EFFECTIVENESS OF THE LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION WITH FLUORESCENT DETECTION IN THE DIAGNOSIS OF PARVOVIRUS ENTERITIS IN CARNIVORES

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), благодаря своей универсальнос-
ти, высокой специфичности и чувствительности стал «золотым стандартом» диа-
гностики многих инфекционных заболеваний как в медицине, так и в ветеринарии.
Однако, применение метода ПЦР для диагностики на месте оказания медицинской
помощи («point-of-care»), в походно-полевых условиях или в животноводческих
хозяйствах крайне затруднительно. Высокая потребность в средствах диагностики
«point-of-care» заставляет исследователей искать подходящие методы, в числе кото-
рых особый интерес представляют методы изотермической амплификации нуклеи-
новых кислот (ИАНК). Одним из наиболее перспективных методов ИАНК признан
метод петлевой изотермической амплификации ДНК, разработанный Notomi T. et
al. (LAMP, Loop-mediated Isothermal Amplification) [2]. В состав реакционной сме-
си LAMP, как правило, входит ДНК-полимераза термофильной бактерии Bacillus
stearothermophilus (Bst ДНК-полимераза), которая обладает 5’-3’-ДНК-полиме-
разной активностью, способностью к замещению (вытеснению) цепей ДНК и не
проявляет 5’-3’-экзонуклеазной активности. Благодаря использованию Bst ДНК-
полимеразы, реакция LAMP проходит при постоянной температуре и не требует
применения сложного и дорогого оборудования. Продукты реакции накапливаются
в количестве, многократно превышающем количество продуктов ПЦР, что позво-
ляет проводить визуальную детекцию результата прямо в пробирке. В классическом
варианте LAMP в состав реакционной смесит входит четыре олигонуклеотидных
праймера, что обеспечивает высокую специфичность метода при чувствительности,
сопоставимой с ПЦР [1, 3].
Существуют разные способы детекции результатов реакции LAMP — электро-
форетический, колориметрический, турбидиметрический, флуоресцентный и дру-
гие. Использование интеркалирующих красителей ДНК является, на наш взгляд,
одним из наиболее перспективных подходов, позволяющим проводить не только
визуальную детекцию результата, но также и флуориметрическую детекцию «по ко-
нечной точке» или в режиме реального времени. Важно отметить, что инструмен-
тальные методы детекции минимизируют риск получения ложноположительных
результатов в результате контаминации ампликонами и позволяют количественно
определять ДНК-мишень. Проведение реакции ИАНК при постоянной темпера-
туре предоставляет возможность конструировать портативные анализаторы (весом
менее 2 кг), включающие твердотельный термостат, оптический блок, встроенный
или внешний компьютер.
В настоящей работе в качестве модели использованы вирусы энтерита норок
(ВЭН), энтерита собак (ВЭС) и панлейкопении кошек (вирус ПЛК), которые от-
носятся к одному виду, роду, подсемейству и семейству. Парвовирусы имеют сфе-
рический вирион диаметром 20 нм без оболочки и одноцепочечный ДНК геном.
Заболевания, вызванные вирусами вида Carnivore protoparvovirus 1, сопровождаются
высокой смертностью и опасны, в первую очередь, для новорожденных и молодых
животных. Для диагностики парвовирусного энтерита применяются методы ПЦР
и иммуноферментного анализа, требующие отправки образцов в специализирован-
ную лабораторию. Экспресс-методы диагностики, такие как латексагглютинация,
обладают меньшей чувствительностью. Целью исследования являлась оценка пара-
метров диагностической ценности метода LAMP с флуоресцентной детекцией в ре-
жиме реального времени (real-time LAMP, или RT-LAMP) на модели парвовирусов —
возбудителей энтерита у плотоядных.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Образцы фекалий, крови и мазков из прямой кишки разных видов хищных жи-
вотных (кошек, собак, норок, лисиц) с парвовирусным энтеритом (n=39) и здоровых
животных (n=31), а также лабораторные культуральные штаммы вируса энтерита
норок «Береговой» и «Родники» были предоставлены компанией ООО «Биоцентр».
Для постановки ПЦР использовали праймеры к гену белка VP2 вируса Carnivore
protoparvovirus 1 и зонд, меченный красителем ROX, описанные в статье Streck A.F.
et al. [4]. Амплификацию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл с ис-
пользованием набора реагентов «2,5х реакционная смесь для ПЦР-РВ» («Синтол»).
Реакционная смесь содержала по 5 пмоль каждого праймера и 5 пмоль зонда. ПЦР-
РВ проводилась в амплификаторе ДТпрайм («ДНК-технология») в режиме 95°С —
90 сек. (1 цикл); 95°С — 20 сек., 58°С — 40 сек. (45 циклов). Визуальная детекция ре-
зультатов LAMP и ПЦР-РВ проводилась методом электрофореза в 1,5% агарозном
геле с бромистым этидием, а для LAMP также путем добавления 10 мкл стократного
разведения раствора SYBR Green I (кат. №S9430, «Sigma-Aldrich») к 10 мкл продук-
тов реакции амплификации.
Для проведения реакции LAMP использовали праймеры к гену белка VP2 вируса
энтерита норок, описанные в статье Wang J. et al. [7]. Реакционная смесь объемом 25
мкл содержала 8 ед ДНК-полимеразы Bst 2.0 WarmStart («BioLabs», Великобритания),
2,5 мкл 10х буфера для Bst полимеразы, MgSO4 8 мМ, смесь дезоксинуклеозидтри-
фосфатов 2 мМ каждого («Синтол», Россия), по 5 пмоль каждого из внешних (M-F3
и M-B3) и по 15 пмоль внутренних (M-FIP и M-BIP) праймеров, краситель SYTO-9
или SYTO-82 (Invitrogen, США). Реакцию проводили в амплификаторе ДТпрайм
(«ДНК-Технология», Россия) в режиме 65° С — 60 мин; 80° С — 10 мин. Для ре-
гистрации флуоресценции красителей SYTO-9 и SYTO-82 использовали цветовые
каналы FAM и R6G, соответственно.
Для определения оптимальной концентрации красителей SYTO-9 и SYTO-82 и
отношения сигнал/фон использовали их в концентрации 0,5 мкM, 1 мкM и 2 мкM.
Выделение ДНК из клинических и контрольных образцов производили с помо-
щью набора реагентов РИБО-преп (ЦНИИ эпидемиологии, Москва). Отношение
сигнал/фон определяли на основе данных амплификатора ДТпрайм путем деления
максимального значения флуоресценции на значение флуоресценции до начала
роста сигнала. Вычисление проводилось для каждой реакции отдельно. Время по-
явления сигнала в LAMP (значение Tt) и значение порогового цикла в ПЦР (ПЦ)
определялось автоматически с помощью программы RealTime PCR v.7.7 («ДНК-
Технология») на основе математического анализа формы кривой амплификации
(метод геометрический, Cp). Все праймеры и зонды синтезированы в OOO «ДНК-
Синтез» (Россия).
Для оценки аналитической чувствительности реакции LAMP использовали пос-
ледовательные десятикратные разведения ДНК ВЭН штамма «Береговой» с извес-
тной концентрацией от 1,5×107 до 1,5×101 копий/мл. Диагностическую чувствитель-
ность LAMP рассчитывали определением доли положительных результатов LAMP
для образцов, в которых методом ПЦР-РВ была обнаружена ДНК парвовируса
плотоядных. Диагностическую специфичность LAMP рассчитывали определением
доли отрицательных результатов LAMP для образцов, в которых методом ПЦР-РВ
не была обнаружена ДНК парвовируса плотоядных.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
В исследовании J. Wang et al. [7] показана высокая эффективность метода LAMP
в диагностике парвовирусного энтерита норок. В работе продукты амплификации
визуализировали методом электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием ли-
бо добавлением в реакционную смесь красителя SYBR Green I. Поскольку примене-
ние этих методов детекции сопряжено с высоким риском контаминации исследуе-
мых образцов ампликонами и получения ложноположительных результатов, мы на
данной модели исследовали эффективность RT-LAMP флуоресцентной детекцией
результатов.
Основным требованием к интеркалирующим красителям ДНК для детекции
результатов RT-LAMP является их неспособность в рабочей концентрации ингиби-
ровать активность ДНК-полимеразы. Важным показателем для системы детекции в
режиме реального времени также является отношение интенсивности положитель-
ного сигнала к фоновому свечению, или отношение сигнал/фон. Высокие значения
данного показателя обеспечивает надежную трактовку результата как при флуори-
метрической детекции результата в режиме реального времени, так и по конечной
точке. В эксперименте по RT-LAMP анализу клинических образцов мы определили
отношение сигнал/фон для двух интеркалирующих красителей ДНК — SYTO-9 и
SYTO-82, которые, как показано в предыдущих исследованиях [5, 6], в наименьшей
степени ингибируют Bst ДНК-полимеразу. Краситель SYTO-82 показал более высо-
кое и стабильное отношение сигнал/фон (22,6±2,1), чем краситель SYTO-9 (6,3±1,5)
(p < 0,0000001). При анализе ДНК штамма ВЭН «Береговой», полученного в куль-
туре клеток, признаков ингибирования реакции названными красителями в диапа-
зоне концентраций 0,5 — 2 мкM не выявлено. Однако при постановке реакции с
клиническими образцами от норок было отмечено, что время появления сигнала
(значение Tt) и его нарастания до максимальных значений для SYTO-9 значительно
меньше, чем у SYTO-82. В среднем сигнал в реакциях в присутствии SYTO-9 появ-
лялся на 2 мин (при концентрации 1мкМ) (р < 0,001) и на 5 минут (при концентра-
ции 2 мкМ) (р < 0,0017) раньше, чем в реакции c тем же клиническим образцом в
присутствии SYTO-82. При этом при повышении концентрации красителя SYTO-82
отмечались признаки ингибирования реакции. Так, при концентрации SYTO-82 в 1
мкМ сигнал появлялся в среднем на 3 мин раньше, чем при концентрации 2 мкМ
(р < 0,021). В реакциях с SYTO-9 изменений значения Tt в зависимости от концент-
рации красителя не наблюдалось.
Для оценки аналитической чувствительности реакции LAMP использова-
ли последовательные десятикратные разведения ДНК ВЭН (штамм «Береговой»)
с известной концентрацией. Чувствительность LAMP составила 1,5×103 копий
ДНК/мл, тогда как чувствительность ПЦР-РВ составила менее 1,5×102 копий
ДНК/мл (табл.).
В качестве референтного метода выявления результатов LAMP применяли элек-
трофорез в агарозном геле с бромистым этидием и прямое окрашивание продуктов
амплификации в микропробирках. При добавлении раствора SYBR Green I в реакци-
онную смесь наблюдалось окрашивание реакционной смеси в зеленый цвет в случае
положительной реакции и в светло-коричневый цвет в образцах с отрицательным
результатом. При облучении пробирок ультрафиолетом (λ=320 нм) в положитель-
ных образцах наблюдается ярко-зеленое свечение, отсутствующее в отрицательных
образцах.
Одной из характеристик реакции LAMP является высокая скорость накопления
продуктов амплификации. Так, например, клинические образцы с высоким содер-
жанием вирусной ДНК (до 2×1011 копий/мл) давали прирост флуоресценции с кра-
сителем SYTO-9, начиная уже с четвертой минуты реакции. На пределе чувствитель-
ности (10 копий ДНК на реакционную смесь) достоверный прирост флуоресценции
в реакционной смеси наблюдался через 23 минуты (SYTO-9) и 36 минут (SYTO-82),
тогда как в ПЦР-РВ выявление того же количества ДНК требует примерно 74-76
минут. Графики флуоресценции, полученные для красителя SYTO-82, отличались по
форме и характеризовались значительным отклонением от сигмоидной функции,
наилучшим образом описывающей данный тип накопления сигнала. Наличие та-
ких отклонений, особенно в начальной фазе роста флуоресценции, свидетельствует
о неоптимальных условиях реакции или наличии ингибиторов. На эффективность
RT-LAMP в данном случае мог повлиять сам краситель SYTO-82. Однако эта гипо-
теза требует подтверждения в дополнительных экспериментах.
Для определения диагностической чувствительности и специфичности реакции
LAMP использовали центрифугаты кала от 5 норок с лабораторно-подтвержденным
(ПЦР-РВ) парвовирусным энтеритом, в том числе двух животных, эксперименталь-
но зараженных штаммами ВЭН «Береговой» и «Родники». Также использовали 34
образца крови, кала и ректальных смывов от больных животных, в которых методом
ПЦР-РВ было подтверждено наличие ДНК парвовируса плотоядных, и 31 образец
от здоровых животных, давших отрицательный результат в ПЦР-РВ. Все образцы
были проанализированы в реакции RT-LAMP с красителем SYTO-82. В результате
RT-LAMP анализа ДНК парвовируса плотоядных была обнаружена у 32 животных с
парвовирусным энтеритом.
Несмотря на то, что метод LAMP по, нашим данным, несколько уступает по
аналитической чувствительности методу ПЦР-РВ, он показал 100% диагностичес-
кую чувствительность на образцах от норок и кошек. Однако при анализе образцов
от собак выявлено два случая несоответствия (результаты положительные в ПЦР, но
отрицательные в RT-LAMP), а доля сопоставимых с ПЦР-РВ результатов состави-
ла 91%. Более низкая диагностическая чувствительность RT-LAMP на образцах от
собак может быть объяснена тем, что праймеры для LAMP были подобраны и реко-
мендованы авторами [7] для выявления ДНК ВЭН, но не филогенетически близкого
ВЭС. Действительно, проведенный нами анализ нуклеотидных последовательнос-
тей геномов ВЭС из базы данных GenBank (NCBI) позволил выявить у некоторых
штаммов несовпадения в сайтах связывания праймеров для LAMP, способные ухуд-
шить диагностическую чувствительность.
В образцах здоровых животных ДНК парвовируса не обнаружена, следователь-
но, диагностическая специфичность LAMP составила 100%.
Таким образом, полученные результаты показали, что при детекции результа-
тов LAMP по конечной точке предпочтительным является использование красителя
SYTO-82, обеспечивающего большее отношение сигнал/фон. Тогда как при флуо-
ресцентной детекции в режиме реального времени лучше использовать SYTO-9, пос-
кольку он обеспечивает более быстрое получение результата. Метод RT-LAMP обес-
печивает высокую чувствительность и специфичность выявления ДНК парвовируса
плотоядных в клинических образцах, при этом время проведения реакции, позволя-
ющее достичь максимальной аналитической чувствительности, составляет 30-40 мин.
Выявленная нами на порядок более низкая аналитическая чувствительность метода
RT-LAMP по сравнению с ПЦР-РВ не способна ухудшить диагностической чувстви-
тельности, поскольку парвовирусный энтерит характеризуется крайне высокой кон-
центрацией вирусной ДНК в фекалиях. Так, средняя концентрация парвовирусной
ДНК в исследованных нами клинических образцах составила 2,8×1010 копий/мл.
Реакция LAMP является перспективным методом для быстрой и высокочувс-
твительной диагностики инфекционных заболеваний «point-of-care», а также в
условиях животноводческих хозяйств или в походно-полевых условиях. Однако,
для его внедрения в лабораторную практику требуется решить ряд проблем. Учет
результатов в нашей работе проводился в амплификаторе ДТпрайм, разработан-
ном для постановки и учета результатов ПЦР-РВ, однако изотермический харак-
тер реакции LAMP позволяет проводить детекцию в более простых, недорогих и
компактных приборах. Компании Eiken Chemical (Япония) и OptiGene Limited
(Великобритания) уже разработали и внедрили подобные приборы, основанные на
методах турбидиметрии или флуориметрии с детекцией в режиме реального време-
ни. Актуальной остается разработка и внедрение портативного термостатируемого
флуориметра отечественного производства для постановки ИАНК. Важной пробле-
мой остается также создание упрощенных систем пробоподготовки, позволяющих
быстро и с минимальным риском контаминации подготовить образцы к анализу во
внелабораторных условиях.

About the authors

O. A. Petrusha

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

T. L. Chernichenko

Company «Biocenter»

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

I. A. Kofiadi

Company «DNATechnology»

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

V. V. Zverev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera,
Sechenov First Moscow State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

E. B. Faizuloev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

References

Supplementary files