Отправить статью по E-mail ПРОТИВОВИРУСНАЯ И АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭХИНОХРОМА А И КОМПОЗИЦИИ АНТИОКСИДАНТОВ НА ЕГО ОСНОВЕ
- Авторы: Крылова Н.В.1, Федореев С.А.2, Лавров В.Ф.3, Мищенко Н.П.2, Васильева Е.А.2, Свитич О.А.3, Эбралидзе Л.к3, Иунихина О.В.1, Леонова Г.Н.1
-
Учреждения:
- НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П.Сомова
- Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова
- НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова
- Выпуск: Том 96, № 1 (2019)
- Страницы: 53-58
- Раздел: Статьи
- Дата подачи: 22.08.2019
- Дата принятия к публикации: 22.08.2019
- Дата публикации: 23.04.2019
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/381
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-53-58
- ID: 381
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель. Изучение антиоксидантной и противовирусной активности эхинохрома А и композиции антиоксидантов на его основе в отношении вирусов клещевого энцефалита (ВКЭ) и простого герпеса 1 типа (ВПГ-1). Материалы и методы. ВКЭ (штамм Dal’negorsk, дальневосточного субтипа) выращивали на культуре клеток СПЭВ, ВПГ-1 (штамм VR3) — на культуре клеток Vero. Антиоксидантную активность соединений определяли с использованием модели перекисного окисления линетола. Цитотоксическую и противовирусную активность соединений оценивали по жизнеспособности клеток СПЭВ и Vero и подавлению цитопатогенного действия ВКЭ и ВПГ-1. Результаты. Композиция антиоксидантов (смесь эхинохрома А, аскорбиновой кислоты и α-токоферола — 5:5:1) обладала более выраженным антиоксидантным и противовирусным действием, чем эхинохром А. Механизмы противовирусной активности эхинохрома А и композиции антиоксидантов, вероятно, обусловлены его способностью непосредственно инактивировать вирусы и подавлять процесс заражения вирусами культур клеток. Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования эхинохрома А и композиции антиоксидантов в качестве противовирусных препаратов.
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕОкислительный стресс, индуцированный нейротропными вирусами, играет
важную роль в патогенезе вирусных инфекций. Ткани ЦНС отличаются высоким
содержанием липидов, в связи с чем, они особенно чувствительны к перекисному
окислению [17]. Активация процессов свободно-радикального окисления и резкое
угнетение антиокдсидантной и антирадикальной систем защиты организма наблю-
дается у больных клещевым энцефалитом [4] и при манифестации герпетической ин-
фекции [15, 16]. Известно, что антиоксиданты препятствуют разрушительному вли-
янию активных форм кислорода, в том числе, негативному воздействию свободных
радикалов, следовательно, предотвращают развитие заболеваний, связанных с окис-
лительным стрессом и, вероятно, могут оказывать терапевтический эффект [5, 11].
Поскольку наиболее важным аспектом в лечении вирусных инфекций является
подавление репликации вируса, то поиск среди природных антиоксидантов хими-
ческих соединений, обладающих противовирусными свойствами, весьма актуален,
а применение препаратов с противовирусной и антиоксидантной активностью яв-
ляется приоритетной задачей в борьбе с вирусной патологией. Одним из перспек-
тивных природных антиоксидантов, который, вероятно, может обладать и противо-
вирусными свойствами, является эхинохром А (хиноидный пигмент морских ежей),
хорошо зарекомендовавший себя в комплексной терапии сетчатки и роговицы глаз,
а также в кардиологической практике [2, 3].
Целью настоящего исследования было изучение антиоксидантной и противо-
вирусной активности эхинохрома А, а также композиции антиоксидантов на модели
вирусной инфекции, вызываемой вирусами клещевого энцефалита и простого гер-
песа 1 типа in vitro.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Были использованы два вируса: клещевого энцефалита (ВКЭ) и простого герпе-
са 1 типа (ВПГ-1). ВКЭ (штамм Dal’negorsk, дальневосточного субтипа) выделен в
1973 году из мозга умершего больного с очаговой формой заболевания (номер пол-
ногеномной последовательности в GenBank — FJ402886) [13]. Титр ВКЭ составил
108,8 TCID50/мл. Противовирусную активность препаратов в отношении ВКЭ ис-
следовали на перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), вы-
ращенных в среде 199 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров и 100 ЕД/мл
гентамицина при 37°С в атмосфере 5% СО2. ВПГ-1 (штамм VR3) получен из
Национальной коллекции вирусов США (Rockville, Maryland, USA). Титр ВПГ-1
составил 108,25 TCID50/мл. Противовирусную активность препаратов в отношении
ВПГ-1 изучали, используя перевиваемую культуру клеток Vero, выращенных в пол-
ной культуральной среде DMEM с добавлением 5-10% сыворотки эмбрионов коров,
0,008% раствора гентамицина сульфата и глутамина при 37°С, в атмосфере 5% СО2.
Концентрация клеток во всех экспериментах составляла 104 кл/мл.
Исследовали эхинохром А (2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-этил-1,4-нафтохинон),
композицию антиоксидантов — эхинохром А (Эх), аскорбиновая кислота и α-то-
коферол в массовом соотношении 5:5:1, установленным в процессе проведения
исследований. Плацебо — композиция, содержащая аскорбиновую кислоту и α-то-
коферол в массовом соотношении 5:1. Тестируемые препараты растворяли в диме-
тилсульфоксиде (DMSO, Sigma, USA) и хранили при —20°C. Рабочие растворы го-
товили из стоковых растворов (10 мг/мл), разводя соответствующей культуральной
средой. Конечная концентрация DMSO в рабочих растворах составляла 0,5%.
Антиоксидантная активность определялась на модели перекисного окисления
линетола, содержащего сложную смесь этиловых эфиров полиненасыщенных жир-
ных кислот (олеиновой, линолевой и линоленовой) льняного масла при 37° С [1].
Стоковые растворы эхинохрома, аскорбиновой кислоты и α-токоферола готовили
в концентрации 10 мг/мл этилового спирта. Бинарные и тройные композиции ан-
тиоксидантов получали, смешивая объемы стоковых растворов в указанных соот-
ношениях, добавляли линетол и помещали в термостат при 37°С. Концентрация
антиоксидантонв в линетоле составляла 0,05 мг/мл или 0,005%, 2 раза в сутки массу
предварительно охлажденных до 18-200C реакционных смесей измеряли. По мере
увеличения массы на 10 мг реакцию останавливали. Период ингибирования окисле-
ния линетола (Δτ) определяли с учетом разности времени, за которое масса линето-
ла увеличивалась на 10 мг по формуле: Δτ = τ – τ0, где τ — время начала окисления
линетола в присутствии антиоксиданта (ч); τ0 — время начала окисления линетола
без антиоксиданта (ч).
Цитотоксическую активность оценивали с учетом жизнеспособности клеток в
МТТ-тесте [12]. На 24-часовой монослой клеток, выращенных в 96-луночных плос-
кодонных полистироловых планшетах (СПЭВ для ВКЭ и Vero для ВПГ-1, 2х104 кл./
лунку), наносили тестируемые вещества и культивировали при 37°С в атмосфере 5%
CO2 в течение 6 суток. Затем в культуру на 60 минут добавляли 5 мг/мл МТТ (ме-
тилтиазолилтетразолия бромид, Sigma, USA) и после этого изопропиловый спирт.
Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре при длине волны 540
нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле: (ОПо)/(ОПк)×100%, где
ОПо — оптическая плотность клеточной суспензии, обработанной тестируемыми
препаратами, ОПк — оптическая плотность необработанной клеточной суспензии;
50% цитотоксическую концентрацию препаратов (СС50) устанавливали с учетом
концентрации вещества, снижающего количество жизнеспособных клеток на 50%
по сравнению с контролем, используя метод регрессионного анализа.
Противовирусная активность оценивалась визуально по степени подавления
цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов в культуре клеток с помощью инвер-
тированного микроскопа (Биолам П-1, ЛОМО, РФ), а также в МТТ-тесте [10, 14].
Концентрации препаратов составляли от 0 до 400 мкг/мл, инфицирующая доза ВКЭ
и ВПГ-1 — 102 TCID50/мл. Вирусы и препараты наносили на монослой клеток СПЭВ
или Vero одновременно и инкубировали в течение 6 суток при 37°С в атмосфере 5%
CO2. Оценка противовирусной активности осуществлялась с учетом степени подав-
ления (IR) цитопатогенного действия вирусов тем или иным препаратом, в част-
ности, по 50% ингибирующей концентрации (IC50) и селективному индексу (SI).
IR рассчитывали по формуле: IR = (ОП опыт — ОП вир. контроль)/(ОП кл. конт-
роль — ОП вир. контроль) × 100%. IC50 устанавливали с помощью регрессионного
анализа, SI рассчитывали, как отношение CC50 к IC50. Во всех схемах тестирования
противовирусного действия исследуемых соединений их концентрация составляла
20 мкг/мл. При этом инфицирующая доза ВКЭ и ВПГ-1 была равна 102 TCID50/мл.
Противовирусную активность соединений определяли с учетом степени подавления
(IR) ими цитопатогенного действия вирусов в МТТ-тесте.
Схемы определения противовирусной активности препаратов: (1) определение
вирулицидной активности — вируссодержащую жидкость смешивали с препаратом
в соотношении 1:1, инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Затем смесь нано-
сили на монослой клеток и инкубировали в течение 6 суток при 37°С в атмосфере
5% СО2. (2) определение профилактической активности: монослой клеток обраба-
тывали одним из исследуемых препаратов в течение 60 минут при 37°С. Затем клет-
ки инфицировали одним из вирусов (ВКЭ или ВПГ-1) и инкубировали в течение 6
суток при 37°С в атмосфере 5% СО2. (3) определение вирусингибирующей активнос-
ти: монослой клеток инфицировали вирусом в течение 60 минут при t 37° С. Затем
к клеткам добавляли исследуемый препарат и в течение 6 суток инкубировали при
37°С в атмосфере 5% СО2. Представленные схемы определения противовирусной
активности были детально отработаны в ранее описанных экспериментах [6 — 8].
Статистическую обработку данных проводили, используя пакет программ
Statistica 10.0. Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение.
Сравнение различий между показателями контрольной и опытной групп осущест-
вляли с использованием критерия Вилкоксона для связанных выборок. Различия
считались достоверными при p≤0,05.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
Определение антиоксидантной активности препаратов на модели перекисного
окисления линетола позволило провести сравнительный анализ антиоксидантных
свойств эхинохрома А, α-токоферола и аскорбиновой кислоты, а также найти оп-
тимальное соотношение в композиции этих компонентов при реализации антиок-
сидантных и прооксидантных свойств. Установлено, что из всех антиоксидантов на-
иболее активным оказался α-токоферол (Δτ 125 ч), эхинохром А был менее активен
(Δτ 100 ч), а аскорбиновая кислота в этих условиях (без α-токоферола) не обладает
антиоксидантной активностью, что подтвердилось результатами опытов (Δτ для сме-
си Аск+Ток в соотношении 2:1 составляло 195 ч). Наиболее выраженный антиокис-
лительный эффект в отношении линетола продемонстрировала смесь (Эх+Аск+Ток)
в соотношении 5:5:1. При этом был показан выраженный синергизм действия ком-
понентов композиции (Δτ 223 ч) и их высокая стабильность в течение 12 месяцев.
С помощью МТТ-анализа были рассчитаны 50% цитотоксические концентра-
ции (CC50) исследуемых соединений в культурах клеток СПЭВ и Vero и селектив-
ные индексы (SI), характеризующие их противовирусную активность (табл.). При
этом установлено, что плацебо обладает незначительной цитотоксической актив-
ностью, по сравнению с эхинохром А и композицией антиоксидантов (p≤0,05).
Одновременная обработка клеток СПЭВ исследуемыми соединениями в концентра-
циях от 0 до 400 мкг/мл и ВКЭ (102TCID50/мл) демонстрировала умеренную проти-
вовирусною активность эхинохрома А и композиции антиоксидантов. Вместе с тем,
композиция обладает способностью подавлять ЦПД ВКЭ при существенно более
низких IC50-концентрациях и более высоких показателях SI, чем один эхинохром А
(p≤0,05). Заражение клеток Vero ВПГ-1 с одновременной обработкой тестируемы-
ми препаратами показало, что селективный индекс композиции (эффективность
действия) был достоверно выше соответствующего показателя для эхинохрома А и
плацебо (p≤0,05) (табл.).
Особенности влияния препаратов на разные стадии жизненного цикла ВКЭ и
ВПГ-1, в том числе: а) стадию адсорбции вируса на клетках (профилактическое дейс-
твие); б) стадию репликации вируса (вирусингибирующее действие); в) непосредс-
твенное влияние на вирус (вирулицидное действие) были определены с помощью
МТТ-анализа. Установлено, что наиболее выраженный вирулицидный эффект на-
блюдался после непосредственной обработки вируса соответствующим соединени-
ем перед заражением культуры клеток. При этом степень подавления (IR) эхинохро-
мом А и композицией антиоксидантов цитопатогенного действия ВКЭ составляла,
соответственно, 75±4% и 89±5%, а IR ВПГ-1 ~ 100% (IR плацебо ~ 30%). Обработка
клеток СПЭВ и Vero исследуемыми препаратами перед их заражением вирусами
(профилактическое действие) оказалась мало эффективной. После обработки кле-
ток композицией антиоксидантов (35±3%) и плацебо (24±3%) вирусингибирующая
активность препаратов имела значимые различия (p<0,05) лишь в опытах с ВПГ-1.
Вирусингибирующую активность на ранней стадии репликации вируса (через 60
минут после заражения) показали как эхинохром А, так и композиция антиоксидан-
тов. Она составила 21±2% и 36±3% при ВКЭ-инфекции и, соответственно, 28±3%
и 43±4% при герпетической инфекции (у плацебо ~10%, p<0,05). Следует отметить,
что степень подавления репликации вирусов композицией антиоксидантов была,
как правило, выше таковой, опосредованной лишь одним эхинохромом А (p<0,05).
Ранее была выявлена способность эхинохрома А преодолевать гематоэнцефали-
ческий барьер [6], что стало предпосылкой для изучения противовирусных свойств
данного соединения. Обозначились перспективы усиления антиоксидантного и про-
тивовирусного действия эхинохрома А в сочетании с другими природными антиокси-
дантами. Выяснилось, что композиция антиоксидантов (эхинохром А, аскорбиновая
кислота и α-токоферол) демонстрирует более высокую (p<0,05) антиоксидантную
активность, чем каждый из компонентов в отдельности. Так, IC50 композиции были в
1,5 раза ниже, а SI, соответственно, выше, чем у одного эхинохрома А. Анализ влияния
эхинохрома А и композиции антиоксидантов на жизненные циклы ВКЭ и ВПГ-1 по-
казал, что основным механизмом противовирусного (вирулицидного) действия этих
соединений является непосредственная инактивация вирусных частиц. Нельзя также
исключить, что высокая вирулицидная активность исследуемых соединений обуслов-
лена их способностью препятствовать взаимодействию прикрепительных вирусных
белков и «вирусспецифических» рецепторами клеток. Не исключено, что эти соеди-
нения могут подавлять ранние этапы репликации вируса, а также, что их активность
связана с модуляцией внутриклеточных сигнальных путей. В научной литературе ука-
зано на способность природных антиоксидантов проявлять противовирусную актив-
ность. Так, Yu.Zhang et al. продемонстрировали результаты исследований по влиянию
антиоксидантов на вирус японского энцефалита [19]. Действие антиоксидантов через
клеточные сигнальные пути при гриппозной инфекции представлены в исследовании
Yinghua Li et al. [18]. Тем не менее, несмотря на очевидную перспективность, подоб-
ных работ относительно мало, в связи с чем, полученные нами материалы свидетельс-
твуют о целесообразности дальнейшего углубленного исследования этих соединений
в качестве противовирусных препаратов широкого спектра действия.
×
Об авторах
Н. В. Крылова
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П.Сомова
Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru
Россия
С. А. Федореев
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова
Email: fake@neicon.ru
Владивосток Россия
В. Ф. Лавров
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
Н. П. Мищенко
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова
Email: fake@neicon.ru
Владивосток Россия
Е. А. Васильева
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова
Email: fake@neicon.ru
Владивосток Россия
О. А. Свитич
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
Л. к Эбралидзе
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия
О. В. Иунихина
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П.Сомова
Email: fake@neicon.ru
Россия
Г. Н. Леонова
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П.Сомова
Email: fake@neicon.ru
Россия
Список литературы
- Веселова М.В., Федореев С.А., Василевская Н.А., Денисенко В.А., Герасименко А.В. Антиоксидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного. Хим. фарм. журн. 2007, 41(2):29-34.
- Еляков Г.Б., Максимов О.Б., Мищенко Н.П., Кольцова Е.А., Федореев С.А., Глебко Л.И., Красовская Н.П., Артюков А.А. Патент: 2134107 С1, Российская Федерация. Препарат гистохром для лечения воспалительных заболеваний сетчатки и роговицы глаз. Опубл.10.08.1999, Бюл. № 22.
- Еляков Г.Б., Максимов О.Б., Мищенко Н.П., Кольцова Е.А., Федореев С.А., Глебко Л.И., Красовская Н.П., Артюков А.А. Патент: 2137472 С1, Российская Федерация. Лекарственный препарат гистохром для лечения острого инфаркта миокарда и ишемической болезни сердца. Опубл. 23.04.1999, Бюл. № 26.
- Захарычева Т.А, Ковальский Ю.Г., Лебедько О.А., Мжельская Т.В. Оксидативный стресс у больных клещевым энцефалитом на Дальнем Востоке Российской Федерации. Дальневост. журн. инфекц. патол. 2012, 20:41-45.
- Крылова Н.В., Попов А.М., Леонова Г.Н. Антиоксиданты как потенциальные противовирусные препараты при флавивирусных инфекциях. Антибиотики и химиотер. 2016, 61:5-6.
- Свитич О.А., Ковальчук Л.В., Банковская Л.В., Лавров В.Ф., Гервазиева В.Б., Парфенова Т.М., Конищева А.Ю., Головин Г.Г., Лабжинов П.А. Аналитический подход в изучении противовирусного и иммуномодулирующего действия препаратов на модели герпесвирусной инфекции IN VITRO. Российский иммунологический журнал. 2013, 7(16), 4:377-384.
- Сомова О.Ю., Ганковская О.А., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Зверев В.В. Динамика экспрессии молекул TLR9-опосредованного сигнального пути эпителиальными клетками цервикального канала под действием вируса простого герпеса 2 типа IN VITRO. Российский иммунологический журнал. 2011, 5(14), 2:129-134.
- Сопова Е.А., Баранов В.И., Ганковская О.А., Лавров В.Ф., Зверев В.В. Влияние нанопорошков серебра и диоксида кремния на развитие герпесвирусной инфекции IN VITRO. Гигиена и санитария. 2010, 4:89-91.
- Стоник В.А., Гусев Е.И., Мартынов М.Ю., Гусева М.Р., Щукин И.А., Агафонова И.Г., Мищенко Н.П., Федореев С.А.Поиск веществ для лечения геморрагического инсульта. Использование магнитно-резонансной томографии в оценке эффективности гистохрома. Доклады Академии наук. 2005, 405(5):1-3.
- Bastos J.C.S., de Menezes C.B.A., Fantinatti-Garboggini F. et al. Antiviral Activity of Marine Actinobacteria against Bovine Viral Diarrhea Virus, a Surrogate Model of the Hepatitis C Virus. RRJMB. 2015, 4(4):55-62.
- Firuzi O., Miri R., Tavakkoli M. et al. Antioxidant therapy: current status and future prospects. Curr. Med. Chem. 2011, 18:3871-3888.
- Kavouras J.H., Prandovszky E., Valyi-Nagy K. et al. Herpes simplex virus type 1 infection induces oxidative stress and the release of bioactive lipid peroxidation by-products in mouse P19N neural cell cultures. J. Neurovirol. 2007, 13(5):416-425.
- Leonova G.N., Maystrovskaya O.S., Kondratov I.G. et al. The nature of replication of tick-borne encephalitis virus strains isolated from residents of the Russian Far East with inapparent and clinical forms of infection. Virus Res. 2014, 189:34-42.
- Matsuda M., Shigeta S., Okutani K. Antiviral activities of marine Pseudomonas polysaccharides and their oversulfated derivatives. Mar. Biotechnol. 1999, 1:68-73.
- Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983, 65:55-63.
- Sebastiano M., Chastel O., deThoisy B. et al. Oxidative stress favours herpes virus infection in vertebrates: a meta-analysis. Current Zoology. 2016, 62(4):325-332.
- Valyi-Nagy T., Dermody T.S. Role of oxidative damage in the pathogenesis of viral infections of the nervous system. Histol. Histopathol. 2005, 20:957-967.
- Yinghua Li, Zhengfang Lin, Min Guo et al. Inhibition of H1N1 influenza virus-induced apoptosis by functionalized selenium nanoparticles with amantadine through ROS-mediated AKT signaling pathways. Int. J. Nanomedicine. 2018, 13:2005-2016.
- Zhang Y., Wang Z., Chen H. et al. Antioxidants: potential antiviral agents for Japanese encephalitis virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 2014, 24:30-36.
Дополнительные файлы
