Dynamics of enzymatic activity in primary culture of Syrian hamster adherent leukocytes ex vivo infected with SARS-CoV-2

Full Text

Введение

Коронавирус тяжёлого острого респираторного синдрома 2-го типа (SARS-CoV-2 — severe acute respiratory coronavirus 2) (Nidovirales: Coronaviridae, Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus) является этиологическим агентом коронавирусного заболевания 2019 г. (COVID-19), пандемия которого (2020–2023 гг.) стала самой продолжительной и одной из наиболее смертоносных среди острых респираторных заболеваний в новейшей истории человечества [1]. После окончания пандемического периода SARS-CoV-2 не исчез из человеческой популяции, а превратился в одну из составляющих в структуре сезонного подъёма заболеваемости острыми респираторными заболеваниями [2]. По этой причине изучение патогенеза SARS-CoV-2-инфекции не теряет своей актуальности, ряд аспектов этого процесса изучен недостаточно полно. В связи с этим особый интерес вызывает процесс взаимодействия вируса с клетками периферической крови, в частности, с клетками врождённого иммунитета — нейтрофилами и моноцитами.

В доступной литературе изложены теоретические предположения о возможной способности вируса SARS-CoV-2 инфицировать нейтрофилы. Так, N. Rong и соавт. сообщили о рецепторе CD147, альтернативном рецептору ACE2, который обусловливает тропизм вируса, экспрессируется в нейтрофилах здоровых доноров и активируется у пациентов с COVID-19 [3]. Другим неканоническим рецептором является лектиновый рецептор С-типа, который опосредует образование нейтрофильных внеклеточных ловушек при COVID-19 [4]. Исходя из этого можно сделать предположение о том, что вирус способен непосредственно влиять на лейкоциты крови.

Описанные нами ранее морфологические изменения лейкоцитов периферической крови также свидетельствуют об их значительном вовлечении в процесс SARS-CoV-2-инфекции [5–8]. Однако в научной литературе отсутствует подробная информация о характере и динамике ферментативной активности лейкоцитов при инфицировании данным вирусом. Имеются отдельные сообщения об изменениях активности миелопероксидазы (МПО) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови пациентов с диагнозом COVID-19, причём выраженность этих изменений коррелирует с тяжестью основного заболевания [9–11]. По этой причине необходимо изучить не только морфологические, но и морфофункциональные изменения в комплексе с целью суждения о метаболических процессах клеток врождённого иммунитета под влиянием SARS-CoV-2.

Целью данной работы является определение ферментативной активности лейкоцитов периферической крови сирийских хомячков в динамике SARS-CoV-2-инфекции ex vivo, характеризующей микробицидный потенциал клеток врождённого иммунитета.

Материалы и методы

Первичную адгезивную культуру лейкоцитов сирийского хомячка (Mesocricetus auratus) получали из крови 15 особей в возрасте 4 мес и массой около 100 г. Все процедуры с животными выполняли строго в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, от 18.03.1986. Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова Роспотребнадзора (протокол № 2 от 16.05.2024).

Кровь собирали из сердца в стеклянные пробирки с добавлением в каждую гепарина из расчёта 5 ЕД/мл. Пробирки помещали в термостат под углом 45° при 37°С на 1 ч, после чего осторожно удаляли верхний слой плазмы, а лейкоцитарную плёнку отбирали, доводили до концентрации 2 × 10⁶ клеток/мл питательной средой 199 («БиолоТ») и разносили по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета («TFS»), который помещали в термостат (5% СО₂, 37°С) на 40 мин; затем среду с неадгезированными клетками удаляли и лунки трижды промывали 150 мкл среды 199.

Количество живых адгезированных клеток в лунке определяли с помощью инвертированного микроскопа «МИБ-Р» («ЛОМО»), оснащённого цифровой камерой МС-8.3 С («ЛОМО»). С помощью программы MCView («LOMO-Microsystems») площадь поля зрения, не включающего край лунки, выставляли равной 0,26 мм², подсчитывали в ней число (n) живых (прикреплённых с целостной внешней мембраной) клеток; пересекающие внешнюю границу клетки учитывали на левой/верхней гранях квадрата поля зрения и не учитывали на правой/нижней гранях. Поскольку общая площадь лунки равна 35 мм², то общее количество клеток в лунке (N) оценивали по формуле:

$N\approx n \times \frac{\mathrm{35,00}м{м}^2}{\mathrm{0,26}м{м}^2}\approx \mathrm{134,62} \times n$.                                                                        (1)

Итоговую оценку количества живых клеток в каждой лунке производили по 10 случайно выбранным полям зрения.

Инфицирование первичной культуры адгезивных лейкоцитов сирийского хомячка ex vivo осуществляли путём внесения в лунки с монослоем клеток 100 мкл среды 199 с рабочим разведением супернатанта клеточной культуры Vero E6, инфицированной SARS-CoV-2 (в контрольные образцы — без вируссодержащего супернатанта) и последующей инкубацией 1 ч при 37°С, после чего проводили трёхкратную промывку и заполнение лунок средой для культивирования, содержащей среду 199 с 15% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) и 0,004% гентамицина К («БиолоТ»). Были использованы две инфицирующие дозы: 3 lg (ТЦД₅₀/мл) и 2 lg (ТЦД₅₀/мл), где ТЦД₅₀ — это 50% тканевая цитопатическая доза для линии клеток почки африканской зелёной мартышки (Chlorocebus sabaeus, ♀) (Vero E6).

Штамм SARS-CoV-2/Vladivostok/R-8726/2021 был получен из Коллекции патогенных микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова. Данный штамм относится к генотипу Delta (AY.121) (VGARus ID: prim000041; GenBank ID: OQ318430; GISAID ID: EPI_ISL_16643370) и был выделен из назофарингеального смыва больного COVID-19 в декабре 2021 г. на модели клеточной линии Vero E6 [2].

Индикацию РНК SARS-CoV-2 осуществляли с помощью метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с использованием набора реагентов «ОТ-ПЦР-РВ-SARS-CoV-2» («Синтол»). РНК выделяли с использованием комплекса реагентов «М-Сорб-НК» («Синтол»). Все манипуляции осуществляли согласно протоколам производителя. Пороговый цикл (threshold cycle, С_Т) ОТ-ПЦР-РВ рассматривали как полуколичественную характеристику содержания вирусных частиц в среде: чем выше их содержание, тем ниже С_Т. Отсутствие вируса соответствовало С_Т ≥ 36.

Активность аденозинтрифосфатазы (АТФазы) и аденозинмонофосфатазы (АМФазы) определяли после двукратной отмывки адгезированных лейкоцитов ростовой средой без ЭТС путём внесения в лунки планшета 50 мкл субстрата для АТФазы (8 мг/мл аденозин-5′-трифосфата в 10-кратно разведённом трис-HCl-буфере, рН 7,8, содержащем 87 мг NaCl, 28,7 мг KCl, 5,2 мг MgCl₂ × 6 H₂O) и для АМФазы (4 мг/мл аденозин-5′-монофосфата в таком же буферном растворе, содержащем 87 мг NaCl и 70 мг MgCl₂). Образцы оставляли при 37°С на 30 и 60 мин соответственно. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1 : 1. Через 20 мин поглощение растворов измеряли¹ при длине волны 620 нм [12].

Активность ЛДГ и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) определяли после двукратной отмывки адгезированных лейкоцитов ростовой средой без ЭТС путём внесения в лунки планшета 100 мкл раствора йодонитротетразолия («ICN») — для ЛДГ и бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиума («ICN») — для СДГ 2 мг/мл в фосфатном буфере рН 7,2 с 0,4% MnCl₂ и инкубировали 30 мин при 37°С; затем среду удаляли и монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса рН 7,2. Внутриклеточные гранулы диформазана растворяли в 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HCl. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм (для ЛДГ) и 540 нм (для СДГ) [12].

Активность МПО и цитохромоксидазы (ЦХО) определяли после двукратной отмывки адгезированных лейкоцитов ростовой средой без ЭТС путём внесения в лунки планшета 100 мкл раствора ортофенилендиамина («Merck») 0,4 мг/мл — для МПО и 3,3′-диаминобензидина («Merck») 2 мг/мл — для ЦХО в фосфатно-цитратном буфере рН 5,0 с 0,033% H₂O₂ и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 10% раствора серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм [12].

Вирусную нагрузку в динамике SARS-CoV-2-инфекции устанавливали полуколичественным методом на основе изменения порогового цикла в ОТ-ПЦР-РВ (C_T(0)), через 1 ч (C_T(1)) — в вируссодержащей жидкости после контакта с клетками; 16 ч (C_T(16)), 24 ч (C_T(24)) и 48 ч (C_T(48)) — в ростовой среде инфицированных клеток.

Ферментативную активность клеток под действием SARS-CoV-2-инфекции определяли через 1, 16, 24, 48 ч после инокуляции вируса (п.и.в.) путём сравнения отношений удельных (в расчёте на 1 клетку) ферментативных активностей инфицированных и неинфицированных клеток: для каждого момента времени t вычисляли коэффициент изменения удельной ферментативной активности γ(t) по формуле:

$\gamma \left(t\right)=\frac{\tilde{D}\left(t\right)}{\tilde{z}\left(t\right)}\times \frac{z\left(t\right)}{D\left(t\right)}$,                                                                                                       (2)

где учтены оптическая плотность и количество живых клеток для неинфицированного (D(t) и z(t)) и инфицированного (D~(t) и z~(t)) образцов соответственно [13, 14]. Разумеется, имеет место априорное равенство:

$\gamma \left(t\right) = 1$.                                                                                                                           (3)

Статистическая обработка результатов основывалась на том, что в каждый момент времени t для каждого из 6 ферментов измерения осуществляли в 3 лунках с неинфицированными клетками и в 3 лунках с инфицированными клетками. Для этого в начале производили удаление поддерживающей среды, чтобы после промывки внести среды с соответствующими субстратами. Пронумеруем ферменты в произвольном порядке, используя индекс f = 1, 2, …6. Тогда в каждый момент времени t имеется 6 × 3 = 18 образцов вируссодержащей жидкости: C_Tjf(t), j = 1, 2, 3. При этом C_Tjf(1) представляли собой вирусную нагрузку в образцах в результате накопления вируса в среде de novo: после того как исходная вируссодержащая жидкость C_Tjf(0) в течение 1 ч находилась в контакте с клетками; C_Tjf(16), C_Tjf(24) и C_Tjf(24). Таким образом, для t = 1, 16, 24, 48 ч выборочное среднее <C_T(t)> и стандартное отклонение выборочного среднего m_CT определяются по стандартным формулам в следующей модификации:

$⟨C_T\left(t\right)⟩=\frac{1}{18}\times \sum _{f=1}^6\sum _{j=1}^3{C}_{Tjf}\left(t\right)$;                                                                              (4)

$m_{C_T}=\frac{1}{3\sqrt{34}}\times {\left(\sum _{f=1}^6\sum _{j=1}^3{(C_{Tjf}\left(t\right)-⟨C_T\left(t\right)⟩)}^2\right)}^{1/2}$.                                               (5)

Исходный образец был в единственном экземпляре, и его вирусную нагрузку характеризовало единственное значение C_T(0).

После проведения химических реакций, которые катализируются изучаемыми ферментами, измеряли оптическую плотность в 3 лунках с неинфицированными клетками (D_i(t), i = 1, 2, 3) и в 3 лунках с инфицированными (D~_j(t), j = 1, 2, 3) клетками. Перед этим в каждой лунке измеряли количество живых клеток: z_i(t) (i = 1, 2, 3) и z~_j(t) (j = 1, 2, 3). Оценку каждого значения z_i(t) и z~_j(t) осуществляли по 10 полям зрения в соответствии с (1)²: z_ik(t), k = 1, 2, …10 и z~_hk(t), h = 1, 2, …10. При этом все измерения D_i(t), z_ik(t), D~_j(t), z~_jh(t) при любых значениях коэффициентов независимы и равноправны. Существует 30 значений дроби D~_j(t)/z~_jh(t), 30 значений дроби z_ik(t)/D_i(t) и 900 вариантов их произведений вида (2), т. е. выборкa состоит из 900 значений γ(t). Поэтому выборочное среднее <γ(t)> и стандартное отклонение выборочного среднего m_γ(t) рассчитывали по стандартным формулам, модифицированным для данного случая:

$⟨\gamma \left(t\right)⟩=\frac{1}{900}\times \sum _{j=1}^3\sum _{k=1}^{10}\sum _{j=1}^3\sum _{h=1}^{10}\frac{{\tilde{D}}_j\left(t\right)}{{\tilde{z}}_{jh}\left(t\right)}\frac{z_{ik}\left(t\right)}{D_i\left(t\right)};$                                                         (6)

$m_{\gamma \left(t\right)}=\frac{1}{30\sqrt{899}}\times {\left(\sum _{j=1}^3\sum _{k=1}^{10}\sum _{j=1}^3\sum _{h=1}^{10}{\left(\frac{{\tilde{D}}_j\left(t\right)}{{\tilde{z}}_{jh}\left(t\right)}\times \frac{z_{ik}\left(t\right)}{D_i\left(t\right)}-⟨\gamma \left(t\right)⟩\right)}^2\right)}^{1/2};$               (7)

Достоверность различий между выборками из 900 значений для значений времени — γ(t₁) и γ(t₂), а также между выборками из 18 значений для значений времени С_Т(t₁) и С_Т(t₂), где t₁ = 1, 16, 24, 48 ч, t₂ = 1, 16, 24, 48 ч, t₁ ≠ t₂, оценивали с помощью критерия Манна–Уитни–Вилкоксона. Этот непараметрический критерий не требует априорных предположений о функции распределения случайных величин, реализацией которых являются значения γ(t) и С_Т(t). Достоверной считалась оценка при вероятности реализации альтернативной гипотезы р ≤ 0,05.

Результаты

Содержание SARS-CoV-2 в ростовой среде культуры адгезивных лейкоцитов показано на рис. 1 (здесь и далее следует иметь в виду, что большему значению С_Т соответствует меньшее содержание вируса в исследуемом образце). В течение 1-го часа п.и.в., когда имел место контакт вируссодержащей жидкости с клетками, происходило их инфицирование. После удаления вируссодержащей жидкости новые частицы в среде накапливались в результате репликации вируса в заражённых клетках. Учитывая тот факт, что это разные этапы инфекционного процесса, на динамических кривых рис. 1 сделан разрыв.

 

 

Рис. 1. Динамика вирусной нагрузки: меньшим значениям С_Т соответствуют более высокие значения концентрации вирионов, и наоборот.
В течение 1-го часа после инокуляции вируса концентрация вирионов падает вследствие их проникновения в клетки-мишени. После этого происходит смена среды и начинается накопление de novo дочерних вирионов, продуцируемых инфицированными клетками. *р ≤ 0,05 по сравнению со значением С_Т в предыдущий момент времени.

 

Через 1 ч п.и.в. (к окончанию процесса заражения) активность АТФазы адгезивных лейкоцитов под действием SARS-CoV-2-инфекции ex vivo дозозависимым образом снизилась относительно неинфицированного контроля (γ(1) < 1), но затем начала также дозозависимо повышаться: γ(16) ~ 1; γ(24) ≈ 1,2; γ(48) ≈ 1,6 (рис. 2, а). Возрастание АТФазной активности в период 16–48 ч было почти линейным при незначительном, но воспроизводимом превышении активности для дозы 3 lg(ТЦД₅₀) по сравнению с 2 lg(ТЦД₅₀).

 

Рис. 2. Изменения активности ферментов в результате инфекции SARS-CoV-2: АТФазы (а); АМФазы или 5’-нуклеотидазы (б); ЛДГ (в); СДГ (г); МПО (д); ЦХО (е).
По осям ординат — γ; по осям абсцисс — время после заражения, ч. *р ≤ 0,05 по сравнению со значением γ в предыдущий момент времени.

 

Активность АМФазы в процессе инфекции (рис. 2, б) изменялась иначе, нежели активность АТФазы. В начальный период инфекции уровень 5′-нуклеотидазы быстро повысился по сравнению с неинфицированным контролем и держался на этом уровне по меньшей мере 16 ч п.и.в., затем снижался к 24 ч (γ(24) ≈ 0,8 для обеих заражающих доз) и медленно возрастал в течение последующих 24 ч (γ(48) ~ 1).

Изменения активности ЛДГ (рис. 2, в) и СДГ (рис. 2, г) в процессе инфекции были аналогичны: сначала небольшой резкий рост (γ(1) ≈ γ(16) ≈ 1,2), затем возвращение к значению активности неинфицированного контроля (γ(24) ~ 1) и возрастание в течение последующих 24 ч (γ(48) ≈ 1,8). Снижение активности дегидрогеназ через 24 ч после инфицирования воспроизводится во всех случаях и, скорее всего, имеет дозозависимый характер (наиболее выраженный для СДГ).

Активность МПО в инфицированных клетках дозозависимым образом быстро снижалась по сравнению с неинфицированным контролем уже в течение 1 ч п.и.в. (рис. 2, д) и восстанавливалась к прежнему уровню через 24 ч (γ(24) ~ 1), после чего возрастала (γ(48) ≈ 1,4).

Активность ЦХО сначала дозозависимо снижалась (рис. 2, е), но затем возвращалась к уровню неинфицированного контроля уже через 16 ч п.и.в. (γ(16) ≈ γ(24) ≈ 1,0), после чего возрастала до γ(48) ≈ 1,2 для дозы 2 lg(ТЦД₅₀) и до γ(48) ≈ 1,4 для дозы 3 lg(ТЦД₅₀).

Обсуждение

Сирийские хомячки (Mesocricetus auratus) являются удобной экспериментальной моделью для воспроизведения коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 [1, 16, 17]. В данной работе мы использовали инфицирование ex vivo культуры адгезивных лейкоцитов, которая содержит основную фракцию нейтрофилов, претерпевающих комплекс морфофункциональных изменений при контакте с инфекционными агентами [18]. Нейтрофилы — важное звено врождённого иммунитета, являются достаточно короткоживущими лейкоцитами, и уже через 48 ч их адгезивная популяция быстро истощается (это, в частности, определяет выбранную нами продолжительность эксперимента).

Известно, что АМФаза (5′-нуклеотидаза) и АТФаза активно вовлекаются в процесс пространственного преобразования плазматической мембраны нейтрофилов при хемотаксисе [18, 19]. В частности, 5′-нуклеотидаза является регулятором уровня циклического АМФ, который обеспечивает передачу сигналов от плазмалеммы внутрь клетки и регулирует образование внеклеточного аденозина, который через специфические рецепторы опосредует цитозащиту и разнообразные физиологические эффекты (подавление воспаления, вазодилатацию, ингибирование тромбоза, антиадренергию и др.) [20]. При повреждении клетки повышается содержание АМФ и понижается — АТФ [21, 22]. Соответственно, увеличение активности АМФазы и снижение активности АТФазы было зафиксировано в течение первых 16 ч п.и.в. Ранние этапы повреждения коронавирусами клеток-мишеней связаны с рецептор-опосредованным слиянием вирус-клеточных мембран и формированием в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме инфицированной клетки специальных цистерн, в которых происходит сборка вирионов [23, 24]. Монотонное возрастание активности АТФазы, начиная примерно с 16 ч п.и.в., связано с активным синтезом вирусных белков (как структурных, так и регуляторных) и вирусспецифических РНК. Повторное возрастание активности АМФазы позже 24 ч п.и.в. (рис. 2, а, б), по-видимому, отражает процесс вторичного инфицирования лейкоцитов (в том числе в результате синцитиеобразования).

ЛДГ представляет собой цинксодержащий внутриклеточный фермент, который катализирует окисление молочной кислоты в пируват, принимает участие в обмене глюкозы, содержится практически во всех клетках организма и высвобождается при их повреждении [25]. Поэтому уровень сывороточной ЛДГ надёжно маркирует уровень неблагоприятных последствий воспалительных реакций и других патологических процессов. В частности, выявлена информативность уровня сывороточной ЛДГ для оценки клинической тяжести и мониторинга ответа на лечение при пневмонии у пациентов с COVID-19 [26]. СДГ относится к кофермент-независимым флавипротеинам и входит в мембраносвязанную дыхательную цепь мембран. Флавиновая группа этого фермента содержит 4 атома железа и ковалентно связана с белком, а ферментативная активность СДГ зависит от SH-групп [25]. СДГ млекопитающих не только участвует в образовании энергии в митохондриях, но также играет роль в чувствительности клетки к кислороду [27]. Дегидрогеназная активность инфицированных клеток сначала возрастает вследствие стимуляции вирусом репликационных процессов, а затем снижается в результате вирусиндуцированной цитодеструкции: на модели вируса иммунодефицита человека 1-го типа (Ortervirales: Retroviridae, Lentivirus) и иммортализованных клеточных линий различного происхождения показано, что величина и скорость такого дегидрогеназного сдвига пропорциональны заражающей дозе и уровню патогенности конкретного штамма (при одинаковой заражающей дозе) [13, 14]. В условиях описанного в данной статье эксперимента дегидрогеназная активность SARS-CoV-2-инфицированной первичной культуры адгезивных лейкоцитов сирийского хомячка (рис. 2, в, г) имеет два максимума: на 1-е сутки, который связан со входом вируса в клетку, и позже 1-х суток — в связи с продукцией вируса de novo (рис. 1, 2). Ещё одно объяснение (связанное с предыдущим): первый пик дегидрогеназной активности связан с жизнедеятельностью нейтрофилов, а второй — с более долгоживущими моноцитами (но пик максимума не был достигнут в связи с тем, что целью эксперимента было изучение в первую очередь биохимии инфицированных нейтрофилов).

МПО — гемопротеин, присутствующий в азурофильных гранулах нейтрофилов, выходящий при активации клетки в фаголизосому [28]. Этот фермент принимает участие в преобразовании супероксидного анион-радикала в гипохлорную кислоту, осуществляя защиту клетки от избыточного количества реактивных посредников кислорода [29]. После активации фагоцитов происходит дегрануляция, и МПО секретируется внутрь фагосомы либо во внеклеточное пространство. МПО является важной составной частью антимикробной активности фагоцитов, обеспечивающей врождённый неспецифический иммунитет. В ситуации in vivo МПО высвобождается во внеклеточную жидкость (в частности, в кровь), в том случае если по какой-либо причине нейтрофил не может фагоцитировать патоген, при клеточном лизисе или когда нейтрофил подвергается воздействию различных растворимых факторов [28].

При использовании автоматизированных цитохимических счётчиков клеток крови у пациентов с диагнозом COVID-19 отмечалось снижение активности МПО [9]. Вместе с тем при образовании нейтрофильных внеклеточных ловушек, формирующих одну из линий защиты от патогенов (включая вирусы, в том числе — SARS-CoV-2), выявляется повышение активности МПО во внеклеточном пространстве [30–32]. Снижение содержания МПО в культуре адгезивных лейкоцитов в течение 1 сут п.и.в. (рис. 1, е) может объясняться тем, что под действием SARS-CoV-2-инфекции нейтрофилы экскретируют МПО во внеклеточное пространство и формируют подобные нейтрофильным внеклеточным ловушкам структуры ex vivo.

ЦХО локализуется главным образом на внутренней мембране митохондрий, где захватывает протоны из внутримитохондриального матрикса и, перенося электроны с цитохрома С на кислород, восстанавливает О₂ до Н₂О. Этот фермент играет важную роль в функционировании аэробного звена дыхательной цепи и производстве энергии в клетках эукариот [25]. Поэтому снижение активности ЦХО коррелирует со снижением активности АТФазы в первые часы п.и.в. (см. рис. 2, а и е). Кроме того, в лейкоцитах активность ЦХО служит достоверным показателем уровня окислительного метаболизма, и при гибели клеток её активность повышается [25] — именно этот эффект наблюдается в культуре адгезивных лейкоцитов к концу 1-х суток п.и.в. (рис. 2, е).

Обнаруженные изменения ферментативного спектра SARS-CoV-2-инфицированных лейкоцитов имеют дозозависимый характер (рис. 2): модуль таких изменений пропорционален заражающей дозе вируса. При анализе динамики ферментативной активности необходимо учитывать, что к концу 1-х суток п.и.в. клеточный состав культуры адгезивных лейкоцитов уменьшается за счёт короткоживущих нейтрофилов, но при этом в культуре остаются более долгоживущие клетки.

Разумеется, нельзя исключить, что инфицированные вирусом SARS-CoV-2 клетки Vero E6 продуцируют растворимые экзогенные факторы, способные повлиять на физиологию клеток при заражении, поскольку использовался вируссодержащий супернатант клеточной культуры Vero E6. Однако известно, что клетки линии Vero и Vero E6 не продуцируют интерферон I типа за счёт потери кластера генов интерферона I типа [33, 34] и являются дефектными по продукции интерферонов-α-1/13, α-2, α-4, α-6, α-8, α-14, α-17, α-21, β-1 и ω-1 [33]. Что касается остальных вируссодержащих растворимых факторов — они могут стать предметом дальнейших исследований.

Вывод

Обнаруженные изменения ферментативной активности в нейтрофилах, инфицированных SARS-CoV-2 ex vivo, свидетельствуют о снижении микробицидного потенциала этих клеток врождённого иммунитета, что является одной из причин дисфункции иммунной системы при COVID-19.

 

 

***

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23.07.2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова Роспотребнадзора (протокол № 2 от 16.05.2024).

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова Роспотребнадзора (№ 141-00017-24-01) «Молекулярно-генетические и фенотипические свойства возбудителей респираторных инфекций. Поиск эффективных соединений из наземной и морской биоты Дальнего Востока для разработки средств профилактики и лечения».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Абрамова С.А. — концепция и дизайн исследования, обработка и анализ материала, написание текста; Ляпун И.Н., Дробот Е.И., Крылова Н.В., Иунихина О.В., Лубова В.А., Мерлов Е.К., Белов Ю.А. — обработка и анализ материала; Сомова Л.М. — концепция и дизайн исследования, обработка и анализ материала, написание текста, научное редактирование; Щелканов М.Ю. — написание текста, научное редактирование.Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям Международного комитета редакторов медицинских журналов, внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July, 2010). The research protocol was approved by the Ethics Committee of the Somov Institute of Epidemiology and Microbiology (protocol No. 2, May 16, 2024).

Funding source. The study was performed within the framework of the state assignment of the Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Rospotrebnadzor (№ 141-00017-24-01) “Molecular-genetic and phenotypic properties of respiratory pathogens. Search for effective compounds from terrestrial and marine biota of the Far East for the development of prophylactic and treatment agents”.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Authors’ contribution: Abramova S.A. — conceived the study and designed the experiment, material processing and performed the analysis, writing the manuscript; Lyapun I.N., Drobot E.I., Krylova N.V., Iunikhina O.V., Lubova V.A., Merlov E.K., Belov I.A. — material processing and performed the analysis; Somova L.M. — conceived the study and designed the experiment, material processing and performed the analysis, writing the manuscript, science editing; Shchelkanov M.Yu. — writing the manuscript, science editing. Аll authors confirm that they meet the International Committee of Medical Journal Editors criteria for authorship, made a substantial contribution to the conception of the article, acquisition, analysis, interpretation of data for the article, drafting and revising the article, final approval of the version to be published.

 

¹ Здесь и далее фотометрические измерения осуществляли с использованием спектрофотометра «Multiscan RC» («LabSystems»). Бланкирование проводили по раствору равного количества среды без соответствующих субстратов и клеток.

² Подсчёт жизнеспособных клеток в суспензионных культурах проще всего проводить в камере Горяева, извлекая небольшой объём ростовой среды с клеточной взвесью. Этот метод более удобен для однократного измерения (который не даёт достаточной статистической точности), но затруднителен в случае нескольких повторов; кроме того, достоверность результатов МТТ-тестов при работе с суспензионными клеточными культурами дополнительно снижается артефактным захватом клеток при промывке, что приходится компенсировать применением дозаторных наконечников специальной конструкции (S-tips) [15].

About the authors

Abramova A. Svetlana

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: svetochey99@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2428-3186

junior researcher, Pathology laboratory

Россия, Vladivostok

Irina N. Lyapun

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: irina-lyapun@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-5290-3864

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Pathology laboratory

Россия, Vladivostok

Elena I. Drobot

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: eidrobot@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7672-1582

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Pathology laboratory

Россия, Vladivostok

Natalia V. Krylova

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology; Far Eastern Federal University

Email: krylovanatalya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9048-6803

Sci. (Biol.), leading researcher, Head, Laboratory of respiratory infections, Assistant Professor, Department of epidemiology, microbiology and parasitology with the International scientific and educational center for biological safety of Rospotrebnadzor, School of Life Sciences and Biomedicine

Россия, Vladivostok; Vladivostok

Olga V. Iunikhina

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology; Far Eastern Federal University

Email: olga_iun@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-6723-582X

Sci. (Biol.), leading researcher, Head, Laboratory of respiratory infections, Assistant Professor, Department of epidemiology, microbiology and parasitology with the International scientific and educational center for biological safety of Rospotrebnadzor, School of Life Sciences and Biomedicine

Россия, Vladivostok; Vladivostok

Valeria A. Lubova

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: valeri_priority@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4290-6164

researcher, Laboratory of natural focal infections

Россия, Vladivostok

Evgeniy K. Merlov

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: zhenya.merlov.2000@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1515-3221

junior researcher, Department of experimental biomedicine

Россия, Vladivostok

Iurii A. Belov

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology; Far Eastern Federal University

Email: bornley@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8313-5610

junior researcher, Head, Center of molecular diagnostics, assistant, Department of epidemiology, microbiology and parasitology with the International scientific and educational center for biological safety of Rospotrebnadzor, School of Life Sciences and Biomedicine

Россия, Vladivostok; Vladivostok

Larisa M. Somova

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: l_somova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2023-1503

Dr. Sci. (Med.), Professor, chief researcher, Head, Pathology laboratory

Россия, Vladivostok

Mikhail Yu. Shchelkanov

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology; Far Eastern Federal University

Email: adorob@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8610-7623

Sci. (Biol.), Director, Head, Department of epidemiology, microbiology and parasitology with the International scientific and educational center for biological safety of Rospotrebnadzor, School of Life Sciences and Biomedicine

Россия, Vladivostok; Vladivostok

References

Supplementary files