ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА ПЕТЛЕВОЙ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ В ДИАГНОСТИКЕ ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА У ПЛОТОЯДНЫХ

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Оценка параметров диагностической ценности метода петлевой изотермической амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (real-time LAMP, RTLAMP) на модели парвовирусов энтерита плотоядных. Материалы и методы. Образцы фекалий, крови и мазков из прямой кишки разных видов хищных животных с парвовирусным энтеритом (n=39) и здоровых животных (n=31), а также лабораторные штаммы вируса энтерита норок были проанализированы методом RT-LAMP с использованием красителей SYTO-9 и SYTO-82. В качестве референтного метода использовалась ПЦР в режиме реального времени. Результаты. Показано, что метод RT-LAMP на модели парвовирусного энтерита плотоядных обеспечивает высокие показатели аналитической чувствительности (1,5×103 копий ДНК/мл), диагностической чувствительности и специфичности (до 100% при оптимальных условиях). Краситель SYTO-82 обеспечивал более высокое отношение сигнал/фон (22,6±2,1), чем краситель SYTO-9 (6,3±1,5) (p<0,0000001). Вместе с тем, с красителем SYTO-9 на пределе чувствительности (10 копий ДНК) прирост флуоресценции в реакционной смеси наблюдался на 13 минут раньше, чем для SYTO-82 (23 и 36 минут, соответственно). Заключение. Реакция RT-LAMP является перспективным методом для быстрой и высокочувствительной диагностики инфекционных заболеваний на месте лечения, а также в условиях животноводческих хозяйств или в походно-полевых условиях.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), благодаря своей универсальнос-
ти, высокой специфичности и чувствительности стал «золотым стандартом» диа-
гностики многих инфекционных заболеваний как в медицине, так и в ветеринарии.
Однако, применение метода ПЦР для диагностики на месте оказания медицинской
помощи («point-of-care»), в походно-полевых условиях или в животноводческих
хозяйствах крайне затруднительно. Высокая потребность в средствах диагностики
«point-of-care» заставляет исследователей искать подходящие методы, в числе кото-
рых особый интерес представляют методы изотермической амплификации нуклеи-
новых кислот (ИАНК). Одним из наиболее перспективных методов ИАНК признан
метод петлевой изотермической амплификации ДНК, разработанный Notomi T. et
al. (LAMP, Loop-mediated Isothermal Amplification) [2]. В состав реакционной сме-
си LAMP, как правило, входит ДНК-полимераза термофильной бактерии Bacillus
stearothermophilus (Bst ДНК-полимераза), которая обладает 5’-3’-ДНК-полиме-
разной активностью, способностью к замещению (вытеснению) цепей ДНК и не
проявляет 5’-3’-экзонуклеазной активности. Благодаря использованию Bst ДНК-
полимеразы, реакция LAMP проходит при постоянной температуре и не требует
применения сложного и дорогого оборудования. Продукты реакции накапливаются
в количестве, многократно превышающем количество продуктов ПЦР, что позво-
ляет проводить визуальную детекцию результата прямо в пробирке. В классическом
варианте LAMP в состав реакционной смесит входит четыре олигонуклеотидных
праймера, что обеспечивает высокую специфичность метода при чувствительности,
сопоставимой с ПЦР [1, 3].
Существуют разные способы детекции результатов реакции LAMP — электро-
форетический, колориметрический, турбидиметрический, флуоресцентный и дру-
гие. Использование интеркалирующих красителей ДНК является, на наш взгляд,
одним из наиболее перспективных подходов, позволяющим проводить не только
визуальную детекцию результата, но также и флуориметрическую детекцию «по ко-
нечной точке» или в режиме реального времени. Важно отметить, что инструмен-
тальные методы детекции минимизируют риск получения ложноположительных
результатов в результате контаминации ампликонами и позволяют количественно
определять ДНК-мишень. Проведение реакции ИАНК при постоянной темпера-
туре предоставляет возможность конструировать портативные анализаторы (весом
менее 2 кг), включающие твердотельный термостат, оптический блок, встроенный
или внешний компьютер.
В настоящей работе в качестве модели использованы вирусы энтерита норок
(ВЭН), энтерита собак (ВЭС) и панлейкопении кошек (вирус ПЛК), которые от-
носятся к одному виду, роду, подсемейству и семейству. Парвовирусы имеют сфе-
рический вирион диаметром 20 нм без оболочки и одноцепочечный ДНК геном.
Заболевания, вызванные вирусами вида Carnivore protoparvovirus 1, сопровождаются
высокой смертностью и опасны, в первую очередь, для новорожденных и молодых
животных. Для диагностики парвовирусного энтерита применяются методы ПЦР
и иммуноферментного анализа, требующие отправки образцов в специализирован-
ную лабораторию. Экспресс-методы диагностики, такие как латексагглютинация,
обладают меньшей чувствительностью. Целью исследования являлась оценка пара-
метров диагностической ценности метода LAMP с флуоресцентной детекцией в ре-
жиме реального времени (real-time LAMP, или RT-LAMP) на модели парвовирусов —
возбудителей энтерита у плотоядных.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Образцы фекалий, крови и мазков из прямой кишки разных видов хищных жи-
вотных (кошек, собак, норок, лисиц) с парвовирусным энтеритом (n=39) и здоровых
животных (n=31), а также лабораторные культуральные штаммы вируса энтерита
норок «Береговой» и «Родники» были предоставлены компанией ООО «Биоцентр».
Для постановки ПЦР использовали праймеры к гену белка VP2 вируса Carnivore
protoparvovirus 1 и зонд, меченный красителем ROX, описанные в статье Streck A.F.
et al. [4]. Амплификацию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл с ис-
пользованием набора реагентов «2,5х реакционная смесь для ПЦР-РВ» («Синтол»).
Реакционная смесь содержала по 5 пмоль каждого праймера и 5 пмоль зонда. ПЦР-
РВ проводилась в амплификаторе ДТпрайм («ДНК-технология») в режиме 95°С —
90 сек. (1 цикл); 95°С — 20 сек., 58°С — 40 сек. (45 циклов). Визуальная детекция ре-
зультатов LAMP и ПЦР-РВ проводилась методом электрофореза в 1,5% агарозном
геле с бромистым этидием, а для LAMP также путем добавления 10 мкл стократного
разведения раствора SYBR Green I (кат. №S9430, «Sigma-Aldrich») к 10 мкл продук-
тов реакции амплификации.
Для проведения реакции LAMP использовали праймеры к гену белка VP2 вируса
энтерита норок, описанные в статье Wang J. et al. [7]. Реакционная смесь объемом 25
мкл содержала 8 ед ДНК-полимеразы Bst 2.0 WarmStart («BioLabs», Великобритания),
2,5 мкл 10х буфера для Bst полимеразы, MgSO4 8 мМ, смесь дезоксинуклеозидтри-
фосфатов 2 мМ каждого («Синтол», Россия), по 5 пмоль каждого из внешних (M-F3
и M-B3) и по 15 пмоль внутренних (M-FIP и M-BIP) праймеров, краситель SYTO-9
или SYTO-82 (Invitrogen, США). Реакцию проводили в амплификаторе ДТпрайм
(«ДНК-Технология», Россия) в режиме 65° С — 60 мин; 80° С — 10 мин. Для ре-
гистрации флуоресценции красителей SYTO-9 и SYTO-82 использовали цветовые
каналы FAM и R6G, соответственно.
Для определения оптимальной концентрации красителей SYTO-9 и SYTO-82 и
отношения сигнал/фон использовали их в концентрации 0,5 мкM, 1 мкM и 2 мкM.
Выделение ДНК из клинических и контрольных образцов производили с помо-
щью набора реагентов РИБО-преп (ЦНИИ эпидемиологии, Москва). Отношение
сигнал/фон определяли на основе данных амплификатора ДТпрайм путем деления
максимального значения флуоресценции на значение флуоресценции до начала
роста сигнала. Вычисление проводилось для каждой реакции отдельно. Время по-
явления сигнала в LAMP (значение Tt) и значение порогового цикла в ПЦР (ПЦ)
определялось автоматически с помощью программы RealTime PCR v.7.7 («ДНК-
Технология») на основе математического анализа формы кривой амплификации
(метод геометрический, Cp). Все праймеры и зонды синтезированы в OOO «ДНК-
Синтез» (Россия).
Для оценки аналитической чувствительности реакции LAMP использовали пос-
ледовательные десятикратные разведения ДНК ВЭН штамма «Береговой» с извес-
тной концентрацией от 1,5×107 до 1,5×101 копий/мл. Диагностическую чувствитель-
ность LAMP рассчитывали определением доли положительных результатов LAMP
для образцов, в которых методом ПЦР-РВ была обнаружена ДНК парвовируса
плотоядных. Диагностическую специфичность LAMP рассчитывали определением
доли отрицательных результатов LAMP для образцов, в которых методом ПЦР-РВ
не была обнаружена ДНК парвовируса плотоядных.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
В исследовании J. Wang et al. [7] показана высокая эффективность метода LAMP
в диагностике парвовирусного энтерита норок. В работе продукты амплификации
визуализировали методом электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием ли-
бо добавлением в реакционную смесь красителя SYBR Green I. Поскольку примене-
ние этих методов детекции сопряжено с высоким риском контаминации исследуе-
мых образцов ампликонами и получения ложноположительных результатов, мы на
данной модели исследовали эффективность RT-LAMP флуоресцентной детекцией
результатов.
Основным требованием к интеркалирующим красителям ДНК для детекции
результатов RT-LAMP является их неспособность в рабочей концентрации ингиби-
ровать активность ДНК-полимеразы. Важным показателем для системы детекции в
режиме реального времени также является отношение интенсивности положитель-
ного сигнала к фоновому свечению, или отношение сигнал/фон. Высокие значения
данного показателя обеспечивает надежную трактовку результата как при флуори-
метрической детекции результата в режиме реального времени, так и по конечной
точке. В эксперименте по RT-LAMP анализу клинических образцов мы определили
отношение сигнал/фон для двух интеркалирующих красителей ДНК — SYTO-9 и
SYTO-82, которые, как показано в предыдущих исследованиях [5, 6], в наименьшей
степени ингибируют Bst ДНК-полимеразу. Краситель SYTO-82 показал более высо-
кое и стабильное отношение сигнал/фон (22,6±2,1), чем краситель SYTO-9 (6,3±1,5)
(p < 0,0000001). При анализе ДНК штамма ВЭН «Береговой», полученного в куль-
туре клеток, признаков ингибирования реакции названными красителями в диапа-
зоне концентраций 0,5 — 2 мкM не выявлено. Однако при постановке реакции с
клиническими образцами от норок было отмечено, что время появления сигнала
(значение Tt) и его нарастания до максимальных значений для SYTO-9 значительно
меньше, чем у SYTO-82. В среднем сигнал в реакциях в присутствии SYTO-9 появ-
лялся на 2 мин (при концентрации 1мкМ) (р < 0,001) и на 5 минут (при концентра-
ции 2 мкМ) (р < 0,0017) раньше, чем в реакции c тем же клиническим образцом в
присутствии SYTO-82. При этом при повышении концентрации красителя SYTO-82
отмечались признаки ингибирования реакции. Так, при концентрации SYTO-82 в 1
мкМ сигнал появлялся в среднем на 3 мин раньше, чем при концентрации 2 мкМ
(р < 0,021). В реакциях с SYTO-9 изменений значения Tt в зависимости от концент-
рации красителя не наблюдалось.
Для оценки аналитической чувствительности реакции LAMP использова-
ли последовательные десятикратные разведения ДНК ВЭН (штамм «Береговой»)
с известной концентрацией. Чувствительность LAMP составила 1,5×103 копий
ДНК/мл, тогда как чувствительность ПЦР-РВ составила менее 1,5×102 копий
ДНК/мл (табл.).
В качестве референтного метода выявления результатов LAMP применяли элек-
трофорез в агарозном геле с бромистым этидием и прямое окрашивание продуктов
амплификации в микропробирках. При добавлении раствора SYBR Green I в реакци-
онную смесь наблюдалось окрашивание реакционной смеси в зеленый цвет в случае
положительной реакции и в светло-коричневый цвет в образцах с отрицательным
результатом. При облучении пробирок ультрафиолетом (λ=320 нм) в положитель-
ных образцах наблюдается ярко-зеленое свечение, отсутствующее в отрицательных
образцах.
Одной из характеристик реакции LAMP является высокая скорость накопления
продуктов амплификации. Так, например, клинические образцы с высоким содер-
жанием вирусной ДНК (до 2×1011 копий/мл) давали прирост флуоресценции с кра-
сителем SYTO-9, начиная уже с четвертой минуты реакции. На пределе чувствитель-
ности (10 копий ДНК на реакционную смесь) достоверный прирост флуоресценции
в реакционной смеси наблюдался через 23 минуты (SYTO-9) и 36 минут (SYTO-82),
тогда как в ПЦР-РВ выявление того же количества ДНК требует примерно 74-76
минут. Графики флуоресценции, полученные для красителя SYTO-82, отличались по
форме и характеризовались значительным отклонением от сигмоидной функции,
наилучшим образом описывающей данный тип накопления сигнала. Наличие та-
ких отклонений, особенно в начальной фазе роста флуоресценции, свидетельствует
о неоптимальных условиях реакции или наличии ингибиторов. На эффективность
RT-LAMP в данном случае мог повлиять сам краситель SYTO-82. Однако эта гипо-
теза требует подтверждения в дополнительных экспериментах.
Для определения диагностической чувствительности и специфичности реакции
LAMP использовали центрифугаты кала от 5 норок с лабораторно-подтвержденным
(ПЦР-РВ) парвовирусным энтеритом, в том числе двух животных, эксперименталь-
но зараженных штаммами ВЭН «Береговой» и «Родники». Также использовали 34
образца крови, кала и ректальных смывов от больных животных, в которых методом
ПЦР-РВ было подтверждено наличие ДНК парвовируса плотоядных, и 31 образец
от здоровых животных, давших отрицательный результат в ПЦР-РВ. Все образцы
были проанализированы в реакции RT-LAMP с красителем SYTO-82. В результате
RT-LAMP анализа ДНК парвовируса плотоядных была обнаружена у 32 животных с
парвовирусным энтеритом.
Несмотря на то, что метод LAMP по, нашим данным, несколько уступает по
аналитической чувствительности методу ПЦР-РВ, он показал 100% диагностичес-
кую чувствительность на образцах от норок и кошек. Однако при анализе образцов
от собак выявлено два случая несоответствия (результаты положительные в ПЦР, но
отрицательные в RT-LAMP), а доля сопоставимых с ПЦР-РВ результатов состави-
ла 91%. Более низкая диагностическая чувствительность RT-LAMP на образцах от
собак может быть объяснена тем, что праймеры для LAMP были подобраны и реко-
мендованы авторами [7] для выявления ДНК ВЭН, но не филогенетически близкого
ВЭС. Действительно, проведенный нами анализ нуклеотидных последовательнос-
тей геномов ВЭС из базы данных GenBank (NCBI) позволил выявить у некоторых
штаммов несовпадения в сайтах связывания праймеров для LAMP, способные ухуд-
шить диагностическую чувствительность.
В образцах здоровых животных ДНК парвовируса не обнаружена, следователь-
но, диагностическая специфичность LAMP составила 100%.
Таким образом, полученные результаты показали, что при детекции результа-
тов LAMP по конечной точке предпочтительным является использование красителя
SYTO-82, обеспечивающего большее отношение сигнал/фон. Тогда как при флуо-
ресцентной детекции в режиме реального времени лучше использовать SYTO-9, пос-
кольку он обеспечивает более быстрое получение результата. Метод RT-LAMP обес-
печивает высокую чувствительность и специфичность выявления ДНК парвовируса
плотоядных в клинических образцах, при этом время проведения реакции, позволя-
ющее достичь максимальной аналитической чувствительности, составляет 30-40 мин.
Выявленная нами на порядок более низкая аналитическая чувствительность метода
RT-LAMP по сравнению с ПЦР-РВ не способна ухудшить диагностической чувстви-
тельности, поскольку парвовирусный энтерит характеризуется крайне высокой кон-
центрацией вирусной ДНК в фекалиях. Так, средняя концентрация парвовирусной
ДНК в исследованных нами клинических образцах составила 2,8×1010 копий/мл.
Реакция LAMP является перспективным методом для быстрой и высокочувс-
твительной диагностики инфекционных заболеваний «point-of-care», а также в
условиях животноводческих хозяйств или в походно-полевых условиях. Однако,
для его внедрения в лабораторную практику требуется решить ряд проблем. Учет
результатов в нашей работе проводился в амплификаторе ДТпрайм, разработан-
ном для постановки и учета результатов ПЦР-РВ, однако изотермический харак-
тер реакции LAMP позволяет проводить детекцию в более простых, недорогих и
компактных приборах. Компании Eiken Chemical (Япония) и OptiGene Limited
(Великобритания) уже разработали и внедрили подобные приборы, основанные на
методах турбидиметрии или флуориметрии с детекцией в режиме реального време-
ни. Актуальной остается разработка и внедрение портативного термостатируемого
флуориметра отечественного производства для постановки ИАНК. Важной пробле-
мой остается также создание упрощенных систем пробоподготовки, позволяющих
быстро и с минимальным риском контаминации подготовить образцы к анализу во
внелабораторных условиях.
×

Об авторах

О. А. Петруша

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru
Россия

Т. Л. Черниченко

ООО «Биоцентр»

Email: fake@neicon.ru
Россия

И. А. Кофиади

ООО «ДНК-Технология»

Email: fake@neicon.ru
Россия

В. В. Зверев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова,
Первый московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова

Email: fake@neicon.ru
Россия

Е. Б. Файзулоев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Россия

Список литературы

  1. Craw P., Balachandra W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 2012, 12(14):2469-2486.
  2. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000, 28(12): E63.
  3. Notomi T., Mori Y., Tomita N. et al Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. Journal of Microbiology. 2015, 53 (1):1-5.
  4. Streck A.F., Rüster D., Truyen U. et al. An updated TaqMan real-time PCR for canine and feline parvoviruses. J. Virol. Meth. 2013, 193:6-8.
  5. Seyrig G., Stedtfeld R., Tourlousse D. Selection of fluorescent DNA dyes for real-time LAMP with portable and simple optics. J. Microbiol. Methods. 2015, 119:223-227.
  6. Oscorbin I.P., Belousova E.A., Zakabunin A.I. Comparison of fluorescent intercalating dyes for quantitative loop-mediated isothermal amplification (qLAMP). Biotechniques. 2016, 61(1):20-5.
  7. Wang J., Cheng S., Yi L. et al. Detection of mink enteritis virus by loop-mediated isothermal amplification (LAMP). J. Virol. Meth. 2013, 187:401-405.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Петруша О.А., Черниченко Т.Л., Кофиади И.А., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах