Possibilities and prospects of using biofluorescent proteins at the stage of preclinical evaluation of live vaccines, using the example of the Yersinia pestis vaccine strain EV NIIEG pTURBOGFP-B

Full Text

Введение

В последние годы в биологических и медицинских исследованиях в качестве легко детектируемых маркеров микроорганизмов применяют различные флуоресцентные белки. Одним из таких белков является зелёный флуоресцентный белок GFP (green fluorescent protein), обнаруженный у медузы Aequorea victoria [1, 2]. Преимущества использования белка GFP по сравнению с другими репортерными белками заключаются в его способности флуоресцировать в отсутствие какого-либо кофактора или субстрата, продолжительном сигнале, низкой метаболической токсичности, отсутствии фоновой флуоресценции. На сегодняшний день доступен и успешно используется широкий спектр различных плазмид, сконструированных на основе GFP. Например, коммерческий вектор pTurboGFP-B обеспечивает стабильную экспрессию и быстрое созревание флуоресцентного белка [2].

Сконструированные штаммы Yersinia pestis, продуцирующие GFP, используют при исследовании условий формирования симбиозов с простейшими и/или моделировании взаимодействия с клетками хозяина (млекопитающие — грызуны) [3, 4], с переносчиком (блохи) [5]. Флуоресцентный белок GFP в качестве биосенсора успешно применяется для обнаружения Y. pestis в смешанных культурах, отслеживания бактерий in vitro и in vivo, установления внутриклеточной локализации клеток рекомбинантных штаммов Y. pestis, оценки фагоцитоза Y. pestis макрофагами мышей BALB/c [6–9]. Геномные технологии позволили использовать GFP в качестве молекулярного вектора для разработки вакцин против различных бактериальных и вирусных инфекций человека и животных [1, 10].

Одной из основных задач доклинических исследований при разработке живых вакцин против чумы является определение степени остаточной вирулентности (безвредности) вакцинного штамма чумного микроба по приживаемости и распространяемости в макроорганизме. Традиционно учёт приживаемости живых клеток штаммов чумного микроба проводят бактериологическим методом. Маркирование штаммов Y. pestis флуоресцентными белками открывает новые возможности, позволяющие проводить мониторинг микроорганизмов в условиях in vivo с помощью ряда других методик, к которым относятся люминесцентная микроскопия, обеспечивающая визуализацию возбудителя чумы по наличию специфического флуоресцентного свечения [3, 4], и проточная цитометрия, способствующая определению количества живых микробных клеток по параметрам светорассеяния и интенсивности флуоресценции каждой индивидуальной клетки в суспензии органов [11].

Известно, что эталонный вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ приживается и размножается в органах лабораторных животных, что способствует развитию активного противочумного иммунитета [12]. Одним из наиболее значимых факторов, влияющих на приживаемость возбудителя чумы, способного размножаться в различных условиях, сходных со средой его обитания в теле теплокровных млекопитающих (37°С) и пойкилотермных блох (20–28°С), является температурный [13]. Температурозависимая адаптационная стратегия Y. pestis — существенная часть концепции преодоления бактерией механизмов врождённой иммунологической защиты, таких как фагоцитоз и индукция воспалительного ответа макрофагами и нейтрофилами [13].

Использование различных иммуномодуляторов в схеме противочумной вакцинации позволяет уменьшать антигенную нагрузку на организм, не снижая напряжённости иммунного ответа. Так, азоксимера бромид (АБ) в сочетании с вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ оказывает стимулирующее воздействие на реактивность клеток фагоцитарной системы лабораторных животных, повышает протективную активность живой противочумной вакцины почти в 3 раза и так же, как и интерферон-γ человеческий рекомбинантный (ИЧР), стимулирует антителообразование и цитокиновый ответ [14–16].

С учётом всех вышеперечисленных фактов сделана попытка расширения возможности оценки эффективности и длительности нестерильной фазы иммунного ответа, являющейся обязательным этапом формирования специфического противочумного иммунитета, за счёт использования люминесцентных белков при тестировании различных схем применения живой чумной вакцины.

Цель работы — оценить целесообразность использования биофлуоресцентных белков на примере вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP-B в схемах сочетанного его применения с иммуномодуляторами на этапе доклинической оценки живых вакцин.

Материалы и методы

Для создания штамма, продуцирующего GFP, был использован вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ. Ген, кодирующий синтез TurboGFP, был введён в составе коммерческой векторной плазмиды pTurboGFP-B (4103 п. н., «Evrogen») методом электропорации согласно рекомендациям [17]. Электропорацию выполняли на приборе «Gene Pulser Xсell» («Bio-Rad») с применением стандартного протокола для прокариотических клеток. Наличие коммерческой плазмиды устанавливали по маркеру антибиотикорезистентности, высевая штамм на пластинки агара LB с 50 мкг/мл ампициллина. Колонии просматривали невооружённым глазом, а также на люминесцентном микроскопе «Axio Lab.A1» («Carl Zeiss Microscopy GmbH»), регистрируя интенсивное флуоресцентное свечение в ультрафиолетовой области спектра. Сконструированный рекомбинантный штамм получил обозначение Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP-B (EVGFP) и был депонирован под номером KM 2115 в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора.

Штамм Y. pestis EV НИИЭГ выращивали на агаре LB (рН 7,2), а биофлуоресцентный штамм EVGFP — на агаре LB (рН 7,2) с ампициллином (50 мг/мл) в течение 48 ч при 28°С. Кроме того, использовали культуру клеток EVGFP, обладающую повышенной устойчивостью к лейкоцитарному фагоцитозу [18]. Для этого клетки EVGFP высевали из 2-суточной 28°С культуры в конечной концентрации 1 × 10⁷ КОЕ/мл на бульон LB (рН 7,2) и культивировали в условиях аэрации при 37°C в течение 18 ч. Из культур EVGFP, выращенных при 28°С («EVGFP28») и 37°C («EVGFP37») по стандарту мутности ОСО 42-28-59-85П, готовили взвеси концентрацией 4 × 10⁹ КОЕ/мл.

Экспериментальной моделью служили морские свинки массой 250–350 г, полученные из отдела экспериментальных животных с виварием Российского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора. Животные были распределены на 6 опытных групп по 12 особей в каждой. Морских свинок подкожно иммунизировали штаммом EVGFP, выращенным при 28°С (1–3-я группы) и 37°С (4–6-я группы), в дозе 2 × 10⁹ КОЕ/0,5 мл. Морским свинкам из 2-й и 5-й групп дополнительно за 1 ч до иммунизации подкожно вводили АБ («ПетроваксФарм») в концентрации 60 мкг (EVGFP28+АБ и «EVGFP37+АБ» соответственно). Биомодели 3-й и 6-й групп дополнительно получали ИЧР («Фармаклон») в концентрации 2000 МЕ (ЕVGFP28+ИЧР и EVGFP37+ИЧР соответственно). Контрольную, 7-ю группу составили интактные морские свинки (4 особи). Все манипуляции с животными проводили в соответствии с законодательством Российской Федерации¹ и международными принципами². Эксперименты по иммунизации животных выполняли в соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»³. Программа экспериментальной работы с животными была одобрена Комиссией по биоэтике при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Роспотребнадзора (протокол № 5 от 25.05.2023).

Биохимические свойства Y. pestis изучали с помощью стандартных биохимических тест-стрипов API («bioMérieux SA»).

Морфологию бактериальных клеток оценивали с помощью светового микроскопа «Olympus CX41» («Olympus») и цифровой камеры VZ-C31S («VideoZavr») в программе «VideoZavr v. 1.5» при увеличении × 40 и 100.

Приживаемость штамма EVGFP в органах морских свинок оценивали микроскопическим и проточно-цитометрическим методами. На 1, 4, 7 и 14-е сутки иммуногенеза животных умерщвляли хлороформом, вскрывали и делали мазки-отпечатки внутренних органов (место введения, паховые лимфатические узлы, кровь, селезёнка, печень, лёгкие). Мазки-отпечатки органов животных просматривали в люминесцентном микроскопе «Axio LAB.A1» («Carl Zeiss») с объективом A-Plan 100х/1,25 OiI при увеличении × 1000. Исследовали под микроскопом и фотографировали по 5 полей зрения на препарат. Фотографии получали с помощью камеры «AxioCam ERc5s» («Carl Zeiss»).

Для исследования приживаемости Y. pestis EVGFP с помощью проточной цитометрии общепринятым методом готовили взвесь клеток селезёнки в концентрации 10⁶ клеток/мл в среде RPMI-1640 с гентамицином (100 мкг/мл). Затем к 100 мкл полученной взвеси добавляли 1 мл разведённого в 10 раз (согласно инструкции) «BD FACS Lysing Solution» («BD Biosciences») для лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов и выдерживали образцы в течение 20 мин.

Клеточные суспензии анализировали на проточном цитофлуориметре «СyAn ADP» в программе «Summit v.4.3 Built 2445». Детекцию бактерий EVGFP в фагоцитах (макрофаги и нейтрофилы) селезёнки морских свинок проводили по ранее разработанному протоколу определения показателей фагоцитарной реакции в крови человека и животных с ФИТЦ-меченными клетками Y. pestis EV НИИЭГ [15, 19]. Во взвесях клеток селезёнки фагоциты дифференцировали по параметрам светорассеяния (размеру и степени гранулярности) от лимфоцитов, а затем путём гейтирования фагоцитарной популяции определяли в селезёнке процент флуоресцирующих фагоцитов (макрофаги, нейтрофилы), что соответствовало относительному содержанию активных фагоцитов (ФИ — фагоцитарный индекс, %), поглотивших in vivo живые клетки исследуемого биофлуоресцентного штамма чумного микроба. Среднее количество поглощённых фагоцитами бактерий (ФЧ — фагоцитарное число) оценивали по среднему значению интенсивности их свечения в зелёной области спектра (Mean), измеряемому в условных единицах интенсивности флуоресценции (каналах цитофлуориметра) [14, 19–21].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016», «Statistica 10.0» («StatSoft Inc.»). Данные представляли в виде медианы (Me) и квартилей [Q₂₅; Q₇₅] с расчётом достоверности различий в исследуемых группах с использованием U-критерия Манна–Уитни.

Результаты

Сравнительный анализ культур исходного вакцинного штамма и вакцинного штамма с биофлуоресцентной меткой

Проведено сравнение культурально-морфологических и биохимических свойств рекомбинантного EVGFP и исходного Y. pestis EV НИИЭГ штаммов. Установлено, что рекомбинантный штамм обладал типичной для возбудителя чумы морфологией клеток. Клетки штамма EVGFP, несущие ген флуоресцентного белка GFP, выявляли по наличию зелёного флуоресцентного свечения бактерий. На агаре LB с ампициллином штамм EVGFP формировал характерный R-тип колоний жёлто-зелёного цвета (рис. 1).

 

Рис. 1. R-тип колоний Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP-B, × 40 (а) и × 100 (б).

 

Характерными признаками роста возбудителя чумы в жидкой питательной среде являлись прозрачный бульон и рыхлый, порошковидный или хлопьевидный осадок на дне пробирки, легко распадающийся при встряхивании. На основании проведённого анализа биохимических свойств установлено, что рекомбинантный штамм EVGFP по своим характеристикам не отличался от исходного Y. pestis EV НИИЭГ. Оба штамма ферментировали глюкозу, маннит, арабинозу, не разлагали инозит, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу и амигдалин.

Введение морским свинкам штамма EVGFP в массивной дозе 2 × 10⁹ КОЕ не вызывало гибели биомоделей за весь период наблюдения.

Таким образом, исследуемый штамм EVGFP по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам не отличался от исходного Y. pestis EV НИИЭГ, а также по признаку безвредности соответствовал эталонному вакцинному штамму.

Оценка приживаемости Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP методом люминесцентной микроскопии

При микроскопическом исследовании клетки EVGFP были выявлены в мазках-отпечатках только из места введения культуры во всех группах иммунизированных морских свинок и только в 1-е сутки иммунного ответа (рис. 2).

 

Рис. 2. Детекция клеток биофлуоресцентного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP-B в мазках-отпечатках морской свинки (место введения) на 1-е сутки иммунного ответа при увеличении × 1000. а — изображение в окуляре микроскопа; б — изображение с монитора компьютера.

 

Клетки флуоресцирующего штамма визуализировали в виде ярко-зелёных палочек. Количество бактерий составляло 400 ± 100 м. к. в одном поле зрения, что свидетельствовало об обильном обсеменении клетками EVGFP места введения. При дальнейшем наблюдении на 4, 7 и 14-е сутки иммуногенеза в мазках-отпечатках всех исследуемых органов морских свинок клетки рекомбинантного штамма не регистрировали.

Оценка приживаемости Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP с использованием проточно-цитофлуориметрической технологии

Принимая во внимание тот факт, что нейтрофилы и макрофаги селезёнки являются одними из основных объектов для оценки фагоцитоза и приживаемости Y. pestis [11], целесообразно было для цитометрических исследований использовать клетки селезёнки морских свинок.

 

Рис. 3. Интенсивность флуоресценции фагоцитов селезёнки морских свинок, иммунизированных биофлуоресцентным вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP-B (37°С) в динамике иммунного ответа. а: область R1 соответствует общему количеству фагоцитов FS/SS dot plot образца клеток селезёнки морской свинки, привитой исходным вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ (контроль). Представлено характерное распределение отдельных фагоцитов селезёнки по размеру (FS) и по степени гранулярности (SS). Фагоциты селезёнки (28,91% клеток) локализуются в области R1 цитограммы. Активные фагоциты локализуются на гистограммах в области R4: б–д: 1, 4, 7 и 14-е сутки соответственно после иммунизации морских свинок Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP-B (37°С).

 

По интенсивности сигнала флуоресценции белка GFP определяли присутствие EVGFP в популяции фагоцитов селезёнки (макрофаги и нейтрофилы), а также учитывали показатели фагоцитарной реакции in vivo. Гистограммы на рис. 3, б–д демонстрируют динамику снижения в селезёнке относительного числа фагоцитов, характеризующихся интенсивной зелёной флуоресценцией, обусловленной поглощением клеток штамма EVGFP, выращенного при 37°С.

На рис. 3 наглядно видно, что в интервале от 1-х до 4-х суток доля флуоресцирующих фагоцитов снижалась с 94,54 до 21,23%, а к 14-м суткам — до 0, т. е. до значений, характерных для фагоцитов селезёнки интактных (контрольных) животных, не обладающих флуоресцентным свечением в зелёной области спектра (рис. 3, е).

Сравнительная оценка влияния иммуномодулирующих препаратов при сочетанном применении с биофлуоресцентным штаммом и условий его культивирования на фагоцитарную активность клеток селезёнки

На следующем этапе проводили анализ эффективности применения препаратов на исход взаимодействия исследуемого штамма EVGFP с фагоцитами селезёнки морских свинок в условиях in vivo. На 4-е сутки иммуногенеза установлено достоверное снижение ФИ в группе EVGFP28+ИЧР по сравнению с аналогичным показателем в группе EVGFP28 (таблица).

 

Детекция биофлуоресцентного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP в фагоцитах селезёнки морских свинок при иммунизации в сочетании с иммуномодуляторами по данным проточной цитометрии, Ме [Q₂₅; Q₇₅]

Группа	Схема иммунизации	Сутки	Фагоцитарный индекс, %	Фагоцитарное число
1	EVGFP28	1	89,2 [83, 0; 95, 4]	19,3 [17, 0; 21, 5]
		4	19,8 [16, 6; 22, 0]	12,6 [11, 8; 13, 4]
		7	0,07 [0; 0, 1]	1,6 [0, 9; 2, 3]
		14	0	0,7 [0, 5; 0, 8]
2	EVGFP28+АБ	1	99,1 [98, 0; 99, 4]	24,8 [20, 7; 28, 9]
		4	17,5 [15, 4; 19, 6]	19,2 [17, 5; 20, 9]*
		7	0,02 [0; 0, 05]	10,0 [8, 9; 11, 2]*
		14	0	0
3	EVGFP28+ИЧР	1	97,4 [95, 5; 99, 4]	22,1 [18, 0; 26, 2]
		4	9,0 [8, 4; 9, 6]*	18,2 [15, 7; 20, 8]
		7	0,06 [0; 0, 1]	8,7 [7, 9; 9, 5]*
		14	0	1,5 [1, 3; 1, 7]
4	EVGFP37	1	92,5 [87, 8; 97, 2]	19,6 [16, 2; 23, 0]
		4	21,2 [18, 4; 24, 0]	20,1 [15, 4; 24, 8]#
		7	0,1 [0, 05; 0, 20]	10,0 [8, 3; 11, 7]
		14	0,1 [0, 05; 0, 20]	1,0 [0, 9; 1, 1]
5	EVGFP37+АБ	1	98,5 [96, 8; 99, 2]	25,2 [20, 0; 30, 4]
		4	37,1 [37, 0; 41, 2]*#	17,5 [14, 4; 20, 6]
		7	0,2 [0, 1; 0, 3]	10,7 [8, 1; 13, 3]
		14	0	0,3 [0, 1; 0, 5]
6	EVGFP37+ИЧР	1	90,6 ± 5,2 [85, 4; 95, 8]	21,6 [17, 1; 26, 2]
		4	19,4 [17, 6; 21, 2]#	21,9 [18, 0; 25, 8]
		7	0,5 [0, 2; 0, 8]	10,5 [8, 4; 12, 6]
		14	0,2 [0, 1; 0, 3]	2,3 [1, 9; 2, 7]
7	Контроль (EV)		0	0

Примечание. * — значимые различия с группами 1 и 4 на соответствующие сутки (р < 0,05); ^# — значимые различия между группами 1 и 4, 2 и 5, 3 и 6 на соответствующие сутки (р < 0,05).

 

В группе EVGFP37+ИЧР показатель ФИ регистрировали на уровне аналогичного показателя в группе EVGFP37. В те же сроки (4-е сутки) в группе EVGFP37+АБ ФИ достоверно повышался (p < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем в группе EVGFP37. Выявлено достоверное увеличение показателя ФЧ в группе EVGFP28+АБ на 4-е и 7-е сутки, а в группе EVGFP28+ИЧР на 7-е сутки в сравнении с данным показателем в группе EVGFP28 (p < 0,05).

Далее определяли влияние температуры культивирования EVGFP на способность фагоцитов селезёнки морских свинок поглощать и переваривать клетки флуоресцентного штамма. В группах EVGFP37+АБ и EVGFP37+ИЧР на 4-е сутки показатели ФИ в 2 раза превышали (p < 0,05) аналогичные показатели в группах EVGFP28+АБ и EVGFP28+ИЧР соответственно. В группе EVGFP37 на 4-е сутки показатель ФЧ превосходил в среднем в 1,5 раза (p < 0,05) аналогичный показатель в группе EVGFP28.

Обсуждение

Доклинический этап оценки живых противочумных вакцин должен не только продемонстрировать, что вакцина является иммуногенной и обладает протективной эффективностью, но также обосновать безопасность препарата, связанную в первую очередь, со степенью остаточной вирулентности (безвредности) вакцинного штамма чумного микроба, характеризуемой его способностью к распространению и длительной персистенции в органах биомоделей.

Приживаемость клеток биофлуоресцентного штамма изучали в органах морских свинок микроскопическим и проточно-цитометрическим методами в течение 14 сут, что соответствует допустимому периоду размножения клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, обусловливающему иммунологическую перестройку организма (нестерильная фаза иммунитета) [12].

Метод люминесцентной микроскопии — один из основных оптических методов флуоресцентной визуализации [22] — позволяет наглядно и эффективно оценивать этапность распространения вирулентных штаммов в органах и тканях белых мышей [4]. В наших исследованиях установленная визуализация EVGFP в мазках-отпечатках из места введения культуры во всех опытных группах в 1-е сутки иммунного ответа согласуется с результатами ранее проведённых количественных бактериологических исследований, при которых наибольшее количество клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ обнаруживали в месте введения (2,3 × 10⁷ м.к./г) через 24 ч [12].

Отсутствие флуоресцентных микробных клеток на 4, 7 и 14-е сутки иммуногенеза связано, вероятно, с низкой концентрацией EVGFP в мазках-отпечатках (˂ 10⁵ м.к./мл), лежащей за пределами нижнего порога чувствительности люминесцентной микроскопии, составляющего 10⁵ м.к./мл [23].

Новые возможности открыло использование более чувствительной и производительной технологии проточно-цитофлуориметрического анализа, позволяющей контролировать in vivo выживаемость бактерий в фагоцитах, а также отслеживать их распространение в организме хозяина в динамике [11, 24]. Фагоциты, содержащие флуоресцентные бактериальные клетки, регистрировались в течение 4 сут. Снижение числа флуоресцирующих фагоцитов (к 4-м суткам в среднем в 4,4 раза по сравнению с 1-ми сутками) могло быть связано как с внутриклеточным перевариванием поглощённых бактерий, так и со снижением поглотительной способности фагоцитов по отношению к чумным микробам, находящимся в активной стадии роста in vivo при температуре организма хозяина. Внутриклеточную локализацию EVGFP в макрофагах и нейтрофилах селезёнки подтверждали аналогичные результаты, полученные зарубежными учёными методом проточной цитометрии в опытах с другим флуоресцентным штаммом Y. pestis (pAGFP), экспрессирующим GFP [11]. Применявшаяся нами процедура пробоподготовки (Lyse/No-wash) без отмывки спленоцитов от лизирующего эритроциты и фиксирующего лейкоциты раствора «FACS Lysing Solution» фактически полностью исключала адгезию бактерий на клеточной поверхности, т. к. растворы, используемые для лизиса эритроцитов, удаляют бактерии, адсорбированные на поверхности фиксированных формальдегидом лейкоцитов [19].

Применение биофлуоресцентного штамма и проточной цитофлуориметрической технологии позволило зарегистрировать различный эффект используемых в работе иммуномодулирующих препаратов по влиянию на исход взаимодействия исследуемого штамма EVGFP с фагоцитами селезёнки морских свинок.

Полученные данные по сочетанному применению АБ с вакцинным штаммом, основанные на анализе фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов селезёнки морских свинок в нашем эксперименте, подтвердили ранее выявленный факт стимулирующего действия АБ на фагоцитарную активность лейкоцитов крови мышей линии BALB/c по отношению к Y. pestis EV НИИЭГ в тестах in vitro [15].

Согласно данным литературы об иммунологическом сходстве в паттернах генетической экспрессии IFN-γ и гомологии аминокислотной последовательности между морской свинкой и человеком [25, 26], ИЧР оказывал иное влияние на процесс фагоцитоза, снижая показатель ФИ и повышая показатель ФЧ (количество микробных клеток на один фагоцит) при 28°С. Объяснить это повышение может предположение о способности ИЧР ингибировать внутриклеточное переваривание бактерий в фагоцитах. Однако такому объяснению противоречит известная способность рекомбинантного IFN-γ активировать макрофаги и вызывать гибель внутриклеточных микроорганизмов [27]. Следовательно, этот факт объясняется влиянием ИЧР на свойства вакцинного штамма, приводящие к снижению его приживаемости в макроорганизме.

В опытах с использованием для вакцинации культур биофлуоресцентного штамма, выращенных в разных температурных режимах, подтверждён известный факт о более длительном выживании и переваривании клеток 37°С культуры Y. pestis в макрофагах [28, 29], связанный с индукцией экспрессии Caf1 (F1) и других антифагоцитарных факторов, блокирующих фагоцитоз: белок наружной мембраны Ail, активатор плазминогена Pla, PsaA (рН6 антиген) [11, 30, 31].

Заключение

На примере применения биофлуоресцентного вакцинного штамма Y. pestis EVGFP и метода проточной цитометрии показана возможность повышения эффективности оценки приживаемости в макроорганизме штаммов, а использование цитофлуориметрической технологии увеличивает её информативность и объективность, в том числе за счёт скорости выполнения такого анализа, позволяющего выполнять дополнительные исследования, раскрывающие механизмы взаимодействия микро- и макроорганизма.

 

 

***

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23.07.2010). Протокол исследования одобрен на заседании Комиссии по биоэтике Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол № 5 от 25.05.2023).

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке бюджетного финансирования в рамках темы НИР № 123122100020-4.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Клюева С.Н. — методология и дизайн исследования, проведение экспериментов, микроскопические исследования, статистический анализ, написание рукописи; Буданова А.А. — конструирование рекомбинантного биофлуоресцентного штамма, микроскопические исследования; Кравцов А.Л. — методология и дизайн исследования, проведение экспериментов, научное редактирование рукописи; Бугоркова С.А. — концепция и дизайн исследования, научное редактирование рукописи, руководство. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям Международного комитета редакторов медицинских журналов, внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Ethics approval. The authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with the Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, 07/23/2010). The study protocol was approved at a meeting of the Bioethics Commission of the Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe" (protocol No. 5 of May 25, 2023).

Funding source. The study was supported by budget funding within the framework of the research topic No 123122100020-4.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Author contribution: Klyueva S.N. — study methodology and design, experiments, microscopic studies, statistical analysis, manuscript writing; Budanova A.A. — construction of recombinant biofluorescent strain, microscopic studies; Kravtsov A.L. — study methodology and design, experiments, manuscript editing; Bugorkova S.A. — study concept and design, manuscript editing, management. All authors confirm that they meet the International Committee of Medical Journal Editors criteria for authorship, made a substantial contribution to the conception of the article, acquisition, analysis, interpretation of data for the article, drafting and revising the article, final approval of the version to be published.

 

¹ Приказ Минздрава России № 199Н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», 2016.

² Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, 2010.

³ Зарегистрировано в Минюсте России 15.02.2021 № 62500.

About the authors

Svetlana N. Klyueva

Russian Anti-Plague Institute "Microbe"

Author for correspondence.
Email: klyueva.cvetlana@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5550-6063

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Department of immunology

Россия, Saratov

Angelina A. Budanova

Russian Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: klyueva.cvetlana@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5092-432X

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Department of immunology

Россия, Saratov

Aleksandr L. Kravtsov

Russian Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: kravzov195723@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9016-6578

Sci. (Biol.), leading researcher, Department of immunology, Russian Anti-Plague Institute "Microbe"

Россия, Saratov

Svetlana A. Bugorkova

Russian Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: klyueva.cvetlana@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7548-4845

Sci. (Med.), chief researcher, Department of immunology, Russian Anti-Plague Institute "Microbe"

Россия, Saratov

References

Supplementary files