Email this article INDUCTION OF SECONDARY BACTERIAL PNEUMONIA IN MICE INFECTED WITH PANDEMIC AND LABORATORY STRAINS OF THE H1N1 INFLUENZA VIRUS
- Authors: Leneva I.A.1, Egorov A.Y.2, Falynskova I.N.1, Маkhmudоvа N.R.1, Kartashova N.P.1, Glubokova E.A.1, Vartanova N.O.1, Poddubikov A.V.1
-
Affiliations:
- Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
- Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Smorodintsev Research Institute of Influenza
- Issue: Vol 96, No 1 (2019)
- Pages: 68-74
- Section: Articles
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/384
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-68-74
- ID: 384
Cite item
Full Text
Abstract
Aim. In this study we developed and characterized a mouse model of secondary S. aureus and S. pneumoniae pneumonia following influenza virus infection with H1N1 pandemic and laboratory strains and their reassortment. Materials and methods. BALB/с mice were infected intranasally with A/California/04/2009/(H1N1 pndm), A/Puerto Rico/8/34 or their reassortment NIBRG-121xp followed by different strains of S. аureus и S. pneumoniae. The pathogenicity of infection was assessed by mouse survival and weight change, viral titre and bacterial count in the lungs. Results. It was shown that the infection of mice with three strains of the H1N1 influenza virus with a comparable level of pathogenicity leads to a different severity of secondary bacterial infection. The mouse adapted A/California/04/2009 pandemic strain possessed the greatest ability to alter antibacterial immunity. Conclusion. An experimental model of post-influenza bacterial pneumonia utilizing three strains of the H1N1 influenza virus and various strains of S. aureus or S. pneumoniae was established. The ability of viruses to provoke bacterial superinfection of different severity is characterized.
Full Text
ВВЕДЕНИЕБольшая часть смертельных исходов от гриппа обусловлена вторичными бак-
териальными осложнениями, среди которых ведущую роль занимают пневмонии.
Показано, что распространенность пневмоний значительно увеличивается после
эпидемий гриппа, достоверное увеличение смертности в результате пневмоний
фиксировалось во время пандемий 1918, 1957, 1968 и 2009 гг. [3, 8, 12, 14]. Во время
последней пандемии, вызванной вирусом гриппа А H1N1в 2009 г., 25-56% тяжелых
форм заболеваний и смертельных исходов были ассоциированы со вторичной пнев-
монией, из них 14-46% привели к смертельным исходам [3, 8]. Вторичная инфекция
S. pneumoniae наиболее часто коррелировала с тяжестью заболевания [13]. В то же
время , в исследовании 838 критически больных детей в США показано, что в тече-
ние 72 ч после госпитализации в отделение интенсивной терапии у 33% детей раз-
вивалась бактериальная суперинфекция, причем в 26% случаев в качестве этиологи-
ческого агента были выявлены Staphylococcus aureus , из которых 48% относились к
метициллинрезистентным штаммам (MRSA) [13].
Несмотря на широкое внедрение сезонных гриппозных вакцин, противовирус-
ных препаратов и антибиотиков, проблема бактериальных осложнений при гриппе
не перестала быть актуальной, более того, развитие резистентности бактериальной
флоры к современным антибиотикам может обострить данную проблему при возник-
новении новой пандемии гриппа. В настоящее время ВОЗ ставит задачу снижения
пневмоний после гриппозной инфекций как одну их первоочередных, что отражено
в целом ряде документов, включая «Программу исследований ВОЗ по гриппу с по-
зиции общественного здравоохранения» [8, 15], в которых подчеркивается важность
проведения клинических и научных исследований, направленных на выявление про-
гностических маркеров тяжести пневмоний после гриппозной инфекции как приори-
тетного направления, которое заслуживает немедленного внимания. Моделирование у
мышей пневмонии инфицированием их вирусом гриппа А с последующим заражением
S. pneumoniae и S. aureus проведено в нескольких ведущих лабораториях мира и опуб-
ликовано в статьях[5, 7, 9, 11]. Ранее нами также была разработана и охарактеризована
мышиная модель вирусно-бактериальной пневмонии, индуцированной последова-
тельным заражением вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009) и
S. aureus, в которой был выявлен летальный синергизм между патогенами, отмечае-
мый в эпидемиологических наблюдениях [2]. Вирус гриппа вносит ведущий вклад в
возникновение летального синергизма при сочетанном заражении двумя патогенами.
В связи с этим, выявление корреляции между патогенезом инфекции и биологичес-
кими свойствами вирусов гриппа является важнейшим подходом для определения
взаимодействия между вирусным и бактериальным агентами в патогенезе вторичной
бактериальной пневмонии после гриппозной инфекции. Кроме того, использование
вирусов различного происхождения может служить инструментом для выявления ро-
ли отдельных вирусных белков в патогенезе синергизма для определения его механиз-
ма с целью дальнейшей идентификации мишени для интервенции данной болезни.
Цель настоящей работы — разработка и характеристика экспериментальной
модели вторичной бактериальной пневмонии, вызываемой S. pneumoniae и различ-
ными штаммами S. aureus после гриппозной инфекции, индуцированной пандеми-
ческим и лабораторным штаммами подтипа Н1N1, а также их реассортантом.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
В опытах использовали клетки MDCK, полученные из коллекции НИИ виру-
сологии. Для моделирования гриппозной инфекции были использованы штамм
вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009), полученный из ВОЗ,
а также лабораторный штамм вируса гриппа А/Пуэрто Рико /8/34(H1N1) и реас-
сортант NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009)XА/Пуэрто Рико
/8/34(H1N1) (2:6), полученные из музея НИИ гриппа. Вирус А/Калифорния/04/
2009 (пндм H1N1) адаптировали к мышам путем 5 последовательных пассажей через
легкие. Для инфицирования животных вирусы выращивали в аллантоисной полости
9-дневных куриных эмбрионов. Культуры штаммов S. pneumoniae №3405, вакцин-
ный штамм S.aureus №1986, S.aureus №329, S.aureus №884 получены из коллекции
НИИВС им. И.И.Мечникова в лиофилизированном состоянии. Для восстановления
жизнеспособности культуры в ампулу добавляли 0,5 мл питательного бульона ГРМ-
бульон для S.aureus и сердечно-мозговой бульон (Mast Group Ltd, Великобритания).
Суспензию переносили в пробирку с 2 мл соответствующего бульона и инкуби-
ровали 4 ч при температуре 37°С. Затем осуществляли посев на питательный агар
Мюллера-Хинтона (HiMedia Laboratories, Индия) для S.aureus и ГРМ-агар с добав-
лением 5% лошадиной крови (ЗАО «ЭКОлаб») для S.pneumoniae. Чашки инкуби-
ровали в течение 18 ч при температуре 37°С (в 5,5% СО2 среде для S.pneumoniae).
В исследовании использовали второй пассаж бактерий после регенерации штамма.
Рабочие разведения бактериальной суспензии готовили с использованием денсито-
метра Densi-La-Meter («PLIVA-Lachema Diagnostika», Словакия). За 1х109 бактерий
в 1 мл объема принимали 0,8 ЕД мутности по McFarland.
Мышей (BALB/С, самки, массой 20-22 г) получали из питомника «Андреевка»
(Московская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных ус-
ловиях вивария. Мышей инфицировали интраназально под легким наркозом ука-
занными в каждом эксперименте дозами вирусов гриппа. Далее на 4 день после ви-
русного заражения мышей инфицировали повторно интраназально различными до-
зами S.pneumoniae и S.aureus (в объеме 0,05 мл). Клиническую тяжесть инфекции у
животных оценивали, учитывая смертность от инфекции и изменение веса, которое
рассчитывали, как описано [2]. В указанные дни после инфицирования в каждой
группе забивали по три мыши, в стерильных условиях извлекали легкие. После ма-
нипуляций, описанных в [2], супернатант отбирали для определения бактериальной
плотности и определения инфекционного титра вируса в культуре клеток MDCK в
96-луночных планшетах, как описано в [2]. Титр вируса определяли по 4 повторнос-
тям каждой пробы и выражали в lgТЦИД50/0,1 мл.
Для определения плотности бактерий из полученных образцов гомогенизи-
рованных легких готовили серийные разведения и осуществляли прямой высев на
чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтона для S.aureus и ГРМ-агар с добавлением 5%
лошадиной крови для S.pneumoniae. Учет КОЕ проводили после 18 часов инкубации
при температуре 370С (в 5,5% СО2 среде для S.pneumoniae). Количество выросших
колоний умножали на степень разведения и коэффициент, обратный количеству
посеянного материала.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
В первой серии экспериментов была изучена патогенность вирусов гриппа, да-
лее использованных для разработки экспериментальной модели вторичной бакте-
риальной пневмонии после гриппозной инфекции. Для проведения экспериментов
нами были использованы вирусы гриппа подтипа H1N1: адаптированный к мышам
пандемический, А/Калифорния/04/2009 МА, лабораторный штамм вируса гриппа
А/Пуэрто Рико /8/34, известного своей вирулентностью для мышей, и их реассор-
танта NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009 X А/Пуэрто Рико /8/34 (2:6), содер-
жащий поверхностные белки НА и NA от А/Калифорния/04/2009, а внутренние
белки от А/Пуэрто Рико /8/34. В предварительных опытах были определены для
каждого вируса летальные дозы на мышах (МЛД50) и выражены в ТЦИД50. Изучение
патогенности вирусов у мышей проводили при заражении мышей 5 МЛД50 вирусов
А/Калифорния/04/2009МА, А/Пуэрто Рико /8/34, NIBRG-121xp или аллантоисным
вирусом А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009). На 5 день после инфицирова-
ния у животных получали легкие и определяли в них титр вируса в культуре клеток
MDCK, а также фиксировали потерю веса в каждой группе мышей.
Проведенные нами исследования показали, что инфицирование вирусом
А/Пуэрто Рико /8/34 приводило к смертности мышей, значительной потере веса
(22%) и вирусной репродукции в легких животных. Пандемический вирус гриппа
А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009) без предварительной адаптации к мы-
шам не обладал летальной активностью, что коррелировало с его низкой репро-
дукцией в легких, однако проведенная нами адаптация этого вируса путем 5 пас-
сажей через легкие мышей привела к получению патогенного варианта, инфици-
рование которым вызывало смертность животных, потерю ими веса (23%), а также
репродукцию вируса в легких. В результате была создана модельная пара вирусов
А/Калифорния/04/2009МА и А/Пуэрто Рико /8/34, достоверно не отличающихся
по летальной и репродукционной активности у мышей. В качестве третьего модель-
ного вируса был использован реасортант NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009
XА/Пуэрто Рико /8/34 (2:6), содержащий поверхностные белки НА и NA от не
адаптированного к мышам вируса А/Калифорния/04/2009, а внутренние белки от
А/Пуэрто Рико /8/34. Несмотря на то, что реассортант вызывал смертность живот-
ных, он обладал меньшей патогенностью по сравнению с родительскими штаммами.
Для моделирования инфекции использовались сублетальные заражающие до-
зы (0,5 МЛД50) трех вирусов: А/Калифорния/04/2009МА, А/Пуэрто Рико /8/34 и
NIBRG-121xp. Живые культуры S. аureus вводили в одинаковых дозах для заражения.
Несмотря на признаки болезни, а также незначительную потерю веса, в группах мы-
шей, зараженных вирусами или бактериями отдельно, все животные остались живы
в течение всего периода наблюдения (табл. 1). Полная или частичная гибель наблю-
далась в группах, зараженных изученными штаммами S. aureus после инфицирова-
ния всеми вирусами, за исключением вакцинного штамма S. aureus №1986, который
вызывал гибель животных только при инфицировании их А/Калифорния/04/2009
МА. Процент смертности и потеря веса в группах зависели от штаммов обоих пато-
генов. Полная гибель животных с наибольщей потерей веса наблюдалась в группе,
инфицированной А/Пуэрто Рико /8/34 с последующим заражением S.aureus №884,
при индуцировании бактериальной пневмонии S.aureus №329 смертность была
ниже. При заражении NIBRG-121xp с последующим инфицированием S.aureus №
329 или S.aureus № 884 смертность животных и потеря веса были ниже по сравне-
нию с аналогичными группами, зараженными А/Пуэрто Рико /8/34, но при этом,
как и в случае с А/Пуэрто Рико /8/34, наибольшая смертность (75%) наблюдалась
при последовательном заражении вирусом и S.aureus №884. При последовательном
заражении вакцинным штаммом S. aureus №1986 после инфицирования вирусами
NIBRG-121xp или А/Пуэрто Рико /8/34, несмотря на фиксируемое снижение веса,
все животные оставались живы. Определение титра вируса и плотности бактерий в
легких животных выявило, что эти показатели при заражении каждым из патогеном
отдельно во всех случаях были достоверно ниже, чем при комбинированном зара-
жении (табл.1). Однако при использовании для индуцирования вторичной пневмо-
нии вакцинного штамма S. aureus № 1986 титр вируса и плотность бактерий были
значительно выше при заражении вирусом А/Калифорния/04/2009 МА, чем при
заражении NIBRG-121xp или А/Пуэрто Рико /8/34, что соответствовало данным
по смертности животных. Кроме того, плотность бактерий при заражении S. аureus
№884 была выше, чем в аналогичных группах животных, инфицированных S. аureus
№329, что также коррелировало с данными по смертности мышей.
Для индуцирования вторичной бактериальной пневмонии использовали S. рneumoniae
и сублетальные дозы вирусов гриппа (0,5МЛД50) А/Калифорния/04/2009
МА, А/Пуэрто Рико /8/34 и NIBRG-121xp, заражение каждым из которых по отде-
льности вызывало заболевание у мышей, но не приводило к смертельным исходам.
Введение отдельно живых культур S. рneumoniae в двух дозах (12,5х106 и 25х106 КОЕ/
мл) вызывало гибель 20 и 40% животных соответственно (табл. 2). Последовательное
заражение S. рneumoniae в обоих дозах после гриппозной инфекции вирусами
А/Калифорния/04/2009 МА или А/Пуэрто Рико /8/34, сходными по своей пато-
генности, вызывало полную гибель мышей. При заражении менее патогенным
NIBRG-121xp полная гибель животных наблюдалась при последующем зараже-
нии S. рneumoniae, в дозе 25х106 КОЕ/мл, снижение дозы заражения S. рneumoniae
до 12,5х106 КОЕ/мл приводило к снижению гибели и выживанию 25% мышей.
Изучение легких мышей выявило, что для всех трех вирусов титр при заражении
ими отдельно был достоверно на 2-3 lgТЦИД50 ниже, чем при комбинированном за-
ражении. Несмотря на гибель животных во всех группах, зараженных S. рneumoniae
после гриппозной инфекции, размножение вируса в легких животных, инфициро-
ванных А/Калифорния/04/2009МА, было значительно выше, чем в аналогичных
группах, зараженных А/Пуэрто Рико /8/34 и NIBRG-121xp. Плотность бактерий в
высеве из легких при комбинированном заражении была примерно в 100 раз выше,
чем при отдельном заражении обеими дозами S. рneumoniae (табл. 2).
Совокупность полученных данных в разработанной модели вторичной бак-
териальной пневмонии, индуцированной различными штаммами S. аureus и
S. рneumoniae после гриппозной инфекции, позволяет выявить ряд различий в
протекании и исходе пневмоний, вызванных как отдельно вирусами гриппа или
бактериями, так и их сочетанием. В задачу исследования входило использование
в качестве триггеров бактериальной инфекции вирусов гриппа H1N1, сопостави-
мых по параметрам патогенности для мышей. С этой целью нами были выбраны
классический лабораторный штамм А/Пуэрто Рико /8/34 (H1N1) и адаптирован-
ный к мышам штамм А/Калифорния/04/2009 МА (пндмH1N1 2009). Исходный
изолят пандемического вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (пндмH1N1 2009)
не обладал летальной активностью у мышей. Однако, после пассажей через легкие
мышей вирус приобрел патогенные свойства, схожие с вирусом А/Пуэрто Рико
/8/34 (H1N1), что, вероятно, объясняется приобретением им при пассировании
мутации D222G в НА, которая обнаруживается в большинстве адаптированных к
мышам вирусам А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009) [1] и ассоциирована с
тяжелыми и смертельными исходами от пневмоний после пандемического гриппа
у людей [4]. Реассортант NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009 X А/Пуэрто Рико
/8/34), содержащий поверхностные белки НА и NA от не адаптированной к мы-
шам А/Калифорния/04/2009, а внутренние белки от А/Пуэрто Рико /8/34, обладал
несколько меньшей патогенностью по сравнению с А/Калифорния/04/2009 МА и
А/Пуэрто Рико /8/34, что, возможно, связано с наличием у него НА от неадаптиро-
ванного вируса А/Калифорния/04/2009(пндм H1N1 2009). При моделировании вто-
ричной бактериальной пневмонии, индуцированной S.aureus №329, S.aureus №884
и S. рneumoniae после гриппозной инфекции, наблюдалось увеличение смертности
мышей по сравнению с инфекцией, вызванной каждым из патогенов в отдельности,
что ассоциировалось с увеличением титра вируса и плотности бактерий в легких.
Исключением явился наименее патогенный для мышей вакцинный штамм S. aureus
№1986, который не вызывал смертности при инфицировании животных вирусами
А/Пуэрто Рико /8/34 и NIBRG-121xp, но приводил к их гибели при инфицировании
не отличающимся от них по патогенности вирусом А/Калифорния/04/2009МА. Кроме
того, у животных, зараженных S. рneumoniae после инфекции их А/Калифорния/04/
2009МА, размножение вируса в легких было значительно выше, чем в аналогичных
группах, зараженных А/Пуэрто Рико /8/34 и NIBRG-121xp. Данный факт позволя-
ет предположить, что пандемический штамм А/Калифорния/04/2009МА обладает
более сильными факторами патогенности, повреждающими антибактериальную ак-
тивность системы врожденного иммунитета, чем вирус А/Пуэрто Рико /8/34. Одним
из таких факторов может являться минорный белок PB1-F2, обладающий про-апоп-
тотической функцией в отношении фагоцитирующих лейкоцитов и способностью
провоцировать вторичные бактериальные осложнения [5, 6, 10], первичная структура
белка которого отличается у взятых в эксперимент лабораторного и пандемического
штаммов [6]. Данная гипотеза требует дальнейшего изучения, предусматривающего
использование в модели вторичной постгриппозной пневмонии рекомбинантных
вирусов с различными модификациями белка PB1- F2. Разработанная нами модель
постгриппозной пневмонии с использованием вирусов и бактериальных штаммов
с различными свойствами является инструментом для дальнейших исследований в
области определения факторов патогенности вируса гриппа, а также для создания
нового поколения гриппозных вакцин, способных нивелировать повреждающую
функцию факторов патогенности за счет индукции к ним иммунного ответа.
×
About the authors
I. A. Leneva
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation
A. Yu. Egorov
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera,Smorodintsev Research Institute of Influenza
Email: fake@neicon.ru
Moscow
St. Petersburg
Russian FederationI. N. Falynskova
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation
N. R. Маkhmudоvа
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation
N. P. Kartashova
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation
E. A. Glubokova
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation
N. O. Vartanova
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation
A. V. Poddubikov
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation
References
- Краснослободцев К.Г., Львов Д.К., Альховский С.В., Бурцева Е.И., Федякина И.Т., Колобухина Л.В., Кириллова Е.С., Трушакова С.В., Оскерко Т.А., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. Полиморфизм аминокислот в позиции 222 рецепторосвязывающего сайта гемагглютинина вируса гриппа A (H1N1)pdm09 у пациентов с летальной вирусной пневмонией 2012-2014 гг. Вопросы вирусологии. 2016, 61(4): 166-171.
- Ленева И.А., Леонова Е.И., Махмудова Н. Р., Фалынскова И.Н., Федякина И.Т., Зверев В.В., Михайлова Н. А. Разработка экспериментальной модели сочетанной вирусно-бактериальной пневмонии. Вопросы вирусологии. 2015, 60(5): 27-31.
- Centers for Disease Control and Prevention. Bacterial coinfections in lung tissue specimens from fatal cases of 2009 pandemic influenza A (H1N1). United States, May-August 2009. MMWR 2009, 58:1-4.
- Goka А. Mutations associated with severity of the pandemic influenza A(H1N1)pdm09 in humans: a systematic review and meta-analysis of epidemiological evidence. Archives of Virology. 2014, 159(12):3167-3183.
- Iverson A.R, Boyd K.L, McAuley J.L. et al. A. Influenza virus primes mice for pneumonia from Staphylococcus aureus. J. Infect. Dis. 2011, 203(6):880-888.
- Kamal R.P., Alymova I.V., York I.A. Evolution and Virulence of Influenza A Virus Protein PB1-F2. Int. J. Mol. Sci. 2017, 29 ;19(1).
- Lee M.H., Arrecubieta C., Martin F.J. et al. A postinfluenza model of Staphylococcus aureus pneumonia. J. Infect. Dis. 2010, 201(4):508-515.
- Legand A., Briand S., Shindo N. et al. Addressing the public health burden of respiratory viruses: the Battle against Respiratory Viruses (BRaVe) Initiative. Future Virology. 2013, 8(10): 953-968.
- McCullers J.A. Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus. Clin. Microbiol. Rev. 2006, 19(3):571-582.
- McAuley J.L., Hornung F., Boyd, K.L. et al. J.A. Expression of the 1918 influenza a virus PB1-F2 enhances the pathogenesis of viral and secondary bacterial pneumonia. Cell. Host. Microbe. 2007, 2:240-249.
- McCullers J.A., Rehg J.E. Lethal synergism between influenza virus and Streptococcus рneumoniae: characterization of a mouse model and the role of platelet-activating factor receptor. J. Infect. Dis. 2002, 186(3):341-350.
- Morens D.M., Taubenberger J.K., Fauci A.S. Predominant role of bacterial pneumonia as a cause of death in pandemic influenza: implications for pandemic influenza preparedness. J. Infect. Dis. 2008, 198 (7):962-970.
- Murray R.J., Robinson J.O., White J.N. et al. Community-acquired pneumonia due to pandemic A(H1N1)2009 influenza virus and methicillin resistant Staphylococcus aureus co-infection. PLoS One. 2010, 5(1):e8705.
- Potter C.W. Chronicle of influenza pandemics. In: Nicholson K.G., Webster R.G., Hay A.J. (eds). Textbook of Influenza. London: Blackwell Scientific Publications, 1998:3-18.
- Shindo N. Making progress on the WHO Public Health Research Agenda for Influenza. Influenza Other Respi. Viruses. 2013, 7(2):1-3.
Supplementary files
