Molecular and biological characterization of Streptococcus pneumoniae isolates from patients with pneumococcal meningitis

Full Text

Введение

Streptococcus pneumoniae является патогеном дыхательных путей человека и основной причиной заболеваемости и смертности во всём мире. S. pneumoniae — 4-я по частоте причина смертельных инфекций, таких как септицемия и менингит, и является, по оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), причиной 1,6 млн смертей, из которых 0,7–1,0 млн приходится на детей в возрасте до 5 лет, в основном в развивающихся странах [1–3]. Поверхностные капсульные полисахариды S. pneumoniae являются одними из наиболее важных факторов вирулентности и основой серотипирования пневмококка. В настоящее время известны более 100 серотипов S. pneumoniae [4]. Благодаря своей способности приобретать экзогенную ДНК пневмококк может переключать серотипы и получать гены резистентности к антибиотикам [5]. Бесконтрольное использование антимикробных препаратов (АМП), избирательное давление пневмококковых вакцин, высокий уровень генетической рекомбинации S. pneumoniae ведут к изменению популяции пневмококков: возникновению новых невакцинных серотипов, появлению изолятов со множественной антимикробной резистентностью, изменению профиля вирулентности. В 2024 г. ВОЗ включила S. pneumoniae, резистентный к макролидам, в обновлённый список приоритетных бактериальных патогенов среднего уровня¹.

В настоящее время технологии полногеномного секвенирования позволяют получить информацию о генетических изменениях, серотипах, сиквенс-типах, определённых как по «классической» 7-локусной схеме, так и по «основному геному» (core genome MLST), профиле вирулентности, статусе антимикробной резистентности пневмококков, что является важным для эпидемиологического надзора [6–10].

Цель исследования: дать ключевые характеристики изолятов S. pneumoniae, выделенных от больных пневмококковым менингитом, циркулирующих на территории России в 2015–2020 гг., на основании данных высокопроизводительного секвенирования, включая глобальные кластеры пневмококковых последовательностей, серотипы, факторы вирулентности и генетические детерминанты резистентности, в сравнении с клиническими данными по чувствительности к АМП.

Материалы и методы

Проведено исследование факторов вирулентности и генов резистентности у 68 инвазивных изолятов S. pneumoniae, выделенных из крови и ликвора пациентов с диагнозом «бактериальный менингит». Исследование проводилось при добровольном информированном письменном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Независимым междисциплинарным комитетом по этической экспертизе клинических исследований (протокол № 1 от 17.01.2020).

Все изоляты были получены при проведении различных этапов многоцентрового исследования «ПеГАС» в 2015–2020 гг. в разных регионах России [11]. Выделение и первичную идентификацию изолятов проводили в локальных микробиологических лабораториях центров — участников исследования в рамках стандартной процедуры бактериологического исследования биологического материала, полученного от пациентов с диагнозом «бактериальный менингит» и в соответствии с МУК 4.2.1887-04 «Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов». Транспортировку изолятов S. pneumoniae в центральную лабораторию Научно-исследовательского института антимикробной химиотерапии (НИИАХ) осуществляли на модифицированной среде Дорсэ. В НИИАХ проводились оценка соответствия присланных изолятов критериям включения, идентификация с учётом морфологии колоний на кровяном агаре («НEM»), наличия α-гемолиза, отрицательной каталазной реакции, чувствительности к оптохину («Oxoid») и положительных результатов латекс-агглютинации с использованием набора «DrySpot Pneumo» («Oxoid»). До момента определения чувствительности к АМП все изоляты хранили в пробирках с триптиказо-соевым бульоном («bioMerieux») с добавлением 30% стерильного глицерина («Sigma») при –70°С. Контаминированные и нежизнеспособные изоляты были исключены из исследования. Чувствительность к АМП определяли методом микроразведений в бульоне в соответствии с требованиями ISO 20776-1:2020², категории чувствительности изолятов к АМП — на основании пограничных значений минимальных подавляющих концентраций (МПК) в соответствии со стандартами EUCAST³ и российскими рекомендациями⁴. Для контроля качества определения чувствительности параллельно с исследуемыми изолятами тестировали референсный штамм S. pneumoniae ATCC 49619.

Полногеномное секвенирование проводили на базе ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Пробоподготовку вели по протоколу «Nextera» («Illumina»). Высокопроизводительное секвенирование проводили на приборе «HiSeq 1500» с использованием наборов «HiSeq PE Rapid Cluster Kit v2» и «HiSeq Rapid SBS Kit v2» («Illumina»). Полногеномные нуклеотидные последовательности собирали с использованием программы «SPAdes v. 3.13». Подробное описание методики пробоподготовки для полногеномного секвенирование приведено нами ранее [12].

Полногеномные нуклеотидные последовательности изученных изолятов, данные о серотипах и чувствительности к антибиотикам, а также информация об источниках штаммов внесены в базу PubMLST⁵: идентификационные номера: 51080–51125, 73010–73011, 73013–73015, 73017–73033.

Инвазивные изоляты пневмококков были проанализированы на сигнатуру пенициллинсвязывающих белков (ПСБ), где комбинация 3 сигнатур (PBP1А, PBP2В, PBP2Х) определяет уровень резистентности к β-лактамам, были определены глобальные кластеры пневмококковых последовательностей, аллели MLST, серотипы, сиквенс-типы и гены приобретённой резистентности (mefA, ermB, tetM, folA/P, cat) с использованием инструмента, доступного на Pathogenwatch — глобальной платформе геномного наблюдения⁶. Гены вирулентности идентифицировали с помощью онлайн-программы AMRseq⁷ и программы BacWGSTdb⁸.

Исследование не являлось интервенционным и не предполагало сравнения групп. Для представления результатов использовали методы описательной статистики с определением абсолютного и относительного количества наблюдений.

Результаты

Молекулярно-биологическая характеристика инвазивных изолятов S. pneumoniae

Нами выявлено 28 глобальных кластеров пневмококковых последовательностей (GPSC), 45 сиквенс-типов и 27 серотипов (табл. 1).

 

Таблица 1. Глобальные кластеры пневмококковых последовательностей, ассоциированные с сиквенс-типами и серотипами

Глобальные кластеры  пневмококковых последовательностей	Сиквенс-типы	Серотипы	Количество изолятов, n (%)
1	236	19F	2 (7)
2	15249	1	1 (4)
3	1012	11A	1 (4)
6	3418, 143	6E(6B),14	2 (7)
7	311, 152248, 16095, 311	23F	4 (14)
10	230	19F	1 (4)
11	1262	15B	2 (7)
12	505, 180, 15251, 15250, 2049	3	12 (43)
13	12493, 473	6A, 6B	2 (7)
16	66, 16098	9N	2 (7)
19	433	22F	2 (7)
32	3244, 11901,2824, 3544	7F, 8	4 (14)
38	393	38	1 (4)
43	239	9V	3 (11)
44	179	19F	1 (4)
49	440	23F	1 (4)
68	15252, 3187	18C	2 (7)
76	490	6A	1 (4)
98	1480	8	1 (4)
123	447	37	1 (4)
162	2361	4	2 (7)
177	2991	35F	2 (7)
212	6202	12F, 15F	4 (14)
229	1025	15B, 15C	3 (11)
230	2754	13	1 (4)
365	225	28A	2 (7)
376	9247	6E(6B)	1 (4)
904	782	14	1 (4)
Not assigned	15	19F	2 (7)
Not assigned	15247	10С	1 (4)
Not assigned	5205	8	1 (4)
Not assigned	13459	10А	1 (4)
Not assigned	16099	4	1 (4)

Примечание. Not assigned — не назначен номер глобального кластера пневмококковых последовательностей.

 

Анализ полногеномных данных показал, что среди инвазивных изолятов преобладали серотипы, входящие в состав пневмококковой полисахаридной 23-валентной вакцины (ППВ-23) и пневмококковой конъюгированной вакцины 13 (ПКВ-13) — 3 (18%), 19F (9%), 23F (7%) и 15В (6%). Степень охвата ППВ-23 составила 79%, ПКВ-13 — 59%. Частота выделения пневмококков невакцинных серотипов при менингите в России: 28A и 35F — по 3%; 13, 37, 38, 10C, 15C и 15F — более 1% (рисунок).

 

Серотипы инвазивных S. pneumoniae.

 

Из 28 GPSC 20 GPSC были представлены вакцинными серотипами, 6 GPSC — невакцинными серотипами. Две линии — GPSC212 (12F, 15F) и GPSC229 (15B, 15C) — экспрессировали серотипы как вакцинных, так и невакцинных серотипов. Линия GPSC12 экспрессировала только 3-й вакцинный серотип и составила более 42%. В ряде случаев один и тот же серотип был связан с разными линиями. Второй по частоте встречаемости серотип, 19F, экспрессировался линиями GPSC1, 10, 44 и новой линией, GPSC которой не определён, серотип 23F — GPSC7 и GPSC49, серотип 15В — GPSC11 и GPSC229. Невакцинные серотипы экспрессировались линиями GPSC 365 (серотип 28A), GPSC177 (серотип 35F), GPSC212 (серотип 15F), GPSC229 (серотип 15С), GPSC123 (серотип 37), GPSC38 (серотип 38), GPSC230 (серотип 13).

Чувствительность к антимикробным препаратам инвазивных изолятов S. pneumoniae

Анализ чувствительности к АМП показал, что резистентны к пенициллину были 6 (9%) инвазивных изолятов (табл. 2), к тетрациклину — 11 (16%), к эритромицину — 5 (7%), к клиндамицину — 2 (3%), к респираторным фторхинолонам — 1 (1%). К триметоприму-сульфаметоксазолу 12 (18%) изолятов были резистентны, 12 (18%) — чувствительны при увеличенной экспозиции.

 

Таблица 2. Резистентность пневмококковых линий GPSC к АМП

Пневмококковые  линии	Cеротип	Количество	Генотип, резистентность, n (%)
			PEN	TET	TS	CL	ERY	CHL	FX
1	19F	2	2 (3)	2 (3)	2 (3)	1 (1)	2 (3)	0	0
2	1	1	0	0	0	0	0	0	0
3	11A	1	0	0	1 (1)	0	0	0	0
6	6E(B),14	2	1 (1)	2 (3)	2 (3)	2 (3)	2 (3)	0	0
7	23F	4	0	0	4 (6)	0	0	0	0
10	19F	1	1 (1)	1 (1)	1 (1)	0	0	0	0
11	15B	2	0	0	2 (3)	0	0	0	0
12	3	12	0	1 (1)	0	0	0	0	1 (1)
13	6A, 6B	2	1 (1)	1 (1)	2 (3)	0	1 (1)	0	0
16	9N	2	0	0	1 (4)	0	0	0	1 (1)
19	22F	2	0	0	0	0	0	0	0
32	7F,8	4	0	0	0	0	0	0	0
38	38	1	0	0	0	0	0	0	0
43	9V	3	0	0	3 (4)	0	0	0	0
44	19F	1	0	1 (1)	1 (1)	1 (1)	1 (1)	0	0
49	23F	1	0	0	1 (1)	0	0	0	0
68	18C	2	0	0	2 (3)	0	0	0	0
76	6A	1	0	0	1 (1)	0	0	0	0
98	8	1	0	0	0	0	0	0	0
123	37	1	0	0	0	0	0	0	0
162	4	2	0	0	0	0	0	0	0
177	35F	2	0	2 (3)	2 (3)	0	0	0	0
212	12F, 15F	4	0	0	0	0	0	0	0
229	15B, 15C	3	0	0	3 (4)	0	0	0	0
230	13	1	0	1 (1)	1 (1)	0	1 (1)	0	0
365	28A	2	0	0	0	0	0	0	0
376	6E(6B)	1	0	0	1 (1)	0	0	1 (4)	0
904;9	14	1	1 (1)	1 (1)	1 (1)	0	0	0	0
Not assigned	10С, 19F, 8, 10A ,4	6	0	2 (3)	2 (3)	0	0	0	0
28	27	68	6 (9)	14 (21)	33 (49)	4 (6)	7 (10)	1 (1)	2 (3)

Примечание. PEN — резистентность к пенициллину, предсказанная на основе последовательностей PBP1a, PBP2b и PBP2x; TET — резистентность к тетрациклину, предсказанная по наличию гена tet M; TS — резистентность к триметоприму-сульфаметоксазолу, связана с заменой в folA I100L и/или вставкой 1 или 2 кодонов в folP_aa_insert_57-70, CL — резистентность к клиндамицину, предсказанная по наличию гена ermB; ERY — резистентность к макролидам, предсказанная по наличию гена метилазы (ermB) и гена насоса оттока макролидов (mefA/E); CHL — резистентность к хлорамфениколу, предсказанная по наличию гена хлорамфениколацетилтрансферазы (cat); FX — резистентность к фторхинолонам, предсказанная по наличию мутаций в генах gyrA, parC.

 

Среди изолятов 28 линий GPSC изоляты 5 линий, экспрессирующие вакцинные серотипы, были резистентны одновременно к 3 и более классам АМП: GPSC1 (серотип 19F), GPSC6 (серотип 14) были резистентны к пенициллину, тетрациклину, триметоприму-сульфаметоксазолу, эритромицину и клиндамицину; GPSC10 (серотип 19F), GPSC904;9 (серотип 14) — к пенициллину, тетрациклину и триметоприму-сульфаметоксазолу, GPSC6 (серотип 6E(B)) — к пенициллину, эритромицину и триметоприму-сульфаметоксазолу. Одна линия с вакцинными серотипами была резистентна одновременно к антибиотикам двух классов: GPSC44 (серотип 19F) — к тетрациклину и эритромицину. Две линии, экспрессирующие невакцинные серотипы, — GPSC177 (серотип 35F) и GPSC230 (серотип 13) — были резистентны к тетрациклину и триметоприму-сульфаметоксазолу.

Генетические детерминанты резистентности к антимикробным препаратам

У клинических изолятов S. pneumoniae резистентность к β-лактамам в первую очередь обусловлена вариациями аминокислотных последовательностей в транспептидазных доменах ПСБ: PBP1a, PBP2b и PBP2x, которые снижают сродство β-лактамных антибиотиков к этим участкам. Тип ПСБ позволяет прогнозировать уровни резистентности к β-лактамам [13]. Анализ результатов полногеномного секвенирования инвазивных изолятов S. pneumoniae выявил, что наиболее распространённым типом ПСБ у чувствительных изолятов (PBP1a-PBP2b-PBP2x) был 2-0-2 — 29%, реже встречались 11-4-0 — 4% и 12-0-6 — 3%. Все резистентные к пенициллину изоляты имели сигнатуры: 13-16-47, 17-15-22, 24-53-77, 36-34-44, 31-12-18. Выявлено также несколько комбинаций новых типов ПСБ: new-27-new, 34-11-new. Резистентность к макролидам и линкозамидам (эритромицину и клиндамицину) была обусловлена наличием гена метилазы (ermB) у 5 (7%) изолятов, у 1 (1%) изолята были одновременно обнаружены гены ermB и гены насоса оттока макролидов (mefA/E). Резистентность к триметоприму-сульфаметоксазолу была связана с заменой в folA I100L и/или вставкой 1 или 2 кодонов foP, в то время как у изолятов, относящихся к категории чувствительных при повышенной экспозиции, часто имела место вставка 1 или 2 кодонов в folP. Резистентность к хлорамфениколу прогнозировалась по наличию гена хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), резистентность к фторхинолонам — мутациями в генах gyrA и parC.

Сравнение фенотипа и генотипа резистентности

Конкордантность генотипа и фенотипа резистентности в целом была высокой, однако в некоторых случаях были выявлены несоответствия между генотипической и фенотипической резистентностью.

Резистентность к β-лактамам показала хорошее соответствие. Шесть изолятов пневмококков, резистентных к пенициллину, имели сигнатуры ПСБ, характерные для резистентных пневмококков. Интересно, что все 6 резистентных к пенициллину изолятов имели сигнатуры PBP1а(13–36)-PBP2b(12–53)-PBP2х(18–77), в то время как все чувствительные изоляты имели сигнатуры ПСБ с низким номером. Таким образом, сигнатуры транспептидазы ПСБ являются надёжными индикаторами МПК различных β-лактамных антибиотиков у клинических изолятов пневмококков и могут служить альтернативой тестированию фенотипической чувствительности.

Все 11 резистентных к тетрациклину пневмококков несли гены tetM. Три изолята, содержавшие tetM, относились к категории чувствительных, что может быть обусловлено мутациями в tetM, не рассмотренными в нашем исследовании.

В случае с триметопримом-сульфаметоксазолом для большинства изолятов была выявлена хорошая корреляция между наличием маркеров резистентности и фенотипической резистентностью. Двенадцать изолятов являлись двойными мутантами с заменой в folA I100L и вставкой 1 или 2 кодонов в folP aa insert_57–70 и были резистентны к триметоприму-сульфаметоксазолу (табл. 2). Двенадцать изолятов пневмококка, содержащие вставки в folP, имели МПК 2 мг/л и были отнесены к категории чувствительных при увеличенной экспозиции, а 9 изолятов с одиночными мутациями в folP были отнесены к категории чувствительных (МПК ≤ 1 мг/л).

Все 5 изолятов, резистентных к эритромицину, несли ген ermB, 1 резистентный изолят нёс одновременно ermB и mefA, в то же время 2 изолята, имевшие ген mefA, сохраняли фенотипическую чувствительность к эритромицину. У 2 изолятов, резистентных к клиндамицину, были обнаружены гены ermB, но ermB был выявлен также у 2 фенотипически чувствительных изолятов.

В связи с тем, что для S. pneumoniae отсутствуют критерии для определения категории чувствительности к хлорамфениколу, оценка активности данного препарата проводилась на основании значения эпидемиологических точек отсечения (Epidemiological cut-off value). МПК хлорамфеникола для всех исследованных изолятов составила менее 8 мг/л, что соответствует популяции дикого типа), однако 1 изолят нёс ген cat.

Был выявлен 1 изолят, резистентный к респираторным фторхинолонам (левофлоксацину и моксифлоксацину), он имел мутации в генах gyrA и parC. В то же время среди чувствительных к фторхинолонам пневмококков у 1 изолята была выявлена мутация в гене parC.

Генетические детерминанты вирулентности пневмококков

Чтобы получить представление о генетических особенностях, способствующих вирулентности, мы исследовали наличие основных белковых факторов вирулентности пневмококка. У всех инвазивных изолятов пневмококков были обнаружены холинсвязывающие белки (CbpG, LytA и Pce/CbpE), PavA и PfbA, известные как фибронектин- и плазминогенсвязывающие белки, а также гиалуронидаза, пневмолизин, нейраминидаза, связанный с капсулой Cps4A (табл. 3). Цинковая металлопротеиназа С была обнаружена у 9 (13%) изолятов.

 

Таблица 3. Характеристика генов вирулентности

Гены вирулентности	Название кодируемого белка	% гомологии	Количество изолятов
			n	%
cbpG	Холинсвязывающий белок G	99,30	68	100
lytA	Аутолизин	98,75	68	100
pce/cbpE	Холинсвязывающий белок Е	99,18	68	100
ply	Пневмолизин	99,86	68	100
pavA	Фибронектинсвязывающий белок	99,52	68	100
pfbA	Плазмин- и фибронектинсвязывающий белок A	99,72	68	100
hysA	Гиалуронидаза	99,16	68	100
nanA	Нейраминидаза A	98,77	68	100
cps4A	Синтез капсулы	96,54	68	100
zmpC	Цинковая металлопротеиназа C	99,96	9	13

 

Обсуждение

В нашем исследовании среди клинических изолятов, вызывающих менингит в России, преобладали пневмококки серотипа 3. Аналогичная ситуация отмечается и во многих других странах в поствакцинальный период. В Австрии, Англии, Канаде, Швеции и Германии за последние 3 года наблюдался значительный рост инвазивных пневмококковых заболеваний серотипа 3 у взрослых [14]. В Бразилии серотип 3 выступал как преобладающая причина инвазивного заболевания в эпоху после ПКВ среди взрослых [15, 16]. Низкая эффективность конъюгированных вакцин против пневмококков серотипа 3 связана с особенностями строения полисахаридной капсулы, которая нековалентно связана с пептидогликаном клеточной стенки [17–21]. Следует отметить, что изоляты линии GPSC12 (серотип 3), оставаясь основной причиной инвазивных форм пневмококковой инфекции во всём мире после введения ПКВ-13, как правило, сохраняют чувствительность к АМП [22–25]. Низкая частота резистентности к АМП изолятов серотипа 3 может быть связана с высокой инвазивностью изолятов данного серотипа и относительно короткой продолжительностью носительства, что, в свою очередь, снижает воздействие АМП при лечении инфекций другой этиологии [26]. В то же время исследование серотипа 3, проведённое в Англии [27], выявило, что с 2018 г. появляются изоляты линии GPSC12, резистентные к пенициллину, макролидам, хлорамфениколу и тетрациклину [28, 29]. Нарастание резистентности изолятов серотипа 3 указывает на циркуляцию более устойчивых к антибиотикам клонов [30]. В нашем исследовании все изоляты S. pneumoniae серотипа 3 были чувствительны к пенициллину, из 12 изолятов, выделенных из ликвора, только 2 содержали гены резистентности к фторхинолонам — parC и к тетрациклину — tetM, сохраняя при этом фенотипическую чувствительность к данным препаратам.

Вторыми по частоте выделения при менингите были пневмококки серотипа 19F, что может быть обусловлено особенностями капсульного полисахарида, который более устойчив к отложению C3b компонента комплемента и антител на стенки бактерии, что снижает чувствительность к опсонофагоцитозу [31, 32]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что циркуляция серотипа 19F связана с распространением 3 линий: GPSC10, GPSC1 и GPSC44. Все линии характеризовались устойчивостью к различным АМП, причём линии GPSC10 и GPSC1 проявляли множественную антимикробную резистентность. В Канаде доминирование серотипа 19F было связано с распространением линий GPSC1, GPSC4, GPSC9, GPSC10, GPSC18, GPSC44 и GPSC119 [33], в Швеции — линии GPSC1 [34], в Азии, Европе, Северной Америке и Южной Америке серотип 19F был одним из доминирующих в линии GPSC1 [35]. В Южной Африке доминирование серотипа 19F было связано с распространением линий GPSC1 и GPSC21, при этом установлено, что высокая, порядка 50%, внутрибольничная смертность от пневмококкового менингита связана с серотипом 19F [35, 36]. Увеличение частоты встречаемости серотипа 19F после введения ПКВ-13 в Индии было связано с мультирезистентными линиями GPSC1 и GPSC10, при этом особого внимания заслуживает линия GPSC10, которая экспрессировала как вакцинные серотипы, включая 19F, так и невакцинные серотипы и тем самым вносила наибольший вклад в распространение невакцинных серотипов среди клинических изолятов [37]. Линия GPSC10 способна одновременно экспрессировать широкий спектр серотипов, что облегчает её адаптацию к селективному давлению вакцин. Международный набор данных линии GPSC10 показал, что эта линия экспрессирует 16 серотипов, из которых только 6 включены в ПКВ-13. При этом линия GPSC10 обладает относительно высоким потенциалом развития инвазивных форм инфекции и склонностью вызывать менингит, независимо от серотипа [38]. Было установлено, что для распространения пневмококков линии GPSC10 во Франции потребовалось порядка 3–5 лет, а в Испании, Аргентине и Израиле быстрое изменение состава серотипа этой линии произошло в поствакцинальный период. Таким образом, вместе с его трансмиссивностью GPSC10 следует рассматривать как линию высокого риска, которая со временем может снизить эффективность вакцин во всём мире [39, 40]. Е. Егоровой и соавт. установлено, что в России в 2011–2018 гг. изоляты серотипа 19F принадлежали к 8 различным линиям (GPSC1, GPSC44, GPSC10 GPSC6, GPSC11, GPSC18, GPSC43 и GPSC591), из них линии GPSC1, GPSC6 и GPSC10 характеризовались резистентностью к АМП [41].

По результатам настоящего исследования пневмококки серотипа 23F были третьими по распространённости среди серотипов, ответственных за развитие бактериального менингита в России. Четыре из 5 изолятов серотипа 23F принадлежали линии GPSC7, 1 — линии GPSC49. Все изоляты серотипа 23F характеризовались резистентностью к триметоприму-сульфаметоксазолу. В исследованиях, проведённых в Китае и Иране, серотип 23F был одним из доминирующих серотипов, выделенных у пациентов из ликвора [42, 43]. Результаты исследований, выполненных в Великобритании, показали, что изоляты серотипа 23F входили в линию GPSC7. Если в 2002 г. в этой линии преобладал серотип 23F и было лишь небольшое количество серотипа 23А, то в 2009 г. появились изоляты серотипа 23B [29]. Линия GPSC7 была одной из доминирующих линий, ответственных за инвазивные заболевания в эпоху ПКВ-13 в Гонконге, Израиле, Малави, Южной Африке, Гамбии и США [22].

Результаты международных исследований свидетельствуют о том, что поствакцинальный период характеризуется снижением доли вакцинных серотипов и увеличением невакцинных серотипов пневмококков среди разных возрастных групп населения [44, 45]. В популяции сохраняются линии, представленные вакцинными серотипами, в которых уже присутствовали невакцинные серотипы [15]. Отмечено, что эти невакцинные серотипы обладают высоким потенциалом развития инвазивных форм инфекции [46, 47]. Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что в России более 17% случаев пневмококкового менингита были вызваны пневмококками невакцинных серотипов. Обращает на себя внимание относительно высокая доля изолятов с серотипом 15B (6%) и присутствие изолятов с невакцинными серотипами 28А, 37 и 38, которые ранее не были ассоциированы с пневмококковым менингитом на территории России. Установлено, что уровень резистентности к антибиотикам у невакцинных серотипов ниже, чем у вакцинных, и различается в зависимости от линии GPSC. В нашем исследовании линии, экспрессирующие невакцинные серотипы, были чувствительны ко всем тестированным АМП, за исключением 2 линий (табл. 2).

В процессе инвазивной инфекции на разных стадиях участвуют различные факторы вирулентности. По результатам нашего исследования классические гены, кодирующие факторы вирулентности, такие как синтез капсулы, пневмококковый поверхностный адгезин, аутолизин, белок, связывающий фибронектин и пневмолизин, были обнаружены у всех инвазивных изолятов. Интересное наблюдение было сделано в отношении гена zmpC. Он был выявлен только у 9 инвазивных изолятов пневмококка линий GSPC229 (серотип 15С,15B), GSPC3 (серотип 11А), GSPC162 (серотип 4), GSCP904 (серотип 14) и новой линии GSPC (серотип 8). Ранее в исследовании в Нидерландах ген zmpC выявлен у инвазивных серотипов 8, 11А и 4, принадлежащих к линии GPSC3. Установлено, что случаи инвазивных пневмококковых инфекций, вызванные zmpC-положительными пневмококками, чаще сопровождались сепсисом [48]. Японскими учёными высказано предположение о том, что металлопротеаза цинка zmpC подавляет вирулентность пневмококков путём ингибирования бактериальной инвазии в центральную нервную систему [49]. Таким образом, металлопротеаза цинка zmpC представляет отдельный интерес и требует дополнительных исследований.

Выводы

1. Выявлено 28 глобальных кластеров пневмококковых последовательностей (GPSC), 45 сиквенс-типов S. pneumoniae, ассоциированных с инвазивными штаммами, на территории России. Из 68 изолятов S. pneumoniae, выделенных у пациентов с бактериальным менингитом, более 17% относились к невакцинным серотипам.
2. Антибиотикорезистентность пневмококков вакцинных серотипов была выше, чем у невакцинных серотипов.
3. Появление линий невакцинных серотипов пневмококка с детерминантами высокой вирулентности, включая устойчивость к антибиотикам, обусловливает необходимость дальнейших исследований молекулярно-генетической характеристики изолятов, вызывающих менингит.
4. Результаты сопоставления фенотипической и генотипической антимикробной резистентности характеризовались хорошей конкордантностью, что указывает на необходимость дальнейшего изучения возможности использования полногеномного секвенирования в качестве диагностического инструмента для выявления механизмов резистентности у клинических изолятов S. pneumoniae.

В заключение следует отметить, что характеристика пневмококковых линий, их генетические вариации, оказывающие влияние на резистентность и инвазивность, являются весьма информативными для создания глобальной стратегии непрерывного эпидемиологического контроля за популяцией пневмококков.

 

 

***

Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном письменном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Независимым междисциплинарным комитетом по этической экспертизе клинических исследований (протокол № 1 от 17.01.2020).

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Чагарян А.Н. — организация сбора и обработки материала, идентификация микроорганизмов фенотипическими методами, определение чувствительности к АМП, написание текста; Иванчик Н.В. — организация сбора материала, идентификация микроорганизмов фенотипическими методами, определение чувствительности к АМП; Кузьменков А.Ю. — обработка материала; Козлов Р.С. — координация исследования, редактирование статьи; Гапонова И.И. — проведение полногеномного секвенирования, обработка полученных результатов; Миронов К.О. — проведение полногеномного секвенирования, обработка полученных результатов, редактирование статьи. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям Международного комитета редакторов медицинских журналов, внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Ethics approval. The study was conducted with the informed consent of the patients. The study protocol was approved by the Independent Interdisciplinary Committee for the Ethical Review of Clinical Trials (Protocol No. 1, January 17, 2020). 

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Author contribution: Chagaryan A.N. — organization of material collection and processing, identification of microorganisms by phenotypic methods, determination of sensitivity to AMP, text writing; Ivanchik N.V. — organization of material collection, identification of microorganisms by phenotypic methods, determination of sensitivity to AMP; Kuzmenkov A.Yu. — material processing; Kozlov R.S. — coordination of the study, editing of the article; Gaponova I.I. — full genome sequencing, processing of the obtained results; Mironov K.O. — full genome sequencing, processing of the obtained results, editing of the article. Аll authors confirm that they meet the International Committee of Medical Journal Editors criteria for authorship, made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.

 

¹ WHO bacterial priority pathogens list, 2024: Bacterial pathogens of public health importance to guide research, development and strategies to prevent and control antimicrobial resistance. URL: https://who.int/publications/i/item/9789240093461

² Национальный cтандарт ГОСТ Р ИСО 2077612022. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни).

³ European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (EUCAST). Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Ver. 14.0, 2024. URL: www.eucast.org/clinical_breakpoints/ (дата обращения 01.11.2024).

⁴ Российские рекомендации. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Версия 2024-02. Смоленск; 2024. 192 с.

⁵ Streptococcus pneumoniae MLST Databases. URL: https://pubmlst.org/spneumoniae/ (дата обращения: 17.02.2020).

⁶ A Global Platform for Genomic Surveillancе. URL: https://pathogen.watch

⁷ AMRseq. URL: https://amrseq.net/ru/

⁸ BacWGSTdb. URL: http://bacdb.cn/BacWGSTdb/index.php

About the authors

Aida N. Chagaryan

Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk State Medical University

Author for correspondence.
Email: aida.chagaryan@antibiotic.ru
ORCID iD: 0000-0001-9195-8764

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Laboratory of antibiotic resistance, Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy

Россия, Smolensk

Natali V. Ivanchik

Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk State Medical University

Email: natali.ivanchik@antibiotic.ru
ORCID iD: 0000-0002-9392-0732

Cand. Sci. (Med.), researcher, Laboratory of antibiotic resistance, Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy

Россия, Smolensk

Alexey Yu. Kuzmenkov

Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk State Medical University

Email: alexey.kuzmenkov@antibiotic.ru
ORCID iD: 0000-0001-9562-2096

Sci. (Med.), Professor, Deputy director, Associate Professor, Microbiology department, Institute of Antimicrobial Chemotherapy

Россия, Smolensk

Roman S. Kozlov

Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk State Medical University; Central Research Institute of Epidemiology

Email: roman.kozlov@antibiotic.ru
ORCID iD: 0000-0001-8728-1113

D. (Med.), Professor, Director, Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Chancellor

Россия, Smolensk; Moscow

Irina I. Gaponova

Central Research Institute of Epidemiology

Email: gaponova@cmd.su
ORCID iD: 0000-0003-4481-2249

research laboratory assistant, Scientific group for the development of new methods for detecting genetic polymorphisms

Россия, Moscow

Konstantin O. Mironov

Central Research Institute of Epidemiology

Email: mironov@pcr.ru
ORCID iD: 0000-0001-8207-9215

Sci. (Med.), Head, Group for the development of new methods for detecting genetic polymorphisms

Россия, Moscow

References

Supplementary files