PROPERTIES OF NATIVE PROTEIN-CONTAINING ANTIGENS OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Проблема инфекций, вызванных Streptococcus pneumoniae, на протяжении не- скольких десятилетий остается актуальной для России [1, 2, 5]. Пневмококк спо- собен вызывать тяжелые инвазивные формы заболеваний среди детей и у взрослых людей [15]. Для профилактики пневмококковых инфекций используют зарубежные полисахаридные и конъюгированные вакцины, создающие защиту против ограни- ченного количества актуальных серотипов S. pneumoniae [5, 7]. При смене клиничес- ки значимых серотипов возбудителя полисахаридные антигены, входящие в состав пневмококковых вакцин, не позволяют создать защиту от невакцинных штаммов пневмококка [11]. Известно, что белки S. pneumoniae наряду с капсулой являются факторами ви- рулентности микроба и, соответственно, принимают участие в патогенезе инфекции и формировании иммунной защиты [3, 6]. Кроме того, пневмококковые белки обла- дают высокой гомологией между собой и, соответственно, могут формировать пере- крестную внутривидовую защиту [9, 11, 14]. Поэтому перспективным направлением является изучение свойств белков пневмококка с целью выявления наиболее имму- ногенных вариантов для создания отечественной серотипнезависимой вакцины. Вакцины, основанные на конъюгации полисахаридных антигенов и гомологич- ных белков, предположительно должны создавать более выраженную защиту против S. pneumoniae по сравнению с существующими вакцинами. Целью настоящей работы явилось исследование иммунохимических и иммуно- биологических свойств нативных белоксодержащих антигенов пневмококка (БсАП). МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы В работе использованы штаммы S. pneumoniae серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36, полученные из ЦКП Коллекция ФГБНУ НИИВС им. И.И.Мечникова. Опыты проводили на мышах линии Balb/c массой 16-18 г, полученных из пи- томника НЦ Биомедицинских технологий, филиал «Андреевка». S. pneumoniae выращивали в сердечно-мозговом бульоне в течение 16-18 ч в СО2- инкубаторе при температуре 370С и 5% содержании углекислого газа. Полученную культуру инактивировали с помощью 0,1 N NaOH, затем ее центрифугировали, отде- ляли осадок клеток из культуральной жидкости и из надосадочной жидкости выделяли БсАП методом ацетонового осаждения. Полученные препараты лиофилизировали. Химический анализ БсАП выполняли с помощью традиционных методов. Для определения общего белка в исследуемых препаратах использовали метод [13], уг- леводы определяли по методу [10], количество нуклеиновых кислот — по методу Спирина. Измерения проводили на спектрофотометре Ultrospec II E, Pharmacia LKB (Швеция). Для характеристики электрофоретической подвижности и опреде- ления молекулярной массы БсАП использовали вертикальный SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях [12]. Иммуноблоттинг проводили по общепринятой методике, используя для анализа моноклональ- ные антитела IgG1 к пневмолизину (100 мкг/мл, Santa Cruz Biotechnology, USA). Специфичность белков оценивали визуально по окрашиванию мембраны. Иммуноферментный анализ проводили согласно методу [8]. Для иммунизации животных использовали БсАП, которые растворяли в физио- логическом растворе без добавления или с добавлением гидроксида алюминия (Sigma, США) из расчета 20 мкг Al(OH)3 на 1 мкг белка. Сорбцию проводили в течение 12 ч при температуре 40С. Белоксодержащие антигены пневмококка вводили внутрибрю- шинно двукратно с интервалом в 14 дней в дозах 10, 30, 50 и 100 мкг/мышь. Через две недели после повторного введения препарата мышей заражали внутрибрюшинно суточной культурой S. pneumoniae в дозе 105 микробных клеток в 0,5 мл физиологи- ческого раствора (штамм №3) и в дозе 104 микробных клеток в 0,5 мл физиологичес- кого раствора (штамм №1156). В качестве контроля служили неиммунизированные мыши. Наблюдение за животными проводили в течение 10-14 дней. Статистическая обработка. Результаты оценивали по выживаемости мышей в течение срока наблюдения, рассчитывая достоверность по методу С.А. Гланца [4]. Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Белоксодержащие антигены пневмококка получали из S. pneumoniae серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36. По химическому составу препараты содержали от 16 до 35% белка, от 1 до 4% углеводов, от 3 до 6% нуклеиновых кислот. В SDS-электрофорезе в полиакриламидном геле с использованием белкового красителя Кумасси R-250 выявили в составе полученных препаратов (серотипы 3, 6В, 10А, 14, 19F и 36) белки с молекулярной массой в диапазоне от 14 до 116 кДа (рис. А).

 

Рисунок.

SDS-электрофорез БсАП в 12% ПААГ (А) и нитроцеллюлезная мембрана после иммуноблоттинга БсАП (Б). Концентрация БсАП в каждой дорожке составила 5 мг/мл. Дорожки: 1 — БсАП 3 No3; 2 — БсАП 3 No1156; 3 — БсАП 6В; 4 — БсАП 10А; 5 — БсАП 14; 6 — БсАП 19F; 7 — БсАП 36; 8 — маркер молекулярной массы.

В иммуноблоттинге определено, что БсАП, выделенные из S. pneumoniae серо- типов 3, 6В, 10А, 14, 19F и 36, связывались с моноклональными антителами IgG1 к пневмолизину (рис. Б). Это может свидетельствовать о перекрестной активнос- ти пневмолизина, содержащегося в препаратах, полученных из разных серотипов пневмококка. В реакции преципитации по Оухтерлони БсАП серотипов 3, 6В, 14, 19F и 36 в концентрации 1 мг/мл реагировали с кроличьей иммунной сывороткой, получен- ной к серотипу 19F S. pneumoniae, что свидетельствовало о наличии перекрестно- реагирующих антигенов в изучаемых препаратах. С помощью ИФА подтверждена перекрестная антигенная активность БсАП. Практически все препараты выявляли антитела в антимикробной кроличьей сыво- ротке, полученной к 19F серотипу (табл. 1). Отмечено повышение титров антител в 8 раз к БсАП 10А серотипа, в 16 раз к БсАП серотипов 3 (штамм №3), 6В и 36, в 32 раза к БсАП серотипов 14, 19F и 23F (р≤0,05). Исключение составил препарат, выделенный из серотипа 3 (штамм №1156), который выявлял высокий титр антител в контроле. Антимикробная кроличья сыворотка, полученная к 14 серотипу, оказа- лась менее активной, в ней определяли повышение титра антител в 32 раза в гомоло- гичной системе и повышение титра антител в 4 раза к БсАП 19F (р≤0,05). При взаимодействии с моноклональными антителами к пневмолизину БсАП, выделенных из серотипов 19F и 36, наблюдалось повышение титров антител в 4 и 8 раз (табл. 1), соответственно, что свидетельствовало о наличии этого белка в БсАП серотипов 19F и 36. Белоксодержащие антигены пневмококка, полученные из серотипа 3, после двукратной иммунизации мышей с интервалом 14 дней защищали животных от за- ражения 8 LD50 S. pneumoniae серотипа 3 №3 в дозах от 10 до 100 мкг/мышь. Защита составила 80-90 %, а при использовании сорбированного варианта — 100 % выжив- ших (р≤0,05) при 90% гибели мышей в контроле. При большей заражающей дозе (25 LD50 S. pneumoniae) выявлена значимость добавления гидроксида алюминия. SDS-электрофорез БсАП в 12% ПААГ (А) и нитроцеллюлезная мембрана после иммуноблоттинга БсАП (Б). Концентрация БсАП в каждой дорожке составила 5 мг/мл. Дорожки: 1 — БсАП 3 №3; 2 — БсАП 3 №1156; 3 — БсАП 6В; 4 — БсАП 10А; 5 — БсАП 14; 6 — БсАП 19F; 7 — БсАП 36; 8 — маркер молекулярной массы. При иммунизации мышей БсАП в дозах 10 и 50 мкг/мышь защита составила 50% животных. Однако при использовании гидроксида алюминия все испытанные дозы создавали защиту на уровне 80-90% (р≤0,05). Контроль гидроксида алюминия пока- зал, что он не защищал мышей от заражения S. pneumoniae. На следующем этапе изучена протективная активность препаратов БсАП в го- мологичной и гетерологичной системах. Мышей иммунизировали двукратно анти- генами, полученными из S. pneumoniae серотипов 3 №3, 14 и 19F в дозе 30 мкг/мышь с добавлением гидроксида алюминия (табл. 2, опыт I). Полученные результаты сви- детельствовали, что все препараты защищали мышей от заражения S. pneumoniae серотипа 3 штамм №3 на 3 день после заражения, когда отмечалась 100% гибель животных в контроле. Подтвердилась высокая протективная активность БсАП се- ротипа 3 при заражении гомологичным серотипом. Среди БсАП других серотипов более активным оказался препарат серотипа 19F (80% выживших мышей), препарат из серотипа 14 защищал 60 % мышей. При наблюдении в течение 10 дней было вы- явлено, что гомологичный БсАП серотипа 3 защищал 100% мышей, гетерологичный БсАП, выделенный из серотипа 19F, защищал 70% животных (р≤0,05), животные, иммунизированные препаратом из серотипа 14, к этому сроку погибли. При увеличении дозы до 50 мкг/мышь в эксперименте выявлена перекрес- тная протективная активность препаратов БсАП, полученных из серотипов 6В, 10А, 14, 19F и 23F от заражения S. pneumoniae серотипа 3 №1156 (табл. 2, опыт II). Подтверждено, что гомологичный БсАП защищал 100% мышей при 90% гибели в контроле. Протективный эффект гетерологичных БсАП различался: препарат из се- ротипа 6В защищал 100% мышей, из серотипа 19F — 90%, а из серотипов 10А, 14 и 23F — 80% животных соответственно (р≤0,05). Смесь БсАП из серотипов 6В, 10А, 14, 19F и 23F в суммарной дозе 50 мкг также защищала 80% мышей (р≤0,05). Аналогичные данные получены при увеличении иммунизирующей дозы до 100 мкг/мышь (табл. 2, опыт III). Повторно изучена перекрестная протективная актив- ность препаратов БсАП, выделенных из серотипов 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36 от зара- жения S. pneumoniae серотипа 3 №1156. Белоксодержащие антигены пневмококка, выделенные из серотипа 3, защищали 90% мышей (р≤0,05), как и гетерологичные БсАП из серотипов 6В и 36 (р≤0,05). В группе животных, получавших препараты из серотипов 10А, 14, 19F и 23F, наблюдалась выживаемость от 60 до 70%, однако статистически значимой разницы между опытом и контролем в этих группах не вы- явлено. В контроле выжило 30 % мышей. В предварительных опытах по изучению активной защиты мышей исследова- на протективная активность БсАП в гомологичной системе. В качестве модельного штамма S. pneumoniae использовали штамм серотипа 3 №3, из которого выделя- ли БсАП и против которого проверяли способность препарата создавать защиту. Установлено, что препарат в иммунизирующих дозах 10, 50 и 100 мкг/мышь при различных заражающих дозах защищал животных от развития пневмококковой ин- фекции. В серии экспериментов на животных получены результаты, подтверждающие гетерологичную защиту. Белоксодержащий антиген пневмококка, полученный из серотипа 19F, защищал 70% мышей при заражении S. pneumoniae серотипа 3 штамм №3, в то время как БсАП, выделенный из серотипа 14, в этом же опы- те не защищал животных. Препараты БсАП, полученные из серотипов 6В, 10А, 14, 19F, 23F, защищали мышей от заражения гетерологичным штаммом №1156 S. pneumoniae серотипа 3. Защита составила 80-100%. Препараты, полученные из серотипов 6В и 36, защищали 90% животных при заражении S. pneumoniae сероти- па 3 штамм №1156, а БсАП, выделенные из серотипов 14 и 19F, обеспечивали вы- живаемость 70% мышей, что оказалось статистически не достоверным, поскольку в контроле выжило 30% животных. Очевидно, разница в результатах зависела от иммунизирующих и заражающих доз. Сорбция БсАП на гидрооксиде алюминия усиливала протективную активность в опытах по изучению гомологичной и гете- рологичной защиты. Эксперименты по определению перекрестной иммуногенной активности БсАП в реакции Оухтерлони и ИФА показали, что большинство препаратов (за исключе- нием БсАП серотипа 10А в реакции преципитации) реагировали с антимикробной кроличьей сывороткой, полученной к 19F серотипу S. pneumoniae. В ИФА с кро- личьей сывороткой, полученной к 14 серотипу S. pneumoniae, взаимодействовали только БсАП 14 и 19F серотипов. В целом, можно сказать, что полученные данные опытов in vitro подтверждаются результатами опытов in vivo. Таким образом, БсАП, выделенные из S. pneumoniae серотипов 6В, 10А, 19F и 36, можно рассматривать как наиболее перспективные для дальнейшего изучения протективной активности отдельных нативных белков, входящих в их состав. В мировой литературе описаны исследования по разработке эксперименталь- ных вакцин на основе рекомбинантных белков пневмококка [11], в частности, пнев- мококкового поверхностного белка А (PspA); пневмолизина (Ply); пневмококкового поверхностного антигена А (PsaA) и других. Поэтому представляет, несомненно, интерес факт обнаружения пневмолизина с помощью моноклональных антител в большинстве выделенных БсАП. Учитывая трудоемкость выделения очищенных нативных белков S. pneumoniae, в дальнейшем планируются работы по получению ключевых рекомбинантных белков для создания отечественной серотипнезависи- мой пневмококковой вакцины.

About the authors

D. S. Vorobyev

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

I. B. Semenova

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Yu. V. Volokh

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

E. E. Romanenko

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

A. P. Baturo

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

N. A. Mikhailova

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

References

Supplementary files