Отправить статью по E-mail ИНДУКЦИЯ ВТОРИЧНОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ У МЫШЕЙ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ПАНДЕМИЧЕСКИМ И ЛАБОРАТОРНЫМ ШТАММАМИ ВИРУСА ГРИППА H1N1
- Авторы: Ленева И.А.1, Егоров А.Ю.2, Фалынскова И.Н.1, Махмудова Н.Р.1, Карташова Н.П.1, Глубокова Е.А.1, Вартанова Н.О.1, Поддубиков А.В.1
-
Учреждения:
- НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
- НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, НИИ гриппа им. А.А.Смородинцева
- Выпуск: Том 96, № 1 (2019)
- Страницы: 68-74
- Раздел: Статьи
- Дата подачи: 22.08.2019
- Дата принятия к публикации: 22.08.2019
- Дата публикации: 23.04.2019
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/384
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-68-74
- ID: 384
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель. Разработка и характеристика экспериментальной модели вторичной бактериальной пневмонии, вызываемой S. pneumoniae и различными штаммами S. aureus после гриппозной инфекции, индуцированной пандемическим и лабораторным штаммами под-типа Н1N1, а также их реассортантом. Материалы и методы. Мышей линии BALB/с инфицировали вирусами гриппа пандемическим и адаптированным к мышам А/Калифорния/04/2009, А/Пуэрто Рико /8/34 и их реассортантом NIBRG-121xp с последующим заражением различными штаммами. Патогенез инфекций оценивали по выживаемости и снижению массы животных, титру вируса и плотности бактерий в легких. Результаты. Показано, что заражение мышей тремя штаммами вируса гриппа H1N1 с сопоставимым уровнем патогенности приводит к различной степени тяжести вторичной бактериальной инфекции. При этом наибольшей способностью к нарушению антибактериального иммунитета обладал адаптированный к мышам пандемический вирус А/Калифорния/04/2009. Заключение. Разработана экспериментальная модель постгриппозной бактериальной пневмонии, индуцированной тремя штаммами вируса гриппа H1N1 и различными штаммами S. aureus или S. pneumoniae. Охарактеризована способность вирусов провоцировать бактериальную суперинфекцию различной степени тяжести.
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕБольшая часть смертельных исходов от гриппа обусловлена вторичными бак-
териальными осложнениями, среди которых ведущую роль занимают пневмонии.
Показано, что распространенность пневмоний значительно увеличивается после
эпидемий гриппа, достоверное увеличение смертности в результате пневмоний
фиксировалось во время пандемий 1918, 1957, 1968 и 2009 гг. [3, 8, 12, 14]. Во время
последней пандемии, вызванной вирусом гриппа А H1N1в 2009 г., 25-56% тяжелых
форм заболеваний и смертельных исходов были ассоциированы со вторичной пнев-
монией, из них 14-46% привели к смертельным исходам [3, 8]. Вторичная инфекция
S. pneumoniae наиболее часто коррелировала с тяжестью заболевания [13]. В то же
время , в исследовании 838 критически больных детей в США показано, что в тече-
ние 72 ч после госпитализации в отделение интенсивной терапии у 33% детей раз-
вивалась бактериальная суперинфекция, причем в 26% случаев в качестве этиологи-
ческого агента были выявлены Staphylococcus aureus , из которых 48% относились к
метициллинрезистентным штаммам (MRSA) [13].
Несмотря на широкое внедрение сезонных гриппозных вакцин, противовирус-
ных препаратов и антибиотиков, проблема бактериальных осложнений при гриппе
не перестала быть актуальной, более того, развитие резистентности бактериальной
флоры к современным антибиотикам может обострить данную проблему при возник-
новении новой пандемии гриппа. В настоящее время ВОЗ ставит задачу снижения
пневмоний после гриппозной инфекций как одну их первоочередных, что отражено
в целом ряде документов, включая «Программу исследований ВОЗ по гриппу с по-
зиции общественного здравоохранения» [8, 15], в которых подчеркивается важность
проведения клинических и научных исследований, направленных на выявление про-
гностических маркеров тяжести пневмоний после гриппозной инфекции как приори-
тетного направления, которое заслуживает немедленного внимания. Моделирование у
мышей пневмонии инфицированием их вирусом гриппа А с последующим заражением
S. pneumoniae и S. aureus проведено в нескольких ведущих лабораториях мира и опуб-
ликовано в статьях[5, 7, 9, 11]. Ранее нами также была разработана и охарактеризована
мышиная модель вирусно-бактериальной пневмонии, индуцированной последова-
тельным заражением вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009) и
S. aureus, в которой был выявлен летальный синергизм между патогенами, отмечае-
мый в эпидемиологических наблюдениях [2]. Вирус гриппа вносит ведущий вклад в
возникновение летального синергизма при сочетанном заражении двумя патогенами.
В связи с этим, выявление корреляции между патогенезом инфекции и биологичес-
кими свойствами вирусов гриппа является важнейшим подходом для определения
взаимодействия между вирусным и бактериальным агентами в патогенезе вторичной
бактериальной пневмонии после гриппозной инфекции. Кроме того, использование
вирусов различного происхождения может служить инструментом для выявления ро-
ли отдельных вирусных белков в патогенезе синергизма для определения его механиз-
ма с целью дальнейшей идентификации мишени для интервенции данной болезни.
Цель настоящей работы — разработка и характеристика экспериментальной
модели вторичной бактериальной пневмонии, вызываемой S. pneumoniae и различ-
ными штаммами S. aureus после гриппозной инфекции, индуцированной пандеми-
ческим и лабораторным штаммами подтипа Н1N1, а также их реассортантом.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
В опытах использовали клетки MDCK, полученные из коллекции НИИ виру-
сологии. Для моделирования гриппозной инфекции были использованы штамм
вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009), полученный из ВОЗ,
а также лабораторный штамм вируса гриппа А/Пуэрто Рико /8/34(H1N1) и реас-
сортант NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009)XА/Пуэрто Рико
/8/34(H1N1) (2:6), полученные из музея НИИ гриппа. Вирус А/Калифорния/04/
2009 (пндм H1N1) адаптировали к мышам путем 5 последовательных пассажей через
легкие. Для инфицирования животных вирусы выращивали в аллантоисной полости
9-дневных куриных эмбрионов. Культуры штаммов S. pneumoniae №3405, вакцин-
ный штамм S.aureus №1986, S.aureus №329, S.aureus №884 получены из коллекции
НИИВС им. И.И.Мечникова в лиофилизированном состоянии. Для восстановления
жизнеспособности культуры в ампулу добавляли 0,5 мл питательного бульона ГРМ-
бульон для S.aureus и сердечно-мозговой бульон (Mast Group Ltd, Великобритания).
Суспензию переносили в пробирку с 2 мл соответствующего бульона и инкуби-
ровали 4 ч при температуре 37°С. Затем осуществляли посев на питательный агар
Мюллера-Хинтона (HiMedia Laboratories, Индия) для S.aureus и ГРМ-агар с добав-
лением 5% лошадиной крови (ЗАО «ЭКОлаб») для S.pneumoniae. Чашки инкуби-
ровали в течение 18 ч при температуре 37°С (в 5,5% СО2 среде для S.pneumoniae).
В исследовании использовали второй пассаж бактерий после регенерации штамма.
Рабочие разведения бактериальной суспензии готовили с использованием денсито-
метра Densi-La-Meter («PLIVA-Lachema Diagnostika», Словакия). За 1х109 бактерий
в 1 мл объема принимали 0,8 ЕД мутности по McFarland.
Мышей (BALB/С, самки, массой 20-22 г) получали из питомника «Андреевка»
(Московская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных ус-
ловиях вивария. Мышей инфицировали интраназально под легким наркозом ука-
занными в каждом эксперименте дозами вирусов гриппа. Далее на 4 день после ви-
русного заражения мышей инфицировали повторно интраназально различными до-
зами S.pneumoniae и S.aureus (в объеме 0,05 мл). Клиническую тяжесть инфекции у
животных оценивали, учитывая смертность от инфекции и изменение веса, которое
рассчитывали, как описано [2]. В указанные дни после инфицирования в каждой
группе забивали по три мыши, в стерильных условиях извлекали легкие. После ма-
нипуляций, описанных в [2], супернатант отбирали для определения бактериальной
плотности и определения инфекционного титра вируса в культуре клеток MDCK в
96-луночных планшетах, как описано в [2]. Титр вируса определяли по 4 повторнос-
тям каждой пробы и выражали в lgТЦИД50/0,1 мл.
Для определения плотности бактерий из полученных образцов гомогенизи-
рованных легких готовили серийные разведения и осуществляли прямой высев на
чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтона для S.aureus и ГРМ-агар с добавлением 5%
лошадиной крови для S.pneumoniae. Учет КОЕ проводили после 18 часов инкубации
при температуре 370С (в 5,5% СО2 среде для S.pneumoniae). Количество выросших
колоний умножали на степень разведения и коэффициент, обратный количеству
посеянного материала.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
В первой серии экспериментов была изучена патогенность вирусов гриппа, да-
лее использованных для разработки экспериментальной модели вторичной бакте-
риальной пневмонии после гриппозной инфекции. Для проведения экспериментов
нами были использованы вирусы гриппа подтипа H1N1: адаптированный к мышам
пандемический, А/Калифорния/04/2009 МА, лабораторный штамм вируса гриппа
А/Пуэрто Рико /8/34, известного своей вирулентностью для мышей, и их реассор-
танта NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009 X А/Пуэрто Рико /8/34 (2:6), содер-
жащий поверхностные белки НА и NA от А/Калифорния/04/2009, а внутренние
белки от А/Пуэрто Рико /8/34. В предварительных опытах были определены для
каждого вируса летальные дозы на мышах (МЛД50) и выражены в ТЦИД50. Изучение
патогенности вирусов у мышей проводили при заражении мышей 5 МЛД50 вирусов
А/Калифорния/04/2009МА, А/Пуэрто Рико /8/34, NIBRG-121xp или аллантоисным
вирусом А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009). На 5 день после инфицирова-
ния у животных получали легкие и определяли в них титр вируса в культуре клеток
MDCK, а также фиксировали потерю веса в каждой группе мышей.
Проведенные нами исследования показали, что инфицирование вирусом
А/Пуэрто Рико /8/34 приводило к смертности мышей, значительной потере веса
(22%) и вирусной репродукции в легких животных. Пандемический вирус гриппа
А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009) без предварительной адаптации к мы-
шам не обладал летальной активностью, что коррелировало с его низкой репро-
дукцией в легких, однако проведенная нами адаптация этого вируса путем 5 пас-
сажей через легкие мышей привела к получению патогенного варианта, инфици-
рование которым вызывало смертность животных, потерю ими веса (23%), а также
репродукцию вируса в легких. В результате была создана модельная пара вирусов
А/Калифорния/04/2009МА и А/Пуэрто Рико /8/34, достоверно не отличающихся
по летальной и репродукционной активности у мышей. В качестве третьего модель-
ного вируса был использован реасортант NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009
XА/Пуэрто Рико /8/34 (2:6), содержащий поверхностные белки НА и NA от не
адаптированного к мышам вируса А/Калифорния/04/2009, а внутренние белки от
А/Пуэрто Рико /8/34. Несмотря на то, что реассортант вызывал смертность живот-
ных, он обладал меньшей патогенностью по сравнению с родительскими штаммами.
Для моделирования инфекции использовались сублетальные заражающие до-
зы (0,5 МЛД50) трех вирусов: А/Калифорния/04/2009МА, А/Пуэрто Рико /8/34 и
NIBRG-121xp. Живые культуры S. аureus вводили в одинаковых дозах для заражения.
Несмотря на признаки болезни, а также незначительную потерю веса, в группах мы-
шей, зараженных вирусами или бактериями отдельно, все животные остались живы
в течение всего периода наблюдения (табл. 1). Полная или частичная гибель наблю-
далась в группах, зараженных изученными штаммами S. aureus после инфицирова-
ния всеми вирусами, за исключением вакцинного штамма S. aureus №1986, который
вызывал гибель животных только при инфицировании их А/Калифорния/04/2009
МА. Процент смертности и потеря веса в группах зависели от штаммов обоих пато-
генов. Полная гибель животных с наибольщей потерей веса наблюдалась в группе,
инфицированной А/Пуэрто Рико /8/34 с последующим заражением S.aureus №884,
при индуцировании бактериальной пневмонии S.aureus №329 смертность была
ниже. При заражении NIBRG-121xp с последующим инфицированием S.aureus №
329 или S.aureus № 884 смертность животных и потеря веса были ниже по сравне-
нию с аналогичными группами, зараженными А/Пуэрто Рико /8/34, но при этом,
как и в случае с А/Пуэрто Рико /8/34, наибольшая смертность (75%) наблюдалась
при последовательном заражении вирусом и S.aureus №884. При последовательном
заражении вакцинным штаммом S. aureus №1986 после инфицирования вирусами
NIBRG-121xp или А/Пуэрто Рико /8/34, несмотря на фиксируемое снижение веса,
все животные оставались живы. Определение титра вируса и плотности бактерий в
легких животных выявило, что эти показатели при заражении каждым из патогеном
отдельно во всех случаях были достоверно ниже, чем при комбинированном зара-
жении (табл.1). Однако при использовании для индуцирования вторичной пневмо-
нии вакцинного штамма S. aureus № 1986 титр вируса и плотность бактерий были
значительно выше при заражении вирусом А/Калифорния/04/2009 МА, чем при
заражении NIBRG-121xp или А/Пуэрто Рико /8/34, что соответствовало данным
по смертности животных. Кроме того, плотность бактерий при заражении S. аureus
№884 была выше, чем в аналогичных группах животных, инфицированных S. аureus
№329, что также коррелировало с данными по смертности мышей.
Для индуцирования вторичной бактериальной пневмонии использовали S. рneumoniae
и сублетальные дозы вирусов гриппа (0,5МЛД50) А/Калифорния/04/2009
МА, А/Пуэрто Рико /8/34 и NIBRG-121xp, заражение каждым из которых по отде-
льности вызывало заболевание у мышей, но не приводило к смертельным исходам.
Введение отдельно живых культур S. рneumoniae в двух дозах (12,5х106 и 25х106 КОЕ/
мл) вызывало гибель 20 и 40% животных соответственно (табл. 2). Последовательное
заражение S. рneumoniae в обоих дозах после гриппозной инфекции вирусами
А/Калифорния/04/2009 МА или А/Пуэрто Рико /8/34, сходными по своей пато-
генности, вызывало полную гибель мышей. При заражении менее патогенным
NIBRG-121xp полная гибель животных наблюдалась при последующем зараже-
нии S. рneumoniae, в дозе 25х106 КОЕ/мл, снижение дозы заражения S. рneumoniae
до 12,5х106 КОЕ/мл приводило к снижению гибели и выживанию 25% мышей.
Изучение легких мышей выявило, что для всех трех вирусов титр при заражении
ими отдельно был достоверно на 2-3 lgТЦИД50 ниже, чем при комбинированном за-
ражении. Несмотря на гибель животных во всех группах, зараженных S. рneumoniae
после гриппозной инфекции, размножение вируса в легких животных, инфициро-
ванных А/Калифорния/04/2009МА, было значительно выше, чем в аналогичных
группах, зараженных А/Пуэрто Рико /8/34 и NIBRG-121xp. Плотность бактерий в
высеве из легких при комбинированном заражении была примерно в 100 раз выше,
чем при отдельном заражении обеими дозами S. рneumoniae (табл. 2).
Совокупность полученных данных в разработанной модели вторичной бак-
териальной пневмонии, индуцированной различными штаммами S. аureus и
S. рneumoniae после гриппозной инфекции, позволяет выявить ряд различий в
протекании и исходе пневмоний, вызванных как отдельно вирусами гриппа или
бактериями, так и их сочетанием. В задачу исследования входило использование
в качестве триггеров бактериальной инфекции вирусов гриппа H1N1, сопостави-
мых по параметрам патогенности для мышей. С этой целью нами были выбраны
классический лабораторный штамм А/Пуэрто Рико /8/34 (H1N1) и адаптирован-
ный к мышам штамм А/Калифорния/04/2009 МА (пндмH1N1 2009). Исходный
изолят пандемического вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (пндмH1N1 2009)
не обладал летальной активностью у мышей. Однако, после пассажей через легкие
мышей вирус приобрел патогенные свойства, схожие с вирусом А/Пуэрто Рико
/8/34 (H1N1), что, вероятно, объясняется приобретением им при пассировании
мутации D222G в НА, которая обнаруживается в большинстве адаптированных к
мышам вирусам А/Калифорния/04/2009 (пндм H1N1 2009) [1] и ассоциирована с
тяжелыми и смертельными исходами от пневмоний после пандемического гриппа
у людей [4]. Реассортант NIBRG-121xp (А/Калифорния/04/2009 X А/Пуэрто Рико
/8/34), содержащий поверхностные белки НА и NA от не адаптированной к мы-
шам А/Калифорния/04/2009, а внутренние белки от А/Пуэрто Рико /8/34, обладал
несколько меньшей патогенностью по сравнению с А/Калифорния/04/2009 МА и
А/Пуэрто Рико /8/34, что, возможно, связано с наличием у него НА от неадаптиро-
ванного вируса А/Калифорния/04/2009(пндм H1N1 2009). При моделировании вто-
ричной бактериальной пневмонии, индуцированной S.aureus №329, S.aureus №884
и S. рneumoniae после гриппозной инфекции, наблюдалось увеличение смертности
мышей по сравнению с инфекцией, вызванной каждым из патогенов в отдельности,
что ассоциировалось с увеличением титра вируса и плотности бактерий в легких.
Исключением явился наименее патогенный для мышей вакцинный штамм S. aureus
№1986, который не вызывал смертности при инфицировании животных вирусами
А/Пуэрто Рико /8/34 и NIBRG-121xp, но приводил к их гибели при инфицировании
не отличающимся от них по патогенности вирусом А/Калифорния/04/2009МА. Кроме
того, у животных, зараженных S. рneumoniae после инфекции их А/Калифорния/04/
2009МА, размножение вируса в легких было значительно выше, чем в аналогичных
группах, зараженных А/Пуэрто Рико /8/34 и NIBRG-121xp. Данный факт позволя-
ет предположить, что пандемический штамм А/Калифорния/04/2009МА обладает
более сильными факторами патогенности, повреждающими антибактериальную ак-
тивность системы врожденного иммунитета, чем вирус А/Пуэрто Рико /8/34. Одним
из таких факторов может являться минорный белок PB1-F2, обладающий про-апоп-
тотической функцией в отношении фагоцитирующих лейкоцитов и способностью
провоцировать вторичные бактериальные осложнения [5, 6, 10], первичная структура
белка которого отличается у взятых в эксперимент лабораторного и пандемического
штаммов [6]. Данная гипотеза требует дальнейшего изучения, предусматривающего
использование в модели вторичной постгриппозной пневмонии рекомбинантных
вирусов с различными модификациями белка PB1- F2. Разработанная нами модель
постгриппозной пневмонии с использованием вирусов и бактериальных штаммов
с различными свойствами является инструментом для дальнейших исследований в
области определения факторов патогенности вируса гриппа, а также для создания
нового поколения гриппозных вакцин, способных нивелировать повреждающую
функцию факторов патогенности за счет индукции к ним иммунного ответа.
×
Об авторах
И. А. Ленева
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
А. Ю. Егоров
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова,НИИ гриппа им. А.А.Смородинцева
Email: fake@neicon.ru
Москва
Санкт-Петербург
РоссияИ. Н. Фалынскова
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
Н. Р. Махмудова
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
Н. П. Карташова
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
Е. А. Глубокова
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
Н. О. Вартанова
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
А. В. Поддубиков
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
Список литературы
- Краснослободцев К.Г., Львов Д.К., Альховский С.В., Бурцева Е.И., Федякина И.Т., Колобухина Л.В., Кириллова Е.С., Трушакова С.В., Оскерко Т.А., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. Полиморфизм аминокислот в позиции 222 рецепторосвязывающего сайта гемагглютинина вируса гриппа A (H1N1)pdm09 у пациентов с летальной вирусной пневмонией 2012-2014 гг. Вопросы вирусологии. 2016, 61(4): 166-171.
- Ленева И.А., Леонова Е.И., Махмудова Н. Р., Фалынскова И.Н., Федякина И.Т., Зверев В.В., Михайлова Н. А. Разработка экспериментальной модели сочетанной вирусно-бактериальной пневмонии. Вопросы вирусологии. 2015, 60(5): 27-31.
- Centers for Disease Control and Prevention. Bacterial coinfections in lung tissue specimens from fatal cases of 2009 pandemic influenza A (H1N1). United States, May-August 2009. MMWR 2009, 58:1-4.
- Goka А. Mutations associated with severity of the pandemic influenza A(H1N1)pdm09 in humans: a systematic review and meta-analysis of epidemiological evidence. Archives of Virology. 2014, 159(12):3167-3183.
- Iverson A.R, Boyd K.L, McAuley J.L. et al. A. Influenza virus primes mice for pneumonia from Staphylococcus aureus. J. Infect. Dis. 2011, 203(6):880-888.
- Kamal R.P., Alymova I.V., York I.A. Evolution and Virulence of Influenza A Virus Protein PB1-F2. Int. J. Mol. Sci. 2017, 29 ;19(1).
- Lee M.H., Arrecubieta C., Martin F.J. et al. A postinfluenza model of Staphylococcus aureus pneumonia. J. Infect. Dis. 2010, 201(4):508-515.
- Legand A., Briand S., Shindo N. et al. Addressing the public health burden of respiratory viruses: the Battle against Respiratory Viruses (BRaVe) Initiative. Future Virology. 2013, 8(10): 953-968.
- McCullers J.A. Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus. Clin. Microbiol. Rev. 2006, 19(3):571-582.
- McAuley J.L., Hornung F., Boyd, K.L. et al. J.A. Expression of the 1918 influenza a virus PB1-F2 enhances the pathogenesis of viral and secondary bacterial pneumonia. Cell. Host. Microbe. 2007, 2:240-249.
- McCullers J.A., Rehg J.E. Lethal synergism between influenza virus and Streptococcus рneumoniae: characterization of a mouse model and the role of platelet-activating factor receptor. J. Infect. Dis. 2002, 186(3):341-350.
- Morens D.M., Taubenberger J.K., Fauci A.S. Predominant role of bacterial pneumonia as a cause of death in pandemic influenza: implications for pandemic influenza preparedness. J. Infect. Dis. 2008, 198 (7):962-970.
- Murray R.J., Robinson J.O., White J.N. et al. Community-acquired pneumonia due to pandemic A(H1N1)2009 influenza virus and methicillin resistant Staphylococcus aureus co-infection. PLoS One. 2010, 5(1):e8705.
- Potter C.W. Chronicle of influenza pandemics. In: Nicholson K.G., Webster R.G., Hay A.J. (eds). Textbook of Influenza. London: Blackwell Scientific Publications, 1998:3-18.
- Shindo N. Making progress on the WHO Public Health Research Agenda for Influenza. Influenza Other Respi. Viruses. 2013, 7(2):1-3.
Дополнительные файлы
