Email this article ANTIVIRAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE COMPOSITION OF COMPOUNDS BASED ON ECHINOCHROME A
- Authors: Krylova N.V.1, Fedoreev S.A.2, Lavrov V.F.3, Mischenko N.P.2, Vasileva E.A.2, Svitich O.A.3, Ebralidze L.K.3, Еunihina O.V.1, Leonova G.N.1
-
Affiliations:
- Somov Institute of Epidemiology and Microbiology
- Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry
- Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
- Issue: Vol 96, No 1 (2019)
- Pages: 53-58
- Section: Articles
- Submitted: 22.08.2019
- Accepted: 22.08.2019
- Published: 23.04.2019
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/381
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-53-58
- ID: 381
Cite item
Full Text
Abstract
The aim of this study was to examine in vitro the antioxidant and antiviral activity of echinochrome A and echinochrome-based antioxidant composition against tick-borne encephalitis virus (TBEV) and herpes simplex virus type 1 (HSV-1). Materials and methods. TBEV (Dal’negorsk strain, Far Eastern subtype) grown in PK cells, and HSV-1 (VR3 strain) in Vero cells. The antioxidant activity of the compounds was determined using the linetol peroxide oxidation model. The cytotoxicity and antiviral activity of the compounds were assessed by cell viability (PK- and Vero cells) and by cytopathic effect inhibition of viruses (TBEV and HSV-1) using the MTT test. Results. The antioxidant composition, which is a mixture of echinochrome A, ascorbic acid and α-tocopherol (5: 5: 1), showed a higher antioxidant and antiviral efficacy than echinochrome A. The antiviral mechanisms on of echinochrome A and antioxidant composition are caused by direct inactivation of TBEV and HSV-1 viruses and inhibition of virus penetration into cells. Conclusion. The results obtained allow considering the echinochrome A and the composition of antioxidants on its basis as the promising agents of a broad-spectrum antiviral activity.
Full Text
ВВЕДЕНИЕОкислительный стресс, индуцированный нейротропными вирусами, играет
важную роль в патогенезе вирусных инфекций. Ткани ЦНС отличаются высоким
содержанием липидов, в связи с чем, они особенно чувствительны к перекисному
окислению [17]. Активация процессов свободно-радикального окисления и резкое
угнетение антиокдсидантной и антирадикальной систем защиты организма наблю-
дается у больных клещевым энцефалитом [4] и при манифестации герпетической ин-
фекции [15, 16]. Известно, что антиоксиданты препятствуют разрушительному вли-
янию активных форм кислорода, в том числе, негативному воздействию свободных
радикалов, следовательно, предотвращают развитие заболеваний, связанных с окис-
лительным стрессом и, вероятно, могут оказывать терапевтический эффект [5, 11].
Поскольку наиболее важным аспектом в лечении вирусных инфекций является
подавление репликации вируса, то поиск среди природных антиоксидантов хими-
ческих соединений, обладающих противовирусными свойствами, весьма актуален,
а применение препаратов с противовирусной и антиоксидантной активностью яв-
ляется приоритетной задачей в борьбе с вирусной патологией. Одним из перспек-
тивных природных антиоксидантов, который, вероятно, может обладать и противо-
вирусными свойствами, является эхинохром А (хиноидный пигмент морских ежей),
хорошо зарекомендовавший себя в комплексной терапии сетчатки и роговицы глаз,
а также в кардиологической практике [2, 3].
Целью настоящего исследования было изучение антиоксидантной и противо-
вирусной активности эхинохрома А, а также композиции антиоксидантов на модели
вирусной инфекции, вызываемой вирусами клещевого энцефалита и простого гер-
песа 1 типа in vitro.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Были использованы два вируса: клещевого энцефалита (ВКЭ) и простого герпе-
са 1 типа (ВПГ-1). ВКЭ (штамм Dal’negorsk, дальневосточного субтипа) выделен в
1973 году из мозга умершего больного с очаговой формой заболевания (номер пол-
ногеномной последовательности в GenBank — FJ402886) [13]. Титр ВКЭ составил
108,8 TCID50/мл. Противовирусную активность препаратов в отношении ВКЭ ис-
следовали на перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), вы-
ращенных в среде 199 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров и 100 ЕД/мл
гентамицина при 37°С в атмосфере 5% СО2. ВПГ-1 (штамм VR3) получен из
Национальной коллекции вирусов США (Rockville, Maryland, USA). Титр ВПГ-1
составил 108,25 TCID50/мл. Противовирусную активность препаратов в отношении
ВПГ-1 изучали, используя перевиваемую культуру клеток Vero, выращенных в пол-
ной культуральной среде DMEM с добавлением 5-10% сыворотки эмбрионов коров,
0,008% раствора гентамицина сульфата и глутамина при 37°С, в атмосфере 5% СО2.
Концентрация клеток во всех экспериментах составляла 104 кл/мл.
Исследовали эхинохром А (2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-этил-1,4-нафтохинон),
композицию антиоксидантов — эхинохром А (Эх), аскорбиновая кислота и α-то-
коферол в массовом соотношении 5:5:1, установленным в процессе проведения
исследований. Плацебо — композиция, содержащая аскорбиновую кислоту и α-то-
коферол в массовом соотношении 5:1. Тестируемые препараты растворяли в диме-
тилсульфоксиде (DMSO, Sigma, USA) и хранили при —20°C. Рабочие растворы го-
товили из стоковых растворов (10 мг/мл), разводя соответствующей культуральной
средой. Конечная концентрация DMSO в рабочих растворах составляла 0,5%.
Антиоксидантная активность определялась на модели перекисного окисления
линетола, содержащего сложную смесь этиловых эфиров полиненасыщенных жир-
ных кислот (олеиновой, линолевой и линоленовой) льняного масла при 37° С [1].
Стоковые растворы эхинохрома, аскорбиновой кислоты и α-токоферола готовили
в концентрации 10 мг/мл этилового спирта. Бинарные и тройные композиции ан-
тиоксидантов получали, смешивая объемы стоковых растворов в указанных соот-
ношениях, добавляли линетол и помещали в термостат при 37°С. Концентрация
антиоксидантонв в линетоле составляла 0,05 мг/мл или 0,005%, 2 раза в сутки массу
предварительно охлажденных до 18-200C реакционных смесей измеряли. По мере
увеличения массы на 10 мг реакцию останавливали. Период ингибирования окисле-
ния линетола (Δτ) определяли с учетом разности времени, за которое масса линето-
ла увеличивалась на 10 мг по формуле: Δτ = τ – τ0, где τ — время начала окисления
линетола в присутствии антиоксиданта (ч); τ0 — время начала окисления линетола
без антиоксиданта (ч).
Цитотоксическую активность оценивали с учетом жизнеспособности клеток в
МТТ-тесте [12]. На 24-часовой монослой клеток, выращенных в 96-луночных плос-
кодонных полистироловых планшетах (СПЭВ для ВКЭ и Vero для ВПГ-1, 2х104 кл./
лунку), наносили тестируемые вещества и культивировали при 37°С в атмосфере 5%
CO2 в течение 6 суток. Затем в культуру на 60 минут добавляли 5 мг/мл МТТ (ме-
тилтиазолилтетразолия бромид, Sigma, USA) и после этого изопропиловый спирт.
Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре при длине волны 540
нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле: (ОПо)/(ОПк)×100%, где
ОПо — оптическая плотность клеточной суспензии, обработанной тестируемыми
препаратами, ОПк — оптическая плотность необработанной клеточной суспензии;
50% цитотоксическую концентрацию препаратов (СС50) устанавливали с учетом
концентрации вещества, снижающего количество жизнеспособных клеток на 50%
по сравнению с контролем, используя метод регрессионного анализа.
Противовирусная активность оценивалась визуально по степени подавления
цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов в культуре клеток с помощью инвер-
тированного микроскопа (Биолам П-1, ЛОМО, РФ), а также в МТТ-тесте [10, 14].
Концентрации препаратов составляли от 0 до 400 мкг/мл, инфицирующая доза ВКЭ
и ВПГ-1 — 102 TCID50/мл. Вирусы и препараты наносили на монослой клеток СПЭВ
или Vero одновременно и инкубировали в течение 6 суток при 37°С в атмосфере 5%
CO2. Оценка противовирусной активности осуществлялась с учетом степени подав-
ления (IR) цитопатогенного действия вирусов тем или иным препаратом, в част-
ности, по 50% ингибирующей концентрации (IC50) и селективному индексу (SI).
IR рассчитывали по формуле: IR = (ОП опыт — ОП вир. контроль)/(ОП кл. конт-
роль — ОП вир. контроль) × 100%. IC50 устанавливали с помощью регрессионного
анализа, SI рассчитывали, как отношение CC50 к IC50. Во всех схемах тестирования
противовирусного действия исследуемых соединений их концентрация составляла
20 мкг/мл. При этом инфицирующая доза ВКЭ и ВПГ-1 была равна 102 TCID50/мл.
Противовирусную активность соединений определяли с учетом степени подавления
(IR) ими цитопатогенного действия вирусов в МТТ-тесте.
Схемы определения противовирусной активности препаратов: (1) определение
вирулицидной активности — вируссодержащую жидкость смешивали с препаратом
в соотношении 1:1, инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Затем смесь нано-
сили на монослой клеток и инкубировали в течение 6 суток при 37°С в атмосфере
5% СО2. (2) определение профилактической активности: монослой клеток обраба-
тывали одним из исследуемых препаратов в течение 60 минут при 37°С. Затем клет-
ки инфицировали одним из вирусов (ВКЭ или ВПГ-1) и инкубировали в течение 6
суток при 37°С в атмосфере 5% СО2. (3) определение вирусингибирующей активнос-
ти: монослой клеток инфицировали вирусом в течение 60 минут при t 37° С. Затем
к клеткам добавляли исследуемый препарат и в течение 6 суток инкубировали при
37°С в атмосфере 5% СО2. Представленные схемы определения противовирусной
активности были детально отработаны в ранее описанных экспериментах [6 — 8].
Статистическую обработку данных проводили, используя пакет программ
Statistica 10.0. Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение.
Сравнение различий между показателями контрольной и опытной групп осущест-
вляли с использованием критерия Вилкоксона для связанных выборок. Различия
считались достоверными при p≤0,05.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
Определение антиоксидантной активности препаратов на модели перекисного
окисления линетола позволило провести сравнительный анализ антиоксидантных
свойств эхинохрома А, α-токоферола и аскорбиновой кислоты, а также найти оп-
тимальное соотношение в композиции этих компонентов при реализации антиок-
сидантных и прооксидантных свойств. Установлено, что из всех антиоксидантов на-
иболее активным оказался α-токоферол (Δτ 125 ч), эхинохром А был менее активен
(Δτ 100 ч), а аскорбиновая кислота в этих условиях (без α-токоферола) не обладает
антиоксидантной активностью, что подтвердилось результатами опытов (Δτ для сме-
си Аск+Ток в соотношении 2:1 составляло 195 ч). Наиболее выраженный антиокис-
лительный эффект в отношении линетола продемонстрировала смесь (Эх+Аск+Ток)
в соотношении 5:5:1. При этом был показан выраженный синергизм действия ком-
понентов композиции (Δτ 223 ч) и их высокая стабильность в течение 12 месяцев.
С помощью МТТ-анализа были рассчитаны 50% цитотоксические концентра-
ции (CC50) исследуемых соединений в культурах клеток СПЭВ и Vero и селектив-
ные индексы (SI), характеризующие их противовирусную активность (табл.). При
этом установлено, что плацебо обладает незначительной цитотоксической актив-
ностью, по сравнению с эхинохром А и композицией антиоксидантов (p≤0,05).
Одновременная обработка клеток СПЭВ исследуемыми соединениями в концентра-
циях от 0 до 400 мкг/мл и ВКЭ (102TCID50/мл) демонстрировала умеренную проти-
вовирусною активность эхинохрома А и композиции антиоксидантов. Вместе с тем,
композиция обладает способностью подавлять ЦПД ВКЭ при существенно более
низких IC50-концентрациях и более высоких показателях SI, чем один эхинохром А
(p≤0,05). Заражение клеток Vero ВПГ-1 с одновременной обработкой тестируемы-
ми препаратами показало, что селективный индекс композиции (эффективность
действия) был достоверно выше соответствующего показателя для эхинохрома А и
плацебо (p≤0,05) (табл.).
Особенности влияния препаратов на разные стадии жизненного цикла ВКЭ и
ВПГ-1, в том числе: а) стадию адсорбции вируса на клетках (профилактическое дейс-
твие); б) стадию репликации вируса (вирусингибирующее действие); в) непосредс-
твенное влияние на вирус (вирулицидное действие) были определены с помощью
МТТ-анализа. Установлено, что наиболее выраженный вирулицидный эффект на-
блюдался после непосредственной обработки вируса соответствующим соединени-
ем перед заражением культуры клеток. При этом степень подавления (IR) эхинохро-
мом А и композицией антиоксидантов цитопатогенного действия ВКЭ составляла,
соответственно, 75±4% и 89±5%, а IR ВПГ-1 ~ 100% (IR плацебо ~ 30%). Обработка
клеток СПЭВ и Vero исследуемыми препаратами перед их заражением вирусами
(профилактическое действие) оказалась мало эффективной. После обработки кле-
ток композицией антиоксидантов (35±3%) и плацебо (24±3%) вирусингибирующая
активность препаратов имела значимые различия (p<0,05) лишь в опытах с ВПГ-1.
Вирусингибирующую активность на ранней стадии репликации вируса (через 60
минут после заражения) показали как эхинохром А, так и композиция антиоксидан-
тов. Она составила 21±2% и 36±3% при ВКЭ-инфекции и, соответственно, 28±3%
и 43±4% при герпетической инфекции (у плацебо ~10%, p<0,05). Следует отметить,
что степень подавления репликации вирусов композицией антиоксидантов была,
как правило, выше таковой, опосредованной лишь одним эхинохромом А (p<0,05).
Ранее была выявлена способность эхинохрома А преодолевать гематоэнцефали-
ческий барьер [6], что стало предпосылкой для изучения противовирусных свойств
данного соединения. Обозначились перспективы усиления антиоксидантного и про-
тивовирусного действия эхинохрома А в сочетании с другими природными антиокси-
дантами. Выяснилось, что композиция антиоксидантов (эхинохром А, аскорбиновая
кислота и α-токоферол) демонстрирует более высокую (p<0,05) антиоксидантную
активность, чем каждый из компонентов в отдельности. Так, IC50 композиции были в
1,5 раза ниже, а SI, соответственно, выше, чем у одного эхинохрома А. Анализ влияния
эхинохрома А и композиции антиоксидантов на жизненные циклы ВКЭ и ВПГ-1 по-
казал, что основным механизмом противовирусного (вирулицидного) действия этих
соединений является непосредственная инактивация вирусных частиц. Нельзя также
исключить, что высокая вирулицидная активность исследуемых соединений обуслов-
лена их способностью препятствовать взаимодействию прикрепительных вирусных
белков и «вирусспецифических» рецепторами клеток. Не исключено, что эти соеди-
нения могут подавлять ранние этапы репликации вируса, а также, что их активность
связана с модуляцией внутриклеточных сигнальных путей. В научной литературе ука-
зано на способность природных антиоксидантов проявлять противовирусную актив-
ность. Так, Yu.Zhang et al. продемонстрировали результаты исследований по влиянию
антиоксидантов на вирус японского энцефалита [19]. Действие антиоксидантов через
клеточные сигнальные пути при гриппозной инфекции представлены в исследовании
Yinghua Li et al. [18]. Тем не менее, несмотря на очевидную перспективность, подоб-
ных работ относительно мало, в связи с чем, полученные нами материалы свидетельс-
твуют о целесообразности дальнейшего углубленного исследования этих соединений
в качестве противовирусных препаратов широкого спектра действия.
×
About the authors
N. V. Krylova
Somov Institute of Epidemiology and Microbiology
Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Россия
S. A. Fedoreev
Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry
Email: fake@neicon.ru
Vladivostok Россия
V. F. Lavrov
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
N. P. Mischenko
Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry
Email: fake@neicon.ru
Vladivostok Россия
E. A. Vasileva
Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry
Email: fake@neicon.ru
Vladivostok Россия
O. A. Svitich
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
L. K. Ebralidze
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
O. V. Еunihina
Somov Institute of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Россия
G. N. Leonova
Somov Institute of Epidemiology and Microbiology
Email: fake@neicon.ru
Россия
References
- Веселова М.В., Федореев С.А., Василевская Н.А., Денисенко В.А., Герасименко А.В. Антиоксидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного. Хим. фарм. журн. 2007, 41(2):29-34.
- Еляков Г.Б., Максимов О.Б., Мищенко Н.П., Кольцова Е.А., Федореев С.А., Глебко Л.И., Красовская Н.П., Артюков А.А. Патент: 2134107 С1, Российская Федерация. Препарат гистохром для лечения воспалительных заболеваний сетчатки и роговицы глаз. Опубл.10.08.1999, Бюл. № 22.
- Еляков Г.Б., Максимов О.Б., Мищенко Н.П., Кольцова Е.А., Федореев С.А., Глебко Л.И., Красовская Н.П., Артюков А.А. Патент: 2137472 С1, Российская Федерация. Лекарственный препарат гистохром для лечения острого инфаркта миокарда и ишемической болезни сердца. Опубл. 23.04.1999, Бюл. № 26.
- Захарычева Т.А, Ковальский Ю.Г., Лебедько О.А., Мжельская Т.В. Оксидативный стресс у больных клещевым энцефалитом на Дальнем Востоке Российской Федерации. Дальневост. журн. инфекц. патол. 2012, 20:41-45.
- Крылова Н.В., Попов А.М., Леонова Г.Н. Антиоксиданты как потенциальные противовирусные препараты при флавивирусных инфекциях. Антибиотики и химиотер. 2016, 61:5-6.
- Свитич О.А., Ковальчук Л.В., Банковская Л.В., Лавров В.Ф., Гервазиева В.Б., Парфенова Т.М., Конищева А.Ю., Головин Г.Г., Лабжинов П.А. Аналитический подход в изучении противовирусного и иммуномодулирующего действия препаратов на модели герпесвирусной инфекции IN VITRO. Российский иммунологический журнал. 2013, 7(16), 4:377-384.
- Сомова О.Ю., Ганковская О.А., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Зверев В.В. Динамика экспрессии молекул TLR9-опосредованного сигнального пути эпителиальными клетками цервикального канала под действием вируса простого герпеса 2 типа IN VITRO. Российский иммунологический журнал. 2011, 5(14), 2:129-134.
- Сопова Е.А., Баранов В.И., Ганковская О.А., Лавров В.Ф., Зверев В.В. Влияние нанопорошков серебра и диоксида кремния на развитие герпесвирусной инфекции IN VITRO. Гигиена и санитария. 2010, 4:89-91.
- Стоник В.А., Гусев Е.И., Мартынов М.Ю., Гусева М.Р., Щукин И.А., Агафонова И.Г., Мищенко Н.П., Федореев С.А.Поиск веществ для лечения геморрагического инсульта. Использование магнитно-резонансной томографии в оценке эффективности гистохрома. Доклады Академии наук. 2005, 405(5):1-3.
- Bastos J.C.S., de Menezes C.B.A., Fantinatti-Garboggini F. et al. Antiviral Activity of Marine Actinobacteria against Bovine Viral Diarrhea Virus, a Surrogate Model of the Hepatitis C Virus. RRJMB. 2015, 4(4):55-62.
- Firuzi O., Miri R., Tavakkoli M. et al. Antioxidant therapy: current status and future prospects. Curr. Med. Chem. 2011, 18:3871-3888.
- Kavouras J.H., Prandovszky E., Valyi-Nagy K. et al. Herpes simplex virus type 1 infection induces oxidative stress and the release of bioactive lipid peroxidation by-products in mouse P19N neural cell cultures. J. Neurovirol. 2007, 13(5):416-425.
- Leonova G.N., Maystrovskaya O.S., Kondratov I.G. et al. The nature of replication of tick-borne encephalitis virus strains isolated from residents of the Russian Far East with inapparent and clinical forms of infection. Virus Res. 2014, 189:34-42.
- Matsuda M., Shigeta S., Okutani K. Antiviral activities of marine Pseudomonas polysaccharides and their oversulfated derivatives. Mar. Biotechnol. 1999, 1:68-73.
- Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983, 65:55-63.
- Sebastiano M., Chastel O., deThoisy B. et al. Oxidative stress favours herpes virus infection in vertebrates: a meta-analysis. Current Zoology. 2016, 62(4):325-332.
- Valyi-Nagy T., Dermody T.S. Role of oxidative damage in the pathogenesis of viral infections of the nervous system. Histol. Histopathol. 2005, 20:957-967.
- Yinghua Li, Zhengfang Lin, Min Guo et al. Inhibition of H1N1 influenza virus-induced apoptosis by functionalized selenium nanoparticles with amantadine through ROS-mediated AKT signaling pathways. Int. J. Nanomedicine. 2018, 13:2005-2016.
- Zhang Y., Wang Z., Chen H. et al. Antioxidants: potential antiviral agents for Japanese encephalitis virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 2014, 24:30-36.
Supplementary files
