DEVELOPMENT OF ELISAS FOR THE QUALITY CONTROL OF A RECOMBINANT PSEUDOMONAS VACCINE

A. V. Soldatenkova; Солдатенкова А. В.; E. M. Zimina; Зимина Е. М.; A. M. Kudryashova; Кудряшова А. М.; N. F. Gavrilova; Гаврилова Н. Ф.; I. V. Yakovleva; Яковлева И. В.; O. V. Borisova; Борисова О. В.; V. V. Sviridov; Свиридов В. В.; N. A. Mikhailova; Михайлова Н. А.

doi:10.36233/0372-9311-2019-1-95-100

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ ВАКЦИНЫ СИНЕГНОЙНОЙ

Авторы: Солдатенкова А.В.¹, Зимина Е.М.¹, Кудряшова А.М.¹, Гаврилова Н.Ф.¹, Яковлева И.В.¹, Борисова О.В.¹, Свиридов В.В.¹, Михайлова Н.А.¹
Учреждения:
1. НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Выпуск: Том 96, № 1 (2019)
Страницы: 95-100
Раздел: Статьи
Дата подачи: 23.08.2019
Дата принятия к публикации: 23.08.2019
Дата публикации: 23.04.2019
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/400
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-95-100
ID: 400

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Разработка и оптимизация иммуноферментных методов для контроля качества рекомбинантной вакцины синегнойной. Материалы и методы. Рекомбинантные белки в промежуточных продуктах и при контроле полноты сорбции выявляли в «сэндвич» вариантах твердофазного ИФА с использованием специфических поликлональных и моноклональных антител. Определение антигена в вакцине проводили по остаточному количеству антител, специфичных к анатоксину или OprF, не связавшихся с вакцинным препаратом в процессе предварительной инкубации. Результаты. Разработаны и оптимизированы ИФА для количественного определения компонентов (анатоксина и мембранного белка OprF) рекомбинантной вакцины синегнойной в процессе производства. Установлено, что методики являются специфичными для определения анатоксина и OprF, предел их количественного определения обладает приемлемой надежностью, показана возможность выбора интерполяции калибровочной зависимости в пределах аналитической области, правильность и прецизиозность удовлетворяют критериям приемлемости, методика устойчива в условиях проведения анализа. Заключение. Методы могут быть использованы для контроля качества препарата в процессе его изготовления и хранения.

Ключевые слова

Pseudomonas aeruginosa, белок наружной мембраны OprF, анатоксин, иммуноферментный анализ, рекомбинантная вакцина синегнойная

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, проводят вакцинацию, антибиотикотерапию и фаготера- пию. Однако многочисленные исследования показывают, что широкое бесконт- рольное применение антибиотиков привело к серьезному ограничению в вариантах лечения и вскрыло проблему антибиотикорезистентности возбудителя. В связи с этим вакцинопрофилактика приобрела приоритетное значение в борьбе с синегной- ной инфекцией. В НИИВС им. И.И. Мечникова разработана рекомбинантная вакцина, пред- назначенная для профилактики синегнойной инфекции, проходящая в настоящее время доклинические испытания. Препарат состоит из двух протективных реком- бинантных белков P. aeruginosa, сорбированных на гидроксиде алюминия [3, 6]. Для доклинических испытаний получены три серии рекомбинантной синегнойной вак- цины (РВС). Целью настоящего исследования является разработка иммунофермен- тных методов для контроля качества препарата, позволяющих выявлять отдельные компоненты до их сорбции на гидроксиде алюминия, так и определять количест- венный состав готового вакцинного препарата. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы Рекомбинантные белки OprF [2] (четыре серии) и анатоксин [1] (аТох; четы- ре серии), 3 серии вакцины РВС [3, 6], конъюгаты (КГ) моноклональных антител с пероксидазой хрена, специфичные к OprF (№ 1, 5) и специфичные к анатоксину (№ 21) [Солдатенкова А.В. и др., 2013]. Поликлональные антитела кролика выделяли из иммунных сывороток пу- тем осаждения сульфатом аммония и хроматографической очистки на иммунном сорбенте. Сыворотку крови кроликов получали четырехкратной иммунизацией с двухнедельным интервалом анатоксином в дозе 50 мкг/животное с адъювантом. Забор крови осуществляли через две недели после последнего введения. Конъюгаты антител с пероксидзой хрена готовили по методу Nаkane P.K. and Kawoi A.A. [9]. Стандартные серии рекомбинантных белков и вакцинных препаратов получали со- гласно методикам, разработанным в НИИВС им. И И. Мечникова [1, 2]. Для приго- товления растворов использовали деионизированную воду (Milli-Q System, Millipore, США). Для проведения ИФА использовали 96-луночные планшеты (Costar). Оптическую плотность измеряли на аппарате BioRadModel 680. Инкубацию планшет проводили на термостатируемом планшетном встряхивателе (ELMI SkyLine) при режиме 500 об/мин и температуре 37 °С. После всех инкубаций прово- дили отмывку планшет на планшетном промывателе (StatFax). В «сендвич» варианте ИФА для выявления рекомбинантного анатоксина ис- пользовали специфические поликлональные антитела кролика для захвата и мо- ноклональные антитела мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (ПХ), в качестве детектирующих. Выявление OprF осуществляли с использованием пары специфичных моноклональных антител. В 96-луночные планшеты вносили по 100 мкл поликлональных антител к ана- токсину или моноклональных антител к OprF в 0,02 М фосфатном буферном рас- творе рН 7,2. Параллельно анализировали разведения стандартной и исследуемой серии рекомбинантного белка. Планшеты выдерживали в течение 19-22 ч при тем- пературе (4-8) °C. Далее вносили образцы, содержащие рекомбинантный анатоксин или OprF в различных разведениях в 0,02 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% Tween 20 и выдерживали при тем- пературе 37±2 °С и постоянном встряхивании со скоростью 500 об/мин в течение 1 ч. На второй стадии анализа, после отмывки, в лунки вносили 100 мкл конъюгата (КГ), соответственно, моноклональных антител к анатоксину или OprF, конъюгиро- ванных с пероксидазой хрена, и повторяли этап инкубирования в течение 30±2 мин. После отмывки вносили по 100 мкл 33 мМ цитратного буферного раствора рН 4,0, содержащего 0,01% перекиси водорода и 0,5 мМ 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина. Через 15 мин реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2N серной кислоты, из- меряли оптическую плотность (ОП) в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 680 нм. Калибровочные графики зависи- мости оптической плотности от концентрации белка строили на основании данных, полученных для стандартных серий соответствующих рекомбинантных белков. Выявление анатоксина и OprF в вакцинных препаратах проводили следующим образом: параллельно анализировали разведения стандартной и исследуемой серии вакцины. На первой стадии в пробирках смешивали конъюгат моноклональных ан- тител с пероксидазой хрена, специфичных к анатоксину или OprF, с разными раз- ведениями образцов (от 0,5 до 10 мкг/мл в пересчете на анатоксин или на OprF) и выдерживали пробы при температуре 22±4°С в течение 40 мин, периодически пере- мешивая. Образовавшийся комплекс антител, меченных пероксидазой, с антигеном (АГ), сорбированным на геле гидроксида алюминия, отделяли центрифугировани- ем. Не связавшиеся антитела, меченные ПХ, оставшиеся в надосадочной жидкости, исследовали методом иммуноферментного анализа. Для постановки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизиро- ванные aTox или OprF. В лунки планшета вносили по 100 мкл надосадочной жидкости и инкубировали в течение 30 мин в шейкере при температуре 37±2 °С, скорости вра- щения 500 об/мин. Ферментативную реакцию регистрировали, как описано выше. Строили калибровочный график зависимости оптической плотности от концен- трации рекомбинантных анатоксина или OprF в стандартной серии. Регистрируемая оптическая плотность была обратно пропорциональна концентрации aTox или OprF в анализируемых образцах. В каждом случае проводили подбор параметров ИФА с целью достижения максимальной чувствительности. Чувствительность оценивали путем определения предела обнаружения (ПО) и предела количественного обнаружения (ПКО). ПО определяли по калибровочному графику как концентрацию препарата, соответс- твующую пороговому значению оптической плотности (ОП порог.), определяемому по формуле: ОПпорог.=ОПср.К- ± 3σ, ПКО определи по калибровочному графику как концентрацию препарата, соответствующую пороговому значению оптической плотности, определяемому по формуле: ОП порог.=ОПср.К-±10σ, где ОПср.К — среднее арифметическое значение ОП нулевой пробы, σ — среднее квадратическое отклонение ОП нулевой пробы (8 повторов). Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения Microsoft Оffice Еxcel 2013. Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Для количественной оценки рекомбинантных антигенов до сорбции на геле гидроксида алюминия оптимизированы твердофазные иммуноферментные двухста- дийные сэндвич-методы. На основании результатов исследований токсичности, иммуногенности и под- линности по одной серии рекомбинантных белков OprF и аТох и вакцины были определены как стандартные. Проведена оптимизация всех стадий иммунофермен- тного анализа: подобраны пары иммобилизованных и детектирующих антител, их концентрации, время и режим инкубаций, концентрации конъюгатов. Для выявле- ния анатоксина оптимальной парой антител оказались поликлональные антитела кролика в качестве иммобилизованных в концентрации 5 мкг/мл и КГ монокло- нальных антител № 21 с пероксидазой хрена в разведении 1:80 000. В методе для выявления OprF оптимальная концентрация иммобилизованных антител (МкАт № 5) соответствовала 2 мкг/мл КББ, в качестве детектирующих антител использова- ли МкАт № 1, меченные ПХ в концентрации 1:80 000. Содержание анатоксина или OprF в исследуемых образцах определяли по калибровочному графику зависимости оптической плотности от количественного содержания aTox или OprF в разведени- ях стандартных серий с известным содержанием белков. Типичные калибровочные графики представлены на рис. 1 (А,Б).

Рис. 1. Калибровочные графики зависимости оптической плотности от концентрации aTox (А) и OprF (Б) (мкг/мл).

Проведена оценка валидационных параметров методик для количественного определения анатоксина и OprF по следующим параметрам: специфичность мето- дики, предел количественного определения, правильность, точность, сходимость, воспроизводимость и устойчивость методики [4, 5, 8]. Разработанные методы были спе- цифичны для выявления анатоксина и OprF, соответственно, присутствие вто- рого компонента вакцины не влияло на предел количественного обнаружения. ПКО обеспечивает необходимую чувс- твительность для определения аТox и OprF до сорбции и при определении остаточных белков после сорбции на гидроксиде алюминия и составляет ме- нее 0,1% от содержания рекомбинант- ных белков в вакцинном препарате. Тест на линейность при разведении соответс- твовал валидационным критериям, по- казал отклонение не более чем на 20 %. Оптимизация методик оценки коли- чественного содержания рекомбинант- ных белков в составе вакцины выполне- на с использованием стандартной серии вакцины с содержанием аТох 100 мкг/ мл и OprF 50 мкг/мл. Оптимальная кон- центрация анатоксина или OprF, им- мобилизованных на поверхности лунок планшета, составила 2 мкг/мл в КББ для обоих рекомбинантных белков, рабочие разведения конъюгатов МкАт-ПХ со- ответствовали 1:80 000. Калибровочные графики и аналитические характе- ристики методов для количественной оценки рекомбинантных белков в вак- цине представлены на рис. 2 и в табл. Предел количественного обнаружения составил не более 1,5% от номинально- го содержания антигена в вакцине.

Рис. 2. Калибровочные графики с обратной зависимостью для количественного определения aTox (А) и OprF (Б) в вакцине (мкг/мл).

Контроль качества сорбированной вакцины предполагает количественное определение содержания компонентов в промежуточных и конечном продуктах. Одним из подходов количественного оп- ределения антигена в адсорбированном препарате является десорбция компонен- тов с частиц гидроокиси алюминия [10]. В настоящем исследовании исполь- зован альтернативный подход, пред- полагающий определение антигена в исследуемой вакцине по остаточному количеству антител, специфичных к анатоксину или OprF, не связавшихся с вакцинным препаратом в процессе предварительной инкубации. В отличие от описанных анало- гичных подходов [7], [EP 2 705 365 B1. Immunoassay for direct determination of antigen content of products comprising adjuvant-coupled-antigen particles; US 2004/0033545 A1. Competitive enzyme immunoassay for assessing total antigen content of aluminum-adsorbed antigens] для инкубации с вакцинными препа- ратами использовали специфические моноклональные антитела, конъюгиро- ванные с пероксидазой, что позволяло проводить их выявление прямым твер- дофазным иммуноферментным мето- дом только в одну стадию. Методика, разработанная для количественного оп- ределения адсорбированного на гидро- окиси алюминия антигена, включала стадию центрифугирования, что сводило к ми- нимуму влияние гидроокиси алюминия на результаты иммуноферментного анализа. В результате проведенной валидации установлено, что методики являются специфичными для определения анатоксина и OprF, предел их количественного определения обладает приемлемой надежностью, показана возможность выбора интерполяции калибровочной зависимости в пределах аналитической области, пра- вильность и прецизиозность удовлетворяют критериям приемлемости, методика устойчива в условиях проведения анализа. Таким образом, разработаны и оптимизированы варианты ИФА для количествен- ного определения компонентов (анатоксина и мембранного белка OprF) рекомбинан- тной вакцины синегнойной в процессе производства. Методы могут быть использова- ны для контроля качества препарата в процессе его изготовления и хранения.