Email this article PROPERTIES OF NATIVE PROTEIN-CONTAINING ANTIGENS OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
- Authors: Vorobyev D.S.1, Semenova I.B.1, Volokh Y.V.1, Romanenko E.E.1, Baturo A.P.1, Mikhailova N.A.1
-
Affiliations:
- НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
- Issue: Vol 96, No 1 (2019)
- Pages: 22-28
- Section: Articles
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/352
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-22-28
- ID: 352
Cite item
Full Text
Abstract
Aim. The study of immunochemical and immunobiological properties of native protein-containing antigens of pneumococcus. Materials and methods. The study was carried out on the strains of the Collective Usage Center «Collection of Mechnikov Res. Inst. for Vaccine and Sera». In the work studied the chemical composition, the molecular weight of the obtained antigens in SDS-electrophoresis and antibody titers in ELISA. Protective activity of protein-containing antigens of pneumococcus was determined in experiments of active protection of mice. Results. Protein-containing antigens of pneumococcus were isolated from S. pneumoniae serotypes 3, 6B, 10A, 14, 19F, 23F and 36. The chemical composition of the preparations contained from 16 to 35% protein. In SDS-electrophoresis in polyacrylamide gel it was established that the molecular weight of protein-containing antigens of pneumococcus ranged from 14 to 116 kDa. Using ELISA shows the cross-activity of native antigens. Virtually all drugs reacted with antimicrobial rabbit serum obtained to serotype 19F (p≤0.05). Serotype serum 14 was less active and only protein-containing pneumococcal antigens obtained from 14 and 19F serotypes (p≤0.05) interacted with it. In the precipitation test according to Ouchterlony it was confirmed that preparations of serotypes 3, 6B, 14, 19F and 36 reacted with rabbit immune serum obtained for S. pneumoniae 19F serotype. In immunoblotting it was found that protein-containing antigens of pneumococcus isolated from serotypes 3, 6B, 10A, 14, 19F and 36 were associated with monoclonal antibodies to pneumococcal protein — pneumolysin. In vivo experiments it was shown that protein-containing antigens of pneumococcus protected animals from intraperitoneal infection of S. pneumoniae in homologous and heterologous systems (p≤0.05). Conclusion. The revealed immunochemical and cross-protective activity of protein-containing antigens of pneumococcus in vitro and in vivo experiments allows to select drugs derived from serotypes 6B, 10A, 19F and 36, as the most promising for further study of the intraspecific protective activity of individual native proteins of pneumococcus.
Full Text
ВВЕДЕНИЕ Проблема инфекций, вызванных Streptococcus pneumoniae, на протяжении не- скольких десятилетий остается актуальной для России [1, 2, 5]. Пневмококк спо- собен вызывать тяжелые инвазивные формы заболеваний среди детей и у взрослых людей [15]. Для профилактики пневмококковых инфекций используют зарубежные полисахаридные и конъюгированные вакцины, создающие защиту против ограни- ченного количества актуальных серотипов S. pneumoniae [5, 7]. При смене клиничес- ки значимых серотипов возбудителя полисахаридные антигены, входящие в состав пневмококковых вакцин, не позволяют создать защиту от невакцинных штаммов пневмококка [11]. Известно, что белки S. pneumoniae наряду с капсулой являются факторами ви- рулентности микроба и, соответственно, принимают участие в патогенезе инфекции и формировании иммунной защиты [3, 6]. Кроме того, пневмококковые белки обла- дают высокой гомологией между собой и, соответственно, могут формировать пере- крестную внутривидовую защиту [9, 11, 14]. Поэтому перспективным направлением является изучение свойств белков пневмококка с целью выявления наиболее имму- ногенных вариантов для создания отечественной серотипнезависимой вакцины. Вакцины, основанные на конъюгации полисахаридных антигенов и гомологич- ных белков, предположительно должны создавать более выраженную защиту против S. pneumoniae по сравнению с существующими вакцинами. Целью настоящей работы явилось исследование иммунохимических и иммуно- биологических свойств нативных белоксодержащих антигенов пневмококка (БсАП). МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы В работе использованы штаммы S. pneumoniae серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36, полученные из ЦКП Коллекция ФГБНУ НИИВС им. И.И.Мечникова. Опыты проводили на мышах линии Balb/c массой 16-18 г, полученных из пи- томника НЦ Биомедицинских технологий, филиал «Андреевка». S. pneumoniae выращивали в сердечно-мозговом бульоне в течение 16-18 ч в СО2- инкубаторе при температуре 370С и 5% содержании углекислого газа. Полученную культуру инактивировали с помощью 0,1 N NaOH, затем ее центрифугировали, отде- ляли осадок клеток из культуральной жидкости и из надосадочной жидкости выделяли БсАП методом ацетонового осаждения. Полученные препараты лиофилизировали. Химический анализ БсАП выполняли с помощью традиционных методов. Для определения общего белка в исследуемых препаратах использовали метод [13], уг- леводы определяли по методу [10], количество нуклеиновых кислот — по методу Спирина. Измерения проводили на спектрофотометре Ultrospec II E, Pharmacia LKB (Швеция). Для характеристики электрофоретической подвижности и опреде- ления молекулярной массы БсАП использовали вертикальный SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях [12]. Иммуноблоттинг проводили по общепринятой методике, используя для анализа моноклональ- ные антитела IgG1 к пневмолизину (100 мкг/мл, Santa Cruz Biotechnology, USA). Специфичность белков оценивали визуально по окрашиванию мембраны. Иммуноферментный анализ проводили согласно методу [8]. Для иммунизации животных использовали БсАП, которые растворяли в физио- логическом растворе без добавления или с добавлением гидроксида алюминия (Sigma, США) из расчета 20 мкг Al(OH)3 на 1 мкг белка. Сорбцию проводили в течение 12 ч при температуре 40С. Белоксодержащие антигены пневмококка вводили внутрибрю- шинно двукратно с интервалом в 14 дней в дозах 10, 30, 50 и 100 мкг/мышь. Через две недели после повторного введения препарата мышей заражали внутрибрюшинно суточной культурой S. pneumoniae в дозе 105 микробных клеток в 0,5 мл физиологи- ческого раствора (штамм №3) и в дозе 104 микробных клеток в 0,5 мл физиологичес- кого раствора (штамм №1156). В качестве контроля служили неиммунизированные мыши. Наблюдение за животными проводили в течение 10-14 дней. Статистическая обработка. Результаты оценивали по выживаемости мышей в течение срока наблюдения, рассчитывая достоверность по методу С.А. Гланца [4]. Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Белоксодержащие антигены пневмококка получали из S. pneumoniae серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36. По химическому составу препараты содержали от 16 до 35% белка, от 1 до 4% углеводов, от 3 до 6% нуклеиновых кислот. В SDS-электрофорезе в полиакриламидном геле с использованием белкового красителя Кумасси R-250 выявили в составе полученных препаратов (серотипы 3, 6В, 10А, 14, 19F и 36) белки с молекулярной массой в диапазоне от 14 до 116 кДа (рис. А).
Рисунок.
SDS-электрофорез БсАП в 12% ПААГ (А) и нитроцеллюлезная мембрана после иммуноблоттинга БсАП (Б). Концентрация БсАП в каждой дорожке составила 5 мг/мл. Дорожки: 1 — БсАП 3 No3; 2 — БсАП 3 No1156; 3 — БсАП 6В; 4 — БсАП 10А; 5 — БсАП 14; 6 — БсАП 19F; 7 — БсАП 36; 8 — маркер молекулярной массы.
В иммуноблоттинге определено, что БсАП, выделенные из S. pneumoniae серо- типов 3, 6В, 10А, 14, 19F и 36, связывались с моноклональными антителами IgG1 к пневмолизину (рис. Б). Это может свидетельствовать о перекрестной активнос- ти пневмолизина, содержащегося в препаратах, полученных из разных серотипов пневмококка. В реакции преципитации по Оухтерлони БсАП серотипов 3, 6В, 14, 19F и 36 в концентрации 1 мг/мл реагировали с кроличьей иммунной сывороткой, получен- ной к серотипу 19F S. pneumoniae, что свидетельствовало о наличии перекрестно- реагирующих антигенов в изучаемых препаратах. С помощью ИФА подтверждена перекрестная антигенная активность БсАП. Практически все препараты выявляли антитела в антимикробной кроличьей сыво- ротке, полученной к 19F серотипу (табл. 1). Отмечено повышение титров антител в 8 раз к БсАП 10А серотипа, в 16 раз к БсАП серотипов 3 (штамм №3), 6В и 36, в 32 раза к БсАП серотипов 14, 19F и 23F (р≤0,05). Исключение составил препарат, выделенный из серотипа 3 (штамм №1156), который выявлял высокий титр антител в контроле. Антимикробная кроличья сыворотка, полученная к 14 серотипу, оказа- лась менее активной, в ней определяли повышение титра антител в 32 раза в гомоло- гичной системе и повышение титра антител в 4 раза к БсАП 19F (р≤0,05). При взаимодействии с моноклональными антителами к пневмолизину БсАП, выделенных из серотипов 19F и 36, наблюдалось повышение титров антител в 4 и 8 раз (табл. 1), соответственно, что свидетельствовало о наличии этого белка в БсАП серотипов 19F и 36. Белоксодержащие антигены пневмококка, полученные из серотипа 3, после двукратной иммунизации мышей с интервалом 14 дней защищали животных от за- ражения 8 LD50 S. pneumoniae серотипа 3 №3 в дозах от 10 до 100 мкг/мышь. Защита составила 80-90 %, а при использовании сорбированного варианта — 100 % выжив- ших (р≤0,05) при 90% гибели мышей в контроле. При большей заражающей дозе (25 LD50 S. pneumoniae) выявлена значимость добавления гидроксида алюминия. SDS-электрофорез БсАП в 12% ПААГ (А) и нитроцеллюлезная мембрана после иммуноблоттинга БсАП (Б). Концентрация БсАП в каждой дорожке составила 5 мг/мл. Дорожки: 1 — БсАП 3 №3; 2 — БсАП 3 №1156; 3 — БсАП 6В; 4 — БсАП 10А; 5 — БсАП 14; 6 — БсАП 19F; 7 — БсАП 36; 8 — маркер молекулярной массы. При иммунизации мышей БсАП в дозах 10 и 50 мкг/мышь защита составила 50% животных. Однако при использовании гидроксида алюминия все испытанные дозы создавали защиту на уровне 80-90% (р≤0,05). Контроль гидроксида алюминия пока- зал, что он не защищал мышей от заражения S. pneumoniae. На следующем этапе изучена протективная активность препаратов БсАП в го- мологичной и гетерологичной системах. Мышей иммунизировали двукратно анти- генами, полученными из S. pneumoniae серотипов 3 №3, 14 и 19F в дозе 30 мкг/мышь с добавлением гидроксида алюминия (табл. 2, опыт I). Полученные результаты сви- детельствовали, что все препараты защищали мышей от заражения S. pneumoniae серотипа 3 штамм №3 на 3 день после заражения, когда отмечалась 100% гибель животных в контроле. Подтвердилась высокая протективная активность БсАП се- ротипа 3 при заражении гомологичным серотипом. Среди БсАП других серотипов более активным оказался препарат серотипа 19F (80% выживших мышей), препарат из серотипа 14 защищал 60 % мышей. При наблюдении в течение 10 дней было вы- явлено, что гомологичный БсАП серотипа 3 защищал 100% мышей, гетерологичный БсАП, выделенный из серотипа 19F, защищал 70% животных (р≤0,05), животные, иммунизированные препаратом из серотипа 14, к этому сроку погибли. При увеличении дозы до 50 мкг/мышь в эксперименте выявлена перекрес- тная протективная активность препаратов БсАП, полученных из серотипов 6В, 10А, 14, 19F и 23F от заражения S. pneumoniae серотипа 3 №1156 (табл. 2, опыт II). Подтверждено, что гомологичный БсАП защищал 100% мышей при 90% гибели в контроле. Протективный эффект гетерологичных БсАП различался: препарат из се- ротипа 6В защищал 100% мышей, из серотипа 19F — 90%, а из серотипов 10А, 14 и 23F — 80% животных соответственно (р≤0,05). Смесь БсАП из серотипов 6В, 10А, 14, 19F и 23F в суммарной дозе 50 мкг также защищала 80% мышей (р≤0,05). Аналогичные данные получены при увеличении иммунизирующей дозы до 100 мкг/мышь (табл. 2, опыт III). Повторно изучена перекрестная протективная актив- ность препаратов БсАП, выделенных из серотипов 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36 от зара- жения S. pneumoniae серотипа 3 №1156. Белоксодержащие антигены пневмококка, выделенные из серотипа 3, защищали 90% мышей (р≤0,05), как и гетерологичные БсАП из серотипов 6В и 36 (р≤0,05). В группе животных, получавших препараты из серотипов 10А, 14, 19F и 23F, наблюдалась выживаемость от 60 до 70%, однако статистически значимой разницы между опытом и контролем в этих группах не вы- явлено. В контроле выжило 30 % мышей. В предварительных опытах по изучению активной защиты мышей исследова- на протективная активность БсАП в гомологичной системе. В качестве модельного штамма S. pneumoniae использовали штамм серотипа 3 №3, из которого выделя- ли БсАП и против которого проверяли способность препарата создавать защиту. Установлено, что препарат в иммунизирующих дозах 10, 50 и 100 мкг/мышь при различных заражающих дозах защищал животных от развития пневмококковой ин- фекции. В серии экспериментов на животных получены результаты, подтверждающие гетерологичную защиту. Белоксодержащий антиген пневмококка, полученный из серотипа 19F, защищал 70% мышей при заражении S. pneumoniae серотипа 3 штамм №3, в то время как БсАП, выделенный из серотипа 14, в этом же опы- те не защищал животных. Препараты БсАП, полученные из серотипов 6В, 10А, 14, 19F, 23F, защищали мышей от заражения гетерологичным штаммом №1156 S. pneumoniae серотипа 3. Защита составила 80-100%. Препараты, полученные из серотипов 6В и 36, защищали 90% животных при заражении S. pneumoniae сероти- па 3 штамм №1156, а БсАП, выделенные из серотипов 14 и 19F, обеспечивали вы- живаемость 70% мышей, что оказалось статистически не достоверным, поскольку в контроле выжило 30% животных. Очевидно, разница в результатах зависела от иммунизирующих и заражающих доз. Сорбция БсАП на гидрооксиде алюминия усиливала протективную активность в опытах по изучению гомологичной и гете- рологичной защиты. Эксперименты по определению перекрестной иммуногенной активности БсАП в реакции Оухтерлони и ИФА показали, что большинство препаратов (за исключе- нием БсАП серотипа 10А в реакции преципитации) реагировали с антимикробной кроличьей сывороткой, полученной к 19F серотипу S. pneumoniae. В ИФА с кро- личьей сывороткой, полученной к 14 серотипу S. pneumoniae, взаимодействовали только БсАП 14 и 19F серотипов. В целом, можно сказать, что полученные данные опытов in vitro подтверждаются результатами опытов in vivo. Таким образом, БсАП, выделенные из S. pneumoniae серотипов 6В, 10А, 19F и 36, можно рассматривать как наиболее перспективные для дальнейшего изучения протективной активности отдельных нативных белков, входящих в их состав. В мировой литературе описаны исследования по разработке эксперименталь- ных вакцин на основе рекомбинантных белков пневмококка [11], в частности, пнев- мококкового поверхностного белка А (PspA); пневмолизина (Ply); пневмококкового поверхностного антигена А (PsaA) и других. Поэтому представляет, несомненно, интерес факт обнаружения пневмолизина с помощью моноклональных антител в большинстве выделенных БсАП. Учитывая трудоемкость выделения очищенных нативных белков S. pneumoniae, в дальнейшем планируются работы по получению ключевых рекомбинантных белков для создания отечественной серотипнезависи- мой пневмококковой вакцины.
About the authors
D. S. Vorobyev
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation
I. B. Semenova
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation
Yu. V. Volokh
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation
E. E. Romanenko
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation
A. P. Baturo
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation
N. A. Mikhailova
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Email: fake@neicon.ru
Москва Russian Federation
References
- Белошицкий Г.В., Королева И.С. Серотиповая характеристика штаммов S. pneumoniae в Москве. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014, 1 (74): 90-97.
- Вишнякова Л.А., Резцова Ю.В., Сологуб Т.С. и др. Этиология острой пневмонии на фоне гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций. Журн. микробиол. 1986, 8: 5-10.
- Воробьев Д.С., Семенова И.Б., Курбатова Е.А. Белки Streptococcus pneumoniae: перспективы создания вакцины против пневмококковой инфекции. Журн. микробиол. 2010, 6: 98-104.
- Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. М., Практика 1999.
- Костинов М.П., Андреева Н.П., Петрова Т.И. Клиническая и эпидемиологическая эффективность вакцинопрофилактики пневмококковой инфекции у детей. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2013, 3: 45-52.
- Костюкова Н.Н., Бехало В.А. Факторы патогенности пневмококка и их протективные свойства. Журн. микробиол. 2014, 3:67-77.
- Харит С.М. Пневмококковые вакцины. Вакцины и вакцинация. Под ред. В.В. Зверева, Б.Ф. Семенова, Р.М. Хаитова. М., ГЭОТАР-Медиа, 2011.
- Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Демин А.А. и др. Иммуноферментный анализ антител к нативной и денатурированной ДНК. Иммунология. 1987, 5: 73-75.
- Chen A., Mann B., Gao G. et al. Multivalent pneumococcal protein vaccines comprising pneumolysoid with epitopes/fragments of CbpA and/or PspA elicit strong and broad protection. Clin. Vaccine Immunol. 2015, 22 (10): 1079-89.
- Dubois K.,Gillers K., Hamilton J. et al. Colorimetric method for the determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 1956, 28 (3): 350-356.
- Feldman C., Anderson R. Review: Current and new generation pneumococcal vaccines. J. Infect. 2014, 69 (4): 309-325.
- Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. Nature. 1970, 227: 680-685.
- Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193: 265-275.
- Tarahomjoo S. Recent approaches in vaccine development against Streptococcus pneumoniae. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2014, 24 (4): 215-27.
- Weiser J.N., Ferreira D.M., Paton J.C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat. Rev. Microbiol. 2018, 16 (6): 355-367.
Supplementary files
