ANTIVIRAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE COMPOSITION OF COMPOUNDS BASED ON ECHINOCHROME A

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Окислительный стресс, индуцированный нейротропными вирусами, играет
важную роль в патогенезе вирусных инфекций. Ткани ЦНС отличаются высоким
содержанием липидов, в связи с чем, они особенно чувствительны к перекисному
окислению [17]. Активация процессов свободно-радикального окисления и резкое
угнетение антиокдсидантной и антирадикальной систем защиты организма наблю-
дается у больных клещевым энцефалитом [4] и при манифестации герпетической ин-
фекции [15, 16]. Известно, что антиоксиданты препятствуют разрушительному вли-
янию активных форм кислорода, в том числе, негативному воздействию свободных
радикалов, следовательно, предотвращают развитие заболеваний, связанных с окис-
лительным стрессом и, вероятно, могут оказывать терапевтический эффект [5, 11].
Поскольку наиболее важным аспектом в лечении вирусных инфекций является
подавление репликации вируса, то поиск среди природных антиоксидантов хими-
ческих соединений, обладающих противовирусными свойствами, весьма актуален,
а применение препаратов с противовирусной и антиоксидантной активностью яв-
ляется приоритетной задачей в борьбе с вирусной патологией. Одним из перспек-
тивных природных антиоксидантов, который, вероятно, может обладать и противо-
вирусными свойствами, является эхинохром А (хиноидный пигмент морских ежей),
хорошо зарекомендовавший себя в комплексной терапии сетчатки и роговицы глаз,
а также в кардиологической практике [2, 3].
Целью настоящего исследования было изучение антиоксидантной и противо-
вирусной активности эхинохрома А, а также композиции антиоксидантов на модели
вирусной инфекции, вызываемой вирусами клещевого энцефалита и простого гер-
песа 1 типа in vitro.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Были использованы два вируса: клещевого энцефалита (ВКЭ) и простого герпе-
са 1 типа (ВПГ-1). ВКЭ (штамм Dal’negorsk, дальневосточного субтипа) выделен в
1973 году из мозга умершего больного с очаговой формой заболевания (номер пол-
ногеномной последовательности в GenBank — FJ402886) [13]. Титр ВКЭ составил
108,8 TCID50/мл. Противовирусную активность препаратов в отношении ВКЭ ис-
следовали на перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), вы-
ращенных в среде 199 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров и 100 ЕД/мл
гентамицина при 37°С в атмосфере 5% СО2. ВПГ-1 (штамм VR3) получен из
Национальной коллекции вирусов США (Rockville, Maryland, USA). Титр ВПГ-1
составил 108,25 TCID50/мл. Противовирусную активность препаратов в отношении
ВПГ-1 изучали, используя перевиваемую культуру клеток Vero, выращенных в пол-
ной культуральной среде DMEM с добавлением 5-10% сыворотки эмбрионов коров,
0,008% раствора гентамицина сульфата и глутамина при 37°С, в атмосфере 5% СО2.
Концентрация клеток во всех экспериментах составляла 104 кл/мл.
Исследовали эхинохром А (2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-этил-1,4-нафтохинон),
композицию антиоксидантов — эхинохром А (Эх), аскорбиновая кислота и α-то-
коферол в массовом соотношении 5:5:1, установленным в процессе проведения
исследований. Плацебо — композиция, содержащая аскорбиновую кислоту и α-то-
коферол в массовом соотношении 5:1. Тестируемые препараты растворяли в диме-
тилсульфоксиде (DMSO, Sigma, USA) и хранили при —20°C. Рабочие растворы го-
товили из стоковых растворов (10 мг/мл), разводя соответствующей культуральной
средой. Конечная концентрация DMSO в рабочих растворах составляла 0,5%.
Антиоксидантная активность определялась на модели перекисного окисления
линетола, содержащего сложную смесь этиловых эфиров полиненасыщенных жир-
ных кислот (олеиновой, линолевой и линоленовой) льняного масла при 37° С [1].
Стоковые растворы эхинохрома, аскорбиновой кислоты и α-токоферола готовили
в концентрации 10 мг/мл этилового спирта. Бинарные и тройные композиции ан-
тиоксидантов получали, смешивая объемы стоковых растворов в указанных соот-
ношениях, добавляли линетол и помещали в термостат при 37°С. Концентрация
антиоксидантонв в линетоле составляла 0,05 мг/мл или 0,005%, 2 раза в сутки массу
предварительно охлажденных до 18-200C реакционных смесей измеряли. По мере
увеличения массы на 10 мг реакцию останавливали. Период ингибирования окисле-
ния линетола (Δτ) определяли с учетом разности времени, за которое масса линето-
ла увеличивалась на 10 мг по формуле: Δτ = τ – τ0, где τ — время начала окисления
линетола в присутствии антиоксиданта (ч); τ0 — время начала окисления линетола
без антиоксиданта (ч).
Цитотоксическую активность оценивали с учетом жизнеспособности клеток в
МТТ-тесте [12]. На 24-часовой монослой клеток, выращенных в 96-луночных плос-
кодонных полистироловых планшетах (СПЭВ для ВКЭ и Vero для ВПГ-1, 2х104 кл./
лунку), наносили тестируемые вещества и культивировали при 37°С в атмосфере 5%
CO2 в течение 6 суток. Затем в культуру на 60 минут добавляли 5 мг/мл МТТ (ме-
тилтиазолилтетразолия бромид, Sigma, USA) и после этого изопропиловый спирт.
Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре при длине волны 540
нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле: (ОПо)/(ОПк)×100%, где
ОПо — оптическая плотность клеточной суспензии, обработанной тестируемыми
препаратами, ОПк — оптическая плотность необработанной клеточной суспензии;
50% цитотоксическую концентрацию препаратов (СС50) устанавливали с учетом
концентрации вещества, снижающего количество жизнеспособных клеток на 50%
по сравнению с контролем, используя метод регрессионного анализа.
Противовирусная активность оценивалась визуально по степени подавления
цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов в культуре клеток с помощью инвер-
тированного микроскопа (Биолам П-1, ЛОМО, РФ), а также в МТТ-тесте [10, 14].
Концентрации препаратов составляли от 0 до 400 мкг/мл, инфицирующая доза ВКЭ
и ВПГ-1 — 102 TCID50/мл. Вирусы и препараты наносили на монослой клеток СПЭВ
или Vero одновременно и инкубировали в течение 6 суток при 37°С в атмосфере 5%
CO2. Оценка противовирусной активности осуществлялась с учетом степени подав-
ления (IR) цитопатогенного действия вирусов тем или иным препаратом, в част-
ности, по 50% ингибирующей концентрации (IC50) и селективному индексу (SI).
IR рассчитывали по формуле: IR = (ОП опыт — ОП вир. контроль)/(ОП кл. конт-
роль — ОП вир. контроль) × 100%. IC50 устанавливали с помощью регрессионного
анализа, SI рассчитывали, как отношение CC50 к IC50. Во всех схемах тестирования
противовирусного действия исследуемых соединений их концентрация составляла
20 мкг/мл. При этом инфицирующая доза ВКЭ и ВПГ-1 была равна 102 TCID50/мл.
Противовирусную активность соединений определяли с учетом степени подавления
(IR) ими цитопатогенного действия вирусов в МТТ-тесте.
Схемы определения противовирусной активности препаратов: (1) определение
вирулицидной активности — вируссодержащую жидкость смешивали с препаратом
в соотношении 1:1, инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Затем смесь нано-
сили на монослой клеток и инкубировали в течение 6 суток при 37°С в атмосфере
5% СО2. (2) определение профилактической активности: монослой клеток обраба-
тывали одним из исследуемых препаратов в течение 60 минут при 37°С. Затем клет-
ки инфицировали одним из вирусов (ВКЭ или ВПГ-1) и инкубировали в течение 6
суток при 37°С в атмосфере 5% СО2. (3) определение вирусингибирующей активнос-
ти: монослой клеток инфицировали вирусом в течение 60 минут при t 37° С. Затем
к клеткам добавляли исследуемый препарат и в течение 6 суток инкубировали при
37°С в атмосфере 5% СО2. Представленные схемы определения противовирусной
активности были детально отработаны в ранее описанных экспериментах [6 — 8].
Статистическую обработку данных проводили, используя пакет программ
Statistica 10.0. Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение.
Сравнение различий между показателями контрольной и опытной групп осущест-
вляли с использованием критерия Вилкоксона для связанных выборок. Различия
считались достоверными при p≤0,05.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
Определение антиоксидантной активности препаратов на модели перекисного
окисления линетола позволило провести сравнительный анализ антиоксидантных
свойств эхинохрома А, α-токоферола и аскорбиновой кислоты, а также найти оп-
тимальное соотношение в композиции этих компонентов при реализации антиок-
сидантных и прооксидантных свойств. Установлено, что из всех антиоксидантов на-
иболее активным оказался α-токоферол (Δτ 125 ч), эхинохром А был менее активен
(Δτ 100 ч), а аскорбиновая кислота в этих условиях (без α-токоферола) не обладает
антиоксидантной активностью, что подтвердилось результатами опытов (Δτ для сме-
си Аск+Ток в соотношении 2:1 составляло 195 ч). Наиболее выраженный антиокис-
лительный эффект в отношении линетола продемонстрировала смесь (Эх+Аск+Ток)
в соотношении 5:5:1. При этом был показан выраженный синергизм действия ком-
понентов композиции (Δτ 223 ч) и их высокая стабильность в течение 12 месяцев.
С помощью МТТ-анализа были рассчитаны 50% цитотоксические концентра-
ции (CC50) исследуемых соединений в культурах клеток СПЭВ и Vero и селектив-
ные индексы (SI), характеризующие их противовирусную активность (табл.). При
этом установлено, что плацебо обладает незначительной цитотоксической актив-
ностью, по сравнению с эхинохром А и композицией антиоксидантов (p≤0,05).
Одновременная обработка клеток СПЭВ исследуемыми соединениями в концентра-
циях от 0 до 400 мкг/мл и ВКЭ (102TCID50/мл) демонстрировала умеренную проти-
вовирусною активность эхинохрома А и композиции антиоксидантов. Вместе с тем,
композиция обладает способностью подавлять ЦПД ВКЭ при существенно более
низких IC50-концентрациях и более высоких показателях SI, чем один эхинохром А
(p≤0,05). Заражение клеток Vero ВПГ-1 с одновременной обработкой тестируемы-
ми препаратами показало, что селективный индекс композиции (эффективность
действия) был достоверно выше соответствующего показателя для эхинохрома А и
плацебо (p≤0,05) (табл.).
Особенности влияния препаратов на разные стадии жизненного цикла ВКЭ и
ВПГ-1, в том числе: а) стадию адсорбции вируса на клетках (профилактическое дейс-
твие); б) стадию репликации вируса (вирусингибирующее действие); в) непосредс-
твенное влияние на вирус (вирулицидное действие) были определены с помощью
МТТ-анализа. Установлено, что наиболее выраженный вирулицидный эффект на-
блюдался после непосредственной обработки вируса соответствующим соединени-
ем перед заражением культуры клеток. При этом степень подавления (IR) эхинохро-
мом А и композицией антиоксидантов цитопатогенного действия ВКЭ составляла,
соответственно, 75±4% и 89±5%, а IR ВПГ-1 ~ 100% (IR плацебо ~ 30%). Обработка
клеток СПЭВ и Vero исследуемыми препаратами перед их заражением вирусами
(профилактическое действие) оказалась мало эффективной. После обработки кле-
ток композицией антиоксидантов (35±3%) и плацебо (24±3%) вирусингибирующая
активность препаратов имела значимые различия (p<0,05) лишь в опытах с ВПГ-1.
Вирусингибирующую активность на ранней стадии репликации вируса (через 60
минут после заражения) показали как эхинохром А, так и композиция антиоксидан-
тов. Она составила 21±2% и 36±3% при ВКЭ-инфекции и, соответственно, 28±3%
и 43±4% при герпетической инфекции (у плацебо ~10%, p<0,05). Следует отметить,
что степень подавления репликации вирусов композицией антиоксидантов была,
как правило, выше таковой, опосредованной лишь одним эхинохромом А (p<0,05).
Ранее была выявлена способность эхинохрома А преодолевать гематоэнцефали-
ческий барьер [6], что стало предпосылкой для изучения противовирусных свойств
данного соединения. Обозначились перспективы усиления антиоксидантного и про-
тивовирусного действия эхинохрома А в сочетании с другими природными антиокси-
дантами. Выяснилось, что композиция антиоксидантов (эхинохром А, аскорбиновая
кислота и α-токоферол) демонстрирует более высокую (p<0,05) антиоксидантную
активность, чем каждый из компонентов в отдельности. Так, IC50 композиции были в
1,5 раза ниже, а SI, соответственно, выше, чем у одного эхинохрома А. Анализ влияния
эхинохрома А и композиции антиоксидантов на жизненные циклы ВКЭ и ВПГ-1 по-
казал, что основным механизмом противовирусного (вирулицидного) действия этих
соединений является непосредственная инактивация вирусных частиц. Нельзя также
исключить, что высокая вирулицидная активность исследуемых соединений обуслов-
лена их способностью препятствовать взаимодействию прикрепительных вирусных
белков и «вирусспецифических» рецепторами клеток. Не исключено, что эти соеди-
нения могут подавлять ранние этапы репликации вируса, а также, что их активность
связана с модуляцией внутриклеточных сигнальных путей. В научной литературе ука-
зано на способность природных антиоксидантов проявлять противовирусную актив-
ность. Так, Yu.Zhang et al. продемонстрировали результаты исследований по влиянию
антиоксидантов на вирус японского энцефалита [19]. Действие антиоксидантов через
клеточные сигнальные пути при гриппозной инфекции представлены в исследовании
Yinghua Li et al. [18]. Тем не менее, несмотря на очевидную перспективность, подоб-
ных работ относительно мало, в связи с чем, полученные нами материалы свидетельс-
твуют о целесообразности дальнейшего углубленного исследования этих соединений
в качестве противовирусных препаратов широкого спектра действия.

About the authors

N. V. Krylova

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

S. A. Fedoreev

Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry

Email: fake@neicon.ru
Vladivostok Russian Federation

V. F. Lavrov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

N. P. Mischenko

Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry

Email: fake@neicon.ru
Vladivostok Russian Federation

E. A. Vasileva

Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry

Email: fake@neicon.ru
Vladivostok Russian Federation

O. A. Svitich

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

L. K. Ebralidze

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

O. V. Еunihina

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

G. N. Leonova

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

References

Supplementary files