DEVELOPMENT OF ELISAS FOR THE QUALITY CONTROL OF A RECOMBINANT PSEUDOMONAS VACCINE

A. V. Soldatenkova; Солдатенкова А. В.; E. M. Zimina; Зимина Е. М.; A. M. Kudryashova; Кудряшова А. М.; N. F. Gavrilova; Гаврилова Н. Ф.; I. V. Yakovleva; Яковлева И. В.; O. V. Borisova; Борисова О. В.; V. V. Sviridov; Свиридов В. В.; N. A. Mikhailova; Михайлова Н. А.

doi:10.36233/0372-9311-2019-1-95-100

DEVELOPMENT OF ELISAS FOR THE QUALITY CONTROL OF A RECOMBINANT PSEUDOMONAS VACCINE

Authors: Soldatenkova A.V.¹, Zimina E.M.¹, Kudryashova A.M.¹, Gavrilova N.F.¹, Yakovleva I.V.¹, Borisova O.V.¹, Sviridov V.V.¹, Mikhailova N.A.¹
Affiliations:
1. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Issue: Vol 96, No 1 (2019)
Pages: 95-100
Section: Articles
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/400
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-95-100
ID: 400

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. Development and optimization of enzyme immunoassays for quality control of pseudomonas recombinant vaccine. Materials and methods. Recombinant proteins in intermediate products and for completeness of adsorption control were detected in sandwich immunoassay using specific polyclonal and monoclonal antibodies. Detection of the antigen in the vaccine was carried out on the residual amount of antibodies specific to toxoid or OprF that did not bind to the vaccine preparation during the preincubation. Results. ELISAs have been developed and optimized for the quantitative determination of the components (toxoid and membrane protein OprF) of the Pseudomonas recombinant vaccine during the production process. It has been established that: the methods are specific for the determination of toxoid and OprF, the quantitative limit determination has acceptable reliability, the possibility of choosing interpolation of the calibration dependence within the analytical area is shown, the accuracy and precision meets the acceptance criteria, the technique is stable under the conditions of the analysis. Conclusion. Methods can be used to control the quality of the drug during its developing and storage.

Keywords

Pseudomonas aeruginosa, OprF outer membrane protein, toxoid, enzyme immunoassay, recombinant pseudomonas vaccine

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, проводят вакцинацию, антибиотикотерапию и фаготера- пию. Однако многочисленные исследования показывают, что широкое бесконт- рольное применение антибиотиков привело к серьезному ограничению в вариантах лечения и вскрыло проблему антибиотикорезистентности возбудителя. В связи с этим вакцинопрофилактика приобрела приоритетное значение в борьбе с синегной- ной инфекцией. В НИИВС им. И.И. Мечникова разработана рекомбинантная вакцина, пред- назначенная для профилактики синегнойной инфекции, проходящая в настоящее время доклинические испытания. Препарат состоит из двух протективных реком- бинантных белков P. aeruginosa, сорбированных на гидроксиде алюминия [3, 6]. Для доклинических испытаний получены три серии рекомбинантной синегнойной вак- цины (РВС). Целью настоящего исследования является разработка иммунофермен- тных методов для контроля качества препарата, позволяющих выявлять отдельные компоненты до их сорбции на гидроксиде алюминия, так и определять количест- венный состав готового вакцинного препарата. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы Рекомбинантные белки OprF [2] (четыре серии) и анатоксин [1] (аТох; четы- ре серии), 3 серии вакцины РВС [3, 6], конъюгаты (КГ) моноклональных антител с пероксидазой хрена, специфичные к OprF (№ 1, 5) и специфичные к анатоксину (№ 21) [Солдатенкова А.В. и др., 2013]. Поликлональные антитела кролика выделяли из иммунных сывороток пу- тем осаждения сульфатом аммония и хроматографической очистки на иммунном сорбенте. Сыворотку крови кроликов получали четырехкратной иммунизацией с двухнедельным интервалом анатоксином в дозе 50 мкг/животное с адъювантом. Забор крови осуществляли через две недели после последнего введения. Конъюгаты антител с пероксидзой хрена готовили по методу Nаkane P.K. and Kawoi A.A. [9]. Стандартные серии рекомбинантных белков и вакцинных препаратов получали со- гласно методикам, разработанным в НИИВС им. И И. Мечникова [1, 2]. Для приго- товления растворов использовали деионизированную воду (Milli-Q System, Millipore, США). Для проведения ИФА использовали 96-луночные планшеты (Costar). Оптическую плотность измеряли на аппарате BioRadModel 680. Инкубацию планшет проводили на термостатируемом планшетном встряхивателе (ELMI SkyLine) при режиме 500 об/мин и температуре 37 °С. После всех инкубаций прово- дили отмывку планшет на планшетном промывателе (StatFax). В «сендвич» варианте ИФА для выявления рекомбинантного анатоксина ис- пользовали специфические поликлональные антитела кролика для захвата и мо- ноклональные антитела мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (ПХ), в качестве детектирующих. Выявление OprF осуществляли с использованием пары специфичных моноклональных антител. В 96-луночные планшеты вносили по 100 мкл поликлональных антител к ана- токсину или моноклональных антител к OprF в 0,02 М фосфатном буферном рас- творе рН 7,2. Параллельно анализировали разведения стандартной и исследуемой серии рекомбинантного белка. Планшеты выдерживали в течение 19-22 ч при тем- пературе (4-8) °C. Далее вносили образцы, содержащие рекомбинантный анатоксин или OprF в различных разведениях в 0,02 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% Tween 20 и выдерживали при тем- пературе 37±2 °С и постоянном встряхивании со скоростью 500 об/мин в течение 1 ч. На второй стадии анализа, после отмывки, в лунки вносили 100 мкл конъюгата (КГ), соответственно, моноклональных антител к анатоксину или OprF, конъюгиро- ванных с пероксидазой хрена, и повторяли этап инкубирования в течение 30±2 мин. После отмывки вносили по 100 мкл 33 мМ цитратного буферного раствора рН 4,0, содержащего 0,01% перекиси водорода и 0,5 мМ 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина. Через 15 мин реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2N серной кислоты, из- меряли оптическую плотность (ОП) в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 680 нм. Калибровочные графики зависи- мости оптической плотности от концентрации белка строили на основании данных, полученных для стандартных серий соответствующих рекомбинантных белков. Выявление анатоксина и OprF в вакцинных препаратах проводили следующим образом: параллельно анализировали разведения стандартной и исследуемой серии вакцины. На первой стадии в пробирках смешивали конъюгат моноклональных ан- тител с пероксидазой хрена, специфичных к анатоксину или OprF, с разными раз- ведениями образцов (от 0,5 до 10 мкг/мл в пересчете на анатоксин или на OprF) и выдерживали пробы при температуре 22±4°С в течение 40 мин, периодически пере- мешивая. Образовавшийся комплекс антител, меченных пероксидазой, с антигеном (АГ), сорбированным на геле гидроксида алюминия, отделяли центрифугировани- ем. Не связавшиеся антитела, меченные ПХ, оставшиеся в надосадочной жидкости, исследовали методом иммуноферментного анализа. Для постановки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизиро- ванные aTox или OprF. В лунки планшета вносили по 100 мкл надосадочной жидкости и инкубировали в течение 30 мин в шейкере при температуре 37±2 °С, скорости вра- щения 500 об/мин. Ферментативную реакцию регистрировали, как описано выше. Строили калибровочный график зависимости оптической плотности от концен- трации рекомбинантных анатоксина или OprF в стандартной серии. Регистрируемая оптическая плотность была обратно пропорциональна концентрации aTox или OprF в анализируемых образцах. В каждом случае проводили подбор параметров ИФА с целью достижения максимальной чувствительности. Чувствительность оценивали путем определения предела обнаружения (ПО) и предела количественного обнаружения (ПКО). ПО определяли по калибровочному графику как концентрацию препарата, соответс- твующую пороговому значению оптической плотности (ОП порог.), определяемому по формуле: ОПпорог.=ОПср.К- ± 3σ, ПКО определи по калибровочному графику как концентрацию препарата, соответствующую пороговому значению оптической плотности, определяемому по формуле: ОП порог.=ОПср.К-±10σ, где ОПср.К — среднее арифметическое значение ОП нулевой пробы, σ — среднее квадратическое отклонение ОП нулевой пробы (8 повторов). Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения Microsoft Оffice Еxcel 2013. Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Для количественной оценки рекомбинантных антигенов до сорбции на геле гидроксида алюминия оптимизированы твердофазные иммуноферментные двухста- дийные сэндвич-методы. На основании результатов исследований токсичности, иммуногенности и под- линности по одной серии рекомбинантных белков OprF и аТох и вакцины были определены как стандартные. Проведена оптимизация всех стадий иммунофермен- тного анализа: подобраны пары иммобилизованных и детектирующих антител, их концентрации, время и режим инкубаций, концентрации конъюгатов. Для выявле- ния анатоксина оптимальной парой антител оказались поликлональные антитела кролика в качестве иммобилизованных в концентрации 5 мкг/мл и КГ монокло- нальных антител № 21 с пероксидазой хрена в разведении 1:80 000. В методе для выявления OprF оптимальная концентрация иммобилизованных антител (МкАт № 5) соответствовала 2 мкг/мл КББ, в качестве детектирующих антител использова- ли МкАт № 1, меченные ПХ в концентрации 1:80 000. Содержание анатоксина или OprF в исследуемых образцах определяли по калибровочному графику зависимости оптической плотности от количественного содержания aTox или OprF в разведени- ях стандартных серий с известным содержанием белков. Типичные калибровочные графики представлены на рис. 1 (А,Б).

Рис. 1. Калибровочные графики зависимости оптической плотности от концентрации aTox (А) и OprF (Б) (мкг/мл).

Проведена оценка валидационных параметров методик для количественного определения анатоксина и OprF по следующим параметрам: специфичность мето- дики, предел количественного определения, правильность, точность, сходимость, воспроизводимость и устойчивость методики [4, 5, 8]. Разработанные методы были спе- цифичны для выявления анатоксина и OprF, соответственно, присутствие вто- рого компонента вакцины не влияло на предел количественного обнаружения. ПКО обеспечивает необходимую чувс- твительность для определения аТox и OprF до сорбции и при определении остаточных белков после сорбции на гидроксиде алюминия и составляет ме- нее 0,1% от содержания рекомбинант- ных белков в вакцинном препарате. Тест на линейность при разведении соответс- твовал валидационным критериям, по- казал отклонение не более чем на 20 %. Оптимизация методик оценки коли- чественного содержания рекомбинант- ных белков в составе вакцины выполне- на с использованием стандартной серии вакцины с содержанием аТох 100 мкг/ мл и OprF 50 мкг/мл. Оптимальная кон- центрация анатоксина или OprF, им- мобилизованных на поверхности лунок планшета, составила 2 мкг/мл в КББ для обоих рекомбинантных белков, рабочие разведения конъюгатов МкАт-ПХ со- ответствовали 1:80 000. Калибровочные графики и аналитические характе- ристики методов для количественной оценки рекомбинантных белков в вак- цине представлены на рис. 2 и в табл. Предел количественного обнаружения составил не более 1,5% от номинально- го содержания антигена в вакцине.

Рис. 2. Калибровочные графики с обратной зависимостью для количественного определения aTox (А) и OprF (Б) в вакцине (мкг/мл).

Контроль качества сорбированной вакцины предполагает количественное определение содержания компонентов в промежуточных и конечном продуктах. Одним из подходов количественного оп- ределения антигена в адсорбированном препарате является десорбция компонен- тов с частиц гидроокиси алюминия [10]. В настоящем исследовании исполь- зован альтернативный подход, пред- полагающий определение антигена в исследуемой вакцине по остаточному количеству антител, специфичных к анатоксину или OprF, не связавшихся с вакцинным препаратом в процессе предварительной инкубации. В отличие от описанных анало- гичных подходов [7], [EP 2 705 365 B1. Immunoassay for direct determination of antigen content of products comprising adjuvant-coupled-antigen particles; US 2004/0033545 A1. Competitive enzyme immunoassay for assessing total antigen content of aluminum-adsorbed antigens] для инкубации с вакцинными препа- ратами использовали специфические моноклональные антитела, конъюгиро- ванные с пероксидазой, что позволяло проводить их выявление прямым твер- дофазным иммуноферментным мето- дом только в одну стадию. Методика, разработанная для количественного оп- ределения адсорбированного на гидро- окиси алюминия антигена, включала стадию центрифугирования, что сводило к ми- нимуму влияние гидроокиси алюминия на результаты иммуноферментного анализа. В результате проведенной валидации установлено, что методики являются специфичными для определения анатоксина и OprF, предел их количественного определения обладает приемлемой надежностью, показана возможность выбора интерполяции калибровочной зависимости в пределах аналитической области, пра- вильность и прецизиозность удовлетворяют критериям приемлемости, методика устойчива в условиях проведения анализа. Таким образом, разработаны и оптимизированы варианты ИФА для количествен- ного определения компонентов (анатоксина и мембранного белка OprF) рекомбинан- тной вакцины синегнойной в процессе производства. Методы могут быть использова- ны для контроля качества препарата в процессе его изготовления и хранения.