрово-
ждается лихорадкой и астенизацией больного, обусловленных виремией [34]. Наличие
вируса в периферическом кровотоке, а также и в других биологических жидкостях
позволяет осуществлять прямую детекцию его молекулярных маркеров либо анти-
генных структур на раннем этапе заболевания [10]. Анализ вспышки лихорадки Эбола
в Киквите (1995, Демократическая Республика Конго) показал, что иммуноглобули-
ны класса М обнаруживаются практически у всех больных на 10 — 29 сутки после
появления симптомов заболевания, в большом проценте случаев иммуноглобулины
класса М обнаруживаются с 2 до 168 дня с появления симптомов заболевания.
Иммуноглобулины класса G обнаруживаются практически у всех больных, начиная
с 19 суток и до 749 (срок наблюдения) суток после появления симптомов заболевания,
к моменту вероятной смерти пациента [40].
Таким образом, выявление специфических антител к вирусам Эбола хотя и воз-
можно, но, согласно рекомендациям ВОЗ, используется исключительно как под-
тверждающий метод, метод ретроспективной диагностики либо скрининговый метод
для изучения сероконверсии в популяционных эпидемиологических исследованиях
[47]. Еще одним существенным ограничением на применение серологических мето-
дов диагностики лихорадки Эбола является необходимость проведения работ в по-
мещениях с уровнем биологической безопасности BSL-4, что практически нереали-
зуемо в странах, где данное заболевание является эндемичным [9].
Тем не менее, в настоящее время существует большое количество серологических
протоколов для диагностики лихорадки Эбола, главным образом, в формате ИФА.
Часть из них была разработана еще до эпидемии 2013 — 2016 гг. и предназначалась
как для специфической диагностики отдельных эболавирусов [23, 27, 43], так и для
скрининговых исследований на наличие антител ко всем представителям рода
Ebolavirus [33, 35, 41]. Другая часть была разработана непосредственно в ходе послед-
ней эпидемии [21, 26]. При этом диагностическая специфичность методов на основе
ИФА достигает 96%, а диагностическая чувствительность может достигать 100% при
условии проведения исследований в оптимальное время [26].
Однако не одна из данных методик не была доведена до состояния коммерчески
доступной тест-системы и ни одна не была рекомендована ВОЗ для использования в
качестве диагностического теста. Тем не менее, на рынке диагностических препаратов
стали появляться коммерчески доступные тесты в формате ИФА, например набор на
основе рекомбинантного антигена нуклеопротеина (NP) — Human Anti-Zaire Ebola
virus Nucleoprotein (NP) IgG ELISA Kit (AE-320520-1, Alpha Diagnostics International,
USA), либо набор Human Ebola Virus IgG (EV-IgG) ELISA Kit (MBS9391225, My Bio
Source, USA) «Human Anti-ZEBOV GP IgG» (AE-320620-1, Alpha Diagnostic Intl. Inc.,
USA). Следует отметить, что их диагностические характеристики не определены и
данные наборы могут быть использованы исключительно в научных целях.
В Российской Федерации сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор» разработана и зареги-
стрирована в 2015 году в качестве изделия медицинского назначения диагностическая
система в формате ИФА на основе очищенного природного антигена вируса Эбола
«Набор реагентов для иммуноферментного выявления антител классов G и M к ви-
русу Эбола «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин». Данная система успешно применялась в
ходе диагностических исследований, проведенных специализированной противоэпи-
демической бригадой Роспотребнадзора (СПЭБ) в Гвинейской Республике в 2014 —
2016 годах. При этом диагностическая специфичность системы достигала 99%, а
чувствительность 98%, при доверительных вероятностях 90% [1].
Иммунохроматографические экспресс-тесты. «Быстрые» диагностические тесты
(Rapid diagnostic tests, RDT) получили распространение в странах третьего мира, в том
числе и африканских, в силу ряда неоспоримых преимуществ, а именно простоты
использования, отсутствия необходимости в квалифицированном персонале и спе-
циализированном оборудовании, небольшого времени, необходимого для проведения
исследования.
Принцип работы подобных тестов основан на выявлении антигенных детерминант
возбудителя, связывающегося со специфическими антителами, в результате чего про-
исходит образование иммунных комплексов. Далее иммунный комплекс вторично
связывается с меченными антивидовыми антителами против специфических антител
к возбудителю. В результате реакции образуюется окрашенные иммунные комплексы
типа «сэндвич». Как правило, реализация работы данных тестов осуществляется в
формате латеральной проточной ячейки, представляющей собой полоску фильтро-
вальной бумаги, на которой в виде отдельных полос последовательно нанесены
специфические и антивидовые антитела. Для анализа могут быть использованы любые
биологические жидкости, содержащие вирус, но, как правило, используется кровь
либо моча.
В ходе текущей эпидемии немецкая компания Senova GmbH активно продвигала
свой быстрый хроматографический тест Dediatest — Ebola kit, выявляющий антиген
VP40 вируса ZEBOV. Однако тест показал себя не с лучшей стороны и не получил
одобрения ВОЗ по причине низкой чувствительности и специфичности. Другой бы-
стрый хроматографический тест ReEBOV Antigen rapid Test kit от компании Corgenix
Inc., USA все же получил одобрение ВОЗ и Управления по санитарному надзору за
качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration,
USFDA) на применение данного теста при проведении диагностики в полевых усло-
виях. Также, категорически не рекомендовано применение данного теста в аэропор-
тах, на железнодорожных вокзалах и прочих местах массового скопления людей для
экспресс-диагностики лихорадки Эбола [47]. Это связано с достаточно низкими диа-
гностическими характеристиками разработанного теста. Хотя разработчики утверж-
дают, что диагностическая чувствительность составляет 100% при диагностической
специфичности 92,2% [5]. Это, в общем-то, является приемлемым результатом, од-
нако следует учитывать, что при проведении испытаний тестировались положитель-
ные образцы от пациентов в разгаре заболевания, т.е. имевших высокий титр вируса
в крови. В то же время, при проведении независимых испытаний в процессе аккре-
дитации были получены следующие диагностические показатели: диагностическая
чувствительность 91,8%, диагностическая специфичность 84,6%. Значение аналити-
ческой чувствительности при этом составило всего 2,11х108 копий/мл [48], что в де-
сятки тысяч раз ниже чувствительности самых худших систем молекулярной диагно-
стики вируса Эбола.
Уже после завершения эпидемии в Западной Африке еще два хроматографических
теста — OraSure Ebola Rapid Antigen test (OraSure Technologies, USA) и SD Q Line Ebola
Zaire Ag (SD Biosensor, South Korea) получили одобрение ВОЗ, однако результаты
тестирования «быстрыми» тестами должны обязательно быть подтверждены молеку-
лярными методами.
Методы диагностики на основе ОТ-ПЦР. Применение молекулярных методов для
диагностики лихорадки Эбола имеет довольно длинную историю. Еще в 1995 году во
время вспышки лихорадки Эбола в Киквите (ДРК) сотрудниками CDC (Center for
Disease Control and Prevention, USA) была применена ОТ-ПЦР методика с электро-
форетической детекцией ПЦР-продукта, основанная на амплификации фрагментов
L, GP и NP генов определенной длины [42]. Методика продемонстрировала более
высокие диагностические характеристики в сравнении с методом ИФА и методами,
выявляющими антиген. В 1999 году CDC рекомендовал метод ОТ-ПЦР для диагно-
стики острых случаев лихорадки Эбола. С тех пор данная методика прочно вошла в
арсенал средств диагностики лихорадки Эбола и успешно применяется до сих пор,
преимущественно в формате ОТ-ПЦР в реальном времени [6].
К началу эпидемии 2013 — 2016 гг. было разработано и апробировано большое
количество протоколов на основе ОТ-ПЦР как в реальном времени, так и с электро-
форетической детекцией, предназначенных для диагностики как отдельных пред-
ставителей рода Ebolavirus, так и всей совокупности известных филовирусов. При
этом в качестве мишени использовались фрагменты генов полимеразы (L-ген) [37,
42], гликопротеина (GP) [14], нуклеопротеина (NP) [20] и белка VP40 [11]. В виду
небольшой востребованности из коммерчески доступных наборов на рынке суще-
ствовала лишь одна тест-система RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 произ-
водства компании Altona GmbH, Germany, предназначенная для видовой идентифи-
кации всех представителей семейства Filoviridae. Данная тест-система явилась
результатом коммерциализации методики, разработанной институтом тропической
медицины им. Бернхарда Нохта в Гамбурге и была признана «золотым стандартом»
диагностики филовирусных геморрагических лихорадок [37]. Однако в ходе прове-
дения диагностических исследований оказалось, что существующие методики тре-
буют корректировки в виду генетических различий ранее известных штаммов ZEBOV
и штамма Маккона, вызвавшего эпидемию 2013 — 2016 гг. Наличие данной пробле-
мы было теоретически продемонстрировано в работе Gire S.K. et al. [17]. Однако
авторы затруднились оценить влияние этих генетических различий на диагностиче-
ские характеристики существующих методик молекулярной диагностики. Проблема
вариабельности в целевой области коснулась и набора компании Altona, однако
данная проблема была оперативно решена производителем, и к концу 2014 года
появилась обновленная версия набора RealStar®Filovirus Screen RT-PCR Kit, а также
и набор для определения только вируса ZEBOV — RealStar® Zaire Ebolavirus RT-PCR
Kit.
Отсутствие надежных средств молекулярной диагностики, а также драматическое
увеличение количества пострадавших в ходе эпидемии послужило стимулирующим
фактором развития молекулярных методик и коммерческих наборов на их основе для
диагностики лихорадки Эбола. К сожалению, из-за большого количества исследова-
тельских групп, принимавших участие в лабораторном обеспечении мероприятий по
ликвидации эпидемии на разных ее этапах, а также в силу различной национальной
принадлежности и подчиненности, использовались различные протоколы диагно-
стики, сравнительную эффективность которых оценить затруднительно. Тем не менее,
post factum стали появляться исследования, посвященные сравнению эффективности
различных протоколов диагностики лихорадки Эбола, вызванной штаммом ZEBOV
Маккона. Наиболее полным исследованием подобного рода является работа швей-
царских специалистов, которые провели сравнительное тестирование 11 различных
методик ОТ-ПЦР детекции вируса ZEBOV [7]. Шесть методик были представлены
коммерчески доступными наборами: RealStar®Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 (кат
№ 441013, Altona, Hamburg, Germany), RealStar® Zaire Ebolavirus RT-PCR Kit 1.0 (кат
№ 451003, Altona, Hamburg, Germany), Roche LightMix®Modular Ebola Virus Zaire(кат
№ 40-0666-96, Roche, Rotkreuz, Switzerland), FTD®Ebola (кат № FTD-71-64, Fast-track
Diagnostics (FTD), Sliema, Malta), Lifetech Ebola Virus (Zaire 2014) и Lifetech Lyophilized
Ebola Virus (Zaire2014) (кат № 4489990, Life Technologies, Waltham, USA).
В ходе испытаний было выявлено, что коммерческие наборы, принимавшие уча-
стие в исследовании, обладают лучшими характеристиками, чем in house методики.
Наилучшие результаты показал набор Lifetech Lyophilized Ebola Virus (Zaire 2014). Его
чувствительность (предел детекции) составила 62,5 копии транскрибируемого по-
ложительного РНК-контроля и 1:243 разведения сыворотки больного лихорадкой
Эбола, в то время как остальные наборы имели предел детекции транскрибируемого
положительного РНК-контроля от 625 до 1250 копий в мл и детектировали разведения
сыворотки больного в диапазоне от 1:27 до 1:81 [7].
В Российской Федерации к началу эпидемии 2013 — 2016 гг. существовал един-
ственный набор для диагностики лихорадки Эбола «Вектор-ПЦРРВ-Эбола-RG» [2],
разработанный в ГНЦ ВБ «Вектор». Были получены данные по использованию на-
бора для исследования лиофильно высушенного супернатана клеток, зараженных
вирусом Эбола штамм Заир, инактивированный прогреванием и γ-излучением.
Образец (Ebolavirus standard preparation for diagnostic purposes) был приготовлен ин-
ститутом им. Р.Коха (Berlin, Germany) и предоставлен Европейской диагностической
сетью завозных вирусных болезней (ENIVD). Специфическая активность образца
подтверждена институтами Robert Koch-Institut и Bernhard-Nocht Institute, а также
университетом г. Марбург (ФРГ) в реакции ПЦР. Согласно документу препарат со-
держит 2х107 геном-эквивалентов (ГЭ) на мл вируса Эбола. Методом ПЦР РНК в
нативном препарате детектируется примерно на 21 — 22 цикле (по Сt) и на 24 — 25
цикле — в разведении 1:10.
В 2014 году в связи с необходимостью лабораторно-диагностического обеспечения
работы СПЭБ Роспотребнадзора в очаге лихорадки Эбола в республике Гвинея
Центральным НИИ эпидемиологии была разработана и зарегистрирована диагности-
ческая система в формате ОТ-ПЦР в реальном времени «Амплисенс EBOV(Zaire)-Fl»,
обладающая высокой аналитической чувствительностью (500 копий в мл), продемон-
стрировавшая в ходе полевых испытаний высокую диагностическую чувствительность
и специфичность [8]. Кроме того, в 2016 г. в России была зарегистрирована тест-
система ОМ-Скрин-Эбола Заир/Эбола Судан/Марбург-РВ, производства ЗАО
«Синтол».
Помимо наборов и методик с традиционной архитектурой были разработаны
также коммерческие системы, позволяющие проводить реакцию ОТ-ПЦР в автома-
тическом режиме — так называемые системы Lab-on-Chip. Данные системы содержат
расходную часть, представляющую закрытые картриджи, содержащие в себе как реа-
генты для экстракции нуклеиновых кислот, так и реагенты для проведения ОТ-ПЦР
в реальном времени. Помимо картриджа для исследований также необходим специ-
ализированный прибор. В картридж посредством прокола вносится исследуемый
материал, картридж помещается в прибор, после чего все стадии анализа происходят
автоматически без участия оператора.
Среди разработок подобного рода наибольшую известность и распространенность
получила система GeneExpert Ebola assay от компании Cepheid, USA [8], а также на-
боры FilmArray NGDS BT-E и FilmArray Biothreat-E test компании BioFire Defense,
USA [39, 44]. Данные системы были испытаны в полевых условиях в Западной Африке
и получили одобрение ВОЗ и FDA в качестве изделий медицинского назначения.
Этому способствовал ряд неоспоримых преимуществ подобных изделий, а именно:
простота проведения анализа, простота интерпретации результата, низкий риск кросс-
контаминации, небольшое время проведения анализа (60 — 90 минут, включая этап
выделения нуклеиновых кислот, против 4 часов для стандартной процедуры экстрак-
ции и ОТ-ПЦР). Последняя особенность оказалась чрезвычайно важной постольку,
поскольку на Африканском континенте слабо развитая электрическая сеть и неста-
бильная подача электричества вынуждают пользоваться портативными генераторны-
ми установками либо батареями ограниченной емкости. В этой связи, время прове-
дения анализа становится драматически важным параметром успешного применения
диагностической системы. Помимо очевидных плюсов подобные системы имеют и
существенные недостатки, а именно: более низкую чувствительность по сравнению
с традиционными ОТ-ПЦР системами, необходимость покупки специализирован-
ного оборудования при ограниченном выборе разработанных производителем кар-
триджей для детекции прочих патогенных микроорганизмов, а также высокая стои-
мость одного исследования. Так, например, стоимость одной реакции Gene Expert
Ebola assay в настоящее время составляет около 50 долларов США. Тем не менее, по-
добные методики могут быть использованы в полевых условиях, например, в рамках
деятельности мобильных лабораторий, действующих непосредственно в эпидемиче-
ском очаге. Однако их применение в референсных лабораториях не обосновано в
силу низкой чувствительности и высокой стоимости анализа. Скорее всего, данные
методики следует рассматривать в качестве альтернативы хроматографическим те-
стам.
Методы диагностики на основе альтернативных принципов амплификации. Помимо
традиционных методик на основе ПЦР/ОТ-ПЦР в последние годы активно развива-
ются молекулярно-диагностические методики на основе петлевой изотермической
амплификации, так называемой LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) осу-
ществляемой с помощью фермента Bst ДНК-полимеразы, представляющей собой in
silico гомолог большой субъединицы ДНК-полимеразы I Bacillus stearothermophilus.
Фермент обладает 5’-3’ ДНК-полимеразной активностью и высокой вытесняющей
способностью, но не проявляет 5’-3’ экзонуклеазной активности. Для Bst ДНК-
полимеразы характерны высокая скорость амплификации, высокая производитель-
ность, повышенная толерантность к содержанию солей и температурный оптимум
активности в пределах 60 — 65°C [32]. Сочетание данных свойств позволяет осущест-
влять амплификацию без создания ступенчатого режима, характерного для ПЦР и,
следовательно, не требует наличия такого сложного дорогостоящего оборудования,
как амплификатор. Для постановки LAMP можно использовать стандартные термо-
статирующие приборы или даже водяную баню.
LAMP является относительно новым методом амплификации нуклеиновых кис-
лот, который был разработан Notomi T. et al. в 2000 г. [36]. Сущность данного метода
заключается в удвоении участка ДНК с высокой специфичностью, эффективностью
и скоростью за счет вытесняющей активности Bst ДНК-полимеразы и образования
петлевых структур в условиях постоянной температуры. К преимуществам LAMP от-
носятся простота, скорость, высокая специфичность и чувствительность (количество
ПЦР-продукта в течение 15 — 60 мин достигает 109 — 1010 копий ДНК мишени),
экономическая эффективность. В отличие от классической ПЦР в методе LAMP ис-
пользуется четыре либо шесть праймеров, что обеспечивает высокий уровень специ-
фичности.
Учет результатов LAMP осуществляется по свечению интеркалирующего краси-
теля, например SYBR Green I, добавляемого в реакционную смесь, что дает возмож-
ность визуализировать продукты реакции в ультрафиолетовом свете [45]. Данный
способ пригоден для полевых исследований. Другой способ основан на колориметри-
ческой детекции (турбидиметрии) побочных продуктов реакции LAMP, в частности,
ионов пирофосфата, образованием которых сопровождается синтез специфического
продукта амплификации, что приводит к возрастанию оптической плотности в реак-
ционной смеси [18]. Оба варианта детекции могут быть осуществлены как по конеч-
ной точке, так и в реальном времени с помощью специализированных приборов,
например, прибора для автоматической детекции флюоресцентного сигнала Genie
III (OptiGene, West Sussex, UK) при использовании интеркалирующего красителя
либо турбидиметра LA-200 (Eiken Chemical Co. Ltdю, Tokyo, Japan) в случае детекции
ионов пирофосфата.
Возможность успешного использования LAMP либо RT-LAMP для диагностики
различных патогенов человека и животных было продемонстрировано в [38].
В последующие годы было разработано большое количество коммерческих тест-
систем для диагностики широкого спектра патогенов бактериальной и вирусной
этиологии. В качестве основной точки приложения подобных тест-систем является
так называемая диагностика point-of-care (у постели больного).
В 2007 году Kurosaki et al. разработали первую методику на основе метода RT-LAMP
для диагностики ZEBOV. В качестве мишени для амплификации был выбран фрагмент
гена нуклеопротеина (NP). По данным авторов аналитическая чувствительность
(предел детекции, Limit of Detection, LOD) составила 20 копий в реакцию, что срав-
нимо с лучшими методиками на основе ОТ-ПЦР в реальном времени. Таким образом,
был продемонстрирован высокий диагностический потенциал наборов с подобной
архитектурой в случае детекции молекулярных маркеров ZEBOV.
Во время эпидемии 2013 — 2016 гг. методика LAMP. разработанная Kurosaki et al.
также применялась в Гвинее, причем в модифицированном варианте, использующем
детекцию по двум мишеням. В качестве первой мишени использовался фрагмент
гена нуклеопротеина (NP), выбранный ранее, а в качестве второй — фрагмент 5’-UTR
нетранслируемой области. Регистрация результата осуществлялась прибором для
автоматической детекции флуоресцентного сигнала Genie III (OptiGene, West Sussex,
UK) по свечению интеркалятора [29]. Методика была проверена на 100 клинических
образцах (44 сыворотки и 56 буккальных соскобов) от больных с подозрением на
лихорадку Эбола в Гвинее. Диагностическая специфичность данной методики для
обеих мишеней составила 100%, в то время как чувствительность для фрагмента NP
составила 97,9%, а для фрагмента 5’-UTR не транслируемой области — 100%. При
этом время проведения реакции составляло 60 минут.
Другая методика на основе LAMP, применявшаяся в Гвинее и Сьерра-Леоне, бы-
ла разработана Huan L. et al. [19]. В качестве мишени разработчики использовали
фрагмент гена нуклеопротеина (NP). Детекция результатов реакции осуществлялась
с помощью автоматического турбидиметра LA-200 (Eiken Chemical Co. Ltd.,Tokyo,
Japan) по образованию ионов пирофосфата. Реакция занимала 60 минут. Аналити-
ческая чувствительность методики составила 4,56х103 копий контрольной РНК в мл,
что также сравнимо с чувствительностью методик на основе ОТ-ПЦР в реальном
времени. Было показано отсутствие перекрестных реакций с другими возбудителями
геморрагических лихорадок и арбовирусных инфекций.
Таким образом, методики на основе LAMP являются перспективным инструмен-
том диагностики лихорадок, вызванных представителями семейства Ebolavirus, осо-
бенно в лабораториях со слабо развитой инфраструктурой и плохой оснащенностью,
в качестве альтернативы методам на основе ОТ-ПЦР в реальном времени. Однако
существует ряд опасений, ограничивающих применение данных методов. А именно,
пока остается неясным влияние замен в области посадки праймеров на диагностиче-
ские свойства наборов на основе LAMP. Из соображений общего характера ясно, что
вероятность возникновения замен под четырьмя (шестью) праймерами, используе-
мыми для проведении LAMP, существенно выше, чем таковая для двух праймеров и
зонда, используемых для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени. Подобными опа-
сениями, вероятно, обусловлено стремление Kurosaki et al. в модифицированном
варианте методики использовать двухмишенную схему LAMP для повышения надеж-
ности. Однако пока отсутствуют коммерчески доступные LAMP наборы для диагно-
стики лихорадки Эбола.
Подводя итог выше сказанному, следует отметить, что в настоящее время клини-
ческая лабораторная диагностика лихорадки Эбола может быть осуществлена с по-
мощью наборов на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени либо с помощью
«быстрых» хроматографических тестов. При этом результаты иммунохроматографии
должны быть обязательно подтверждены методом ОТ-ПЦР. В качестве «золотого
стандарта» ОТ-ПЦР диагностики принято рассматривать наборы производства ком-
пании Altona Diagnostics GmbH, Germany. На момент написания данного обзора ВОЗ
одобрила применение пяти наборов на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени
и три иммунохроматографических теста, USFDA одобрила применение шести на-
боров на основе метода ОТ-ПЦР и два иммунохроматографических теста. В
Российской Федерации зарегистрированы три набора на основе ПЦР/ОТ-ПЦР в
реальном времени.
Сравнительные характеристики тест-систем для молекулярной диагностики лихо-
радки Эбола, получивших одобрение тех или иных разрешающих инстанций, в качестве
изделий медицинского назначения представлены в табл. Аккредитованные наборы
имеют достаточно широкий диапазон чувствительности, от 500 копий в мл до 4,2х104
копий в мл. Тем не менее, даже наименее чувствительные из них вполне пригодны для
диагностических целей, так как уже на ранних этапах заболевания содержание вирус-
ных частиц в периферическом кровотоке больных достигает значений 107 копий/мл и
выше [46]. В качестве мишеней для амплификации разработчики использовали раз-
личные фрагменты генома вируса Эбола, большей частью фрагменты L-гена, ко-
дирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу. Это связано с высокой консерватив-
ностью данного гена. Однако диагностикумы, основанные на использовании в качестве
мишени фрагментов генов GP (гликопротеина) и NP (нуклеопротеина) также разра-
ботаны и имеют право на существование, поскольку сравнительным анализом изо-
лятов ZEBOV показано чередование участков высокой и низкой гомологии на всем
протяжении генома [17]. Поэтому не существует особых ограничений при выборе об-
ластей генома, которые могут быть использованы в качестве мишеней для ПЦР. Тем
не менее, ряд разработчиков в своих тест-системах для большей надежности исполь-
зуют сразу две мишени [7], а некоторые диагностические лаборатории в ходе работы
применяют одновременно две и более диагностические системы или методики.
В Российской Федерации также продолжаются работы по совершенствованию
диагностических систем на основе молекулярных методик для детекции возбудителей
филовирусных лихорадок. В частности в Центральном НИИ эпидемиологии разра-
ботаны и готовятся к проведению клинических испытаний наборы в формате муль-
типрайм ОТ-ПЦР в реальном времени для дифференциальной диагностики вирусов
ZEBOV, SUDV и MARV — «Амплисенс® Filoscreen A-Fl» и вирусов BDBV, TAFV и
RESTV — «Амплисенс® Filoscreen B-Fl» [48]. В ГНЦ ВБ «Вектор» ведутся разработки
диагностических систем для обнаружения вируса Эбола на основе методики LAMP и
хМАP технологии [3].
Таким образом, Российская Федерация располагает необходимым набором диа-
гностических средств собственного производства, по своим характеристикам не
уступающих лучшим мировым аналогам, что позволяет с большим запасом прочности
осуществлять надзорные мероприятия по недопущению завоза на территорию нашей
страны особо опасных филовирусных лихорадок, а также оказывать помощь в про-
ведении подобных мероприятий другим странам в рамках существующих междуна-
родных соглашений.

About the authors

A. O. Sementsova

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Koltsovo, Novosibirsk Region Россия

V. G. Dedkov

Central Research Institute of Epidemiology;
State Institute of Occupational Health

Email: fake@neicon.ru
Россия

V. A. Ternovoy

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»

Email: fake@neicon.ru
Koltsovo, Novosibirsk Region Россия

E. V. Chub

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»

Email: fake@neicon.ru
Koltsovo, Novosibirsk Region Россия

S. A. Pyankov

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»

Email: fake@neicon.ru
Koltsovo, Novosibirsk Region Россия

A. P. Agafonov

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»

Email: fake@neicon.ru
Koltsovo, Novosibirsk Region Россия

R. A. Maksyutov

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»

Email: fake@neicon.ru
Koltsovo, Novosibirsk Region Россия

V. V. Maleev

Central Research Institute of Epidemiology

Email: fake@neicon.ru
Россия

A. Yu. Popova

Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing;
Russian Medical Academy of Postgraduate Education

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

References

Supplementary files