Stabilization of tigecycline solutions during susceptibility testing of microorganisms by broth microdilution method

Full Text

Введение

Микроорганизмы, устойчивые к антимикробным препаратам, являются одной из самых больших угроз для здравоохранения и продовольственной безопасности во всём мире [1]. Стремительный рост распространения грамотрицательных микроорганизмов, особенно относящихся к Enterobacterales и Acinetobacter spp., которые проявляют устойчивость к препаратам выбора карбапенемам, ставит под угрозу эффективность их применения. Для лечения инфекций, вызванных такими штаммами микроорганизмов, используют в основном колистин и тигециклин [2, 3]. Однако в настоящее время более чем в 40 странах, включая Россию, зафиксировано глобальное распространение резистентности у исследуемых штаммов к колистину, опосредованное геном mcr (mobilized colistin resistance), что значительно снижает его клиническую эффективность [4–7], поэтому тигециклин является критически важным для медицины препаратом¹, особенно при лечении инфекций, вызванных микроорганизмами с множественной лекарственной устойчивостью [8].

Тигециклин — антибиотик нового класса глицилциклинов, обладает широким спектром действия, структурно сходен с тетрациклинами, но более активен в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных штаммов микроорганизмов. Однако некоторые бактерии, такие как Morganella spp., Proteus spp., Providencia spp. и Pseudomonas aeruginosa, проявляют природную устойчивость к тигециклину [9], описана пониженная чувствительность A. baumannii к нему [10], а у Klebsiella pneumoniae, E. aerogenes, E. cloacae и др. может развиться приобретённая устойчивость к тигециклину, обусловленная сверхэкспрессией гена неспецифичного активного выведения ArcAB, который обеспечивает резистентность ко многим лекарственным препаратам [11].

Для выбора и коррекции антибактериальной терапии рекомендуется проводить микробиологическую диагностику с идентификацией возбудителя и определением его чувствительности к тигециклину.

Референтным методом определения чувствительности является метод микроразведений в бульоне Мюллера–Хинтон (МХБ), позволяющий определять значения минимальных подавляющих концентраций (МПК) тестируемых антибиотиков. В ходе установления допустимых значений МПК тигециклина для контрольных штаммов были выявлены несоответствия в значениях МПК, которые были связаны со сроком хранения МХБ. Результаты ряда исследований показали, что при тестировании в свежеприготовленном (менее чем за 12 ч до начала тестирования) МХБ тигециклин был в 2–3 раза более активен в отношении 3 контрольных штаммов (Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213 и Enterococcus faecalis ATCC 29212), чем в хранившейся среде (МПК 0,03–0,25 и 0,12–0,50 мкг/мл соответственно) [12–14]. В связи с этим международными стандартами CLSI², EUCAST³ и российскими рекомендациями⁴ для определения значений МПК тигециклина с помощью метода микроразведений в бульоне рекомендовано использовать только свежеприготовленный МХБ.

Нестабильность тигециклина в водных растворах связана с его химическим строением, т. к. он может быть подвержен двум химических процессам, приводящим к образованию фармакологически неактивных продуктов. С одной стороны, фенольная группа тигециклина делает его чувствительным к окислению, особенно при значениях рН, превышающих значение 7,0, с другой стороны, при более низком значении pH тигециклин более подвержен неферментативной эпимеризации⁵.

Для терапевтических целей тигециклин выпускается в виде лиофилизированного порошка⁶, содержащего вспомогательные вещества в виде лактозы для стабилизации препарата против эпимеризации, и соляную кислоту или гидроксида натрия для регулирования рН в диапазоне 4,5–5,5 и для предотвращения окисления [10, 15].

Поскольку pH МХБ со временем не изменяется, причину расхождений в результатах МПК связывают с ускорением окислительного разложения тигециклина, вызванного увеличением количества растворённого кислорода в МХБ во время хранения. Для стабилизации тигециклина исследованы различные антиоксидантные добавки в МХБ: аскорбиновая кислота, пируват натрия, тиогликолят натрия, L-цистеин, каталаза, а также анаэробные условия хранения МХБ [12, 15, 16]. Добавление аскорбиновой кислоты и пирувата в концентрациях 0,3 и 6% соответственно способствовало стабилизации тигециклина до 7 дней. Однако в исследовании [16] показано, что аскорбиновая кислота вызывает быструю деградацию тигециклина и приводит к потере антибактериальной активности. В ряде публикаций исследована возможность использования оксиразы — фермента, способствующего снижению концентрации кислорода в МХБ [12, 14, 16]. Результаты исследований показали сохранение активности тигециклина в 2% растворе оксиразы вплоть до 7 сут при 4–6°С.

В исследовании [12] описано применение замораживания при –20°C МХБ, содержащего тигециклин и разлитого в 96-луночные планшеты. Тестирование чувствительности тест-штаммов после размораживания показало, что активность антибиотика сохранялась до 6 нед, и результаты тестирования совпадали с данными, полученными со свежеприготовленным МХБ.

Анализ публикаций показал, что в исследованиях все манипуляции (антиоксидантные добавки, хранение в замороженном состоянии, в анаэробных условиях) проводили с МХБ, поэтому представляется важным изучение возможности хранения именно водных растворов антибиотика.

В соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 20776-1-2022⁷, который регламентирует процедуру выполнения метода микроразведений в бульоне, для тестирования используют базовые (основные) растворы антибиотиков, часть объёма которых, как правило, остаётся недоиспользованной. Требованиями ГОСТ Р ИСО 20776-1-2022 разрешено хранение стабильных растворов антибиотиков, а хранение нестабильных, к которым относятся водные растворы тигециклина, никак не регламентируется. Только уточняется, что если нет информации о стабильности растворов при определённых условиях хранения, то свежий базовый (основной) раствор следует готовить для каждой исследуемой партии.

Цель исследования — определить возможность стабилизации и рационального использования растворов тигециклина для получения допустимых значений МПК при тестировании контрольных штаммов референтным методом.

Материалы и методы

В работе использовали химические субстанции тигециклина («Sigma») и оксиразы («Sigma»). Определение значений МПК тигециклина для контрольных (тест-штаммов) E. соli АТСС 25922, S. aureus АТСС 29213, E. faecalis ATCC 29212, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 проводили методом микроразведений в МХБ (ГНЦ ПМБ), который заранее готовили и хранили 24–48 ч до исследования при комнатной температуре. При работе с тест-штаммом S. pneumoniae ATCC 49619 в бульон добавляли 5% лизированной лошадиной крови и 20 мг/л β-NAD («Sigma»). Все использованные в работе штаммы получены в лиофилизированном виде из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГКПМ-Оболенск.

Лизированную лошадиную кровь готовили из дефибринированной («ЭКОлаб»). Для этого в дефибринированную лошадиную кровь добавляли стерильную деионизированную воду в соотношении 1 : 1, помещали в морозильную камеру на 7–8 ч при –20°C. Затем размороженную при комнатной температуре кровь повторно подвергали замораживанию–оттаиванию, повторяя данный цикл 4 раза до полного лизиса кровяных клеток. После этого лизированную лошадиную кровь осветляли центрифугированием при 7000 об/с в течение 30 мин на центрифуге «Eppendorf Centrifuge 5702» («Eppendorf»).

Тестирование проводили в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 20776-1-2022 в 3 повторностях. Для этого готовили базовый (основной) раствор тигециклина с концентрацией 512 мг/л в воде и в воде с добавлением различных концентраций оксиразы (2,0, 3,0, 5,0 и 8,0%), хранили при 2–6°С в бытовом холодильнике и при –70°С в низкотемпературном кельвинаторе «MDF-U33V» («Sanyo»). Через каждый час отдельные аликвоты раствора вынимали из камеры хранения, размораживали при комнатной температуре в течение 20–30 мин, готовили рабочие (двукратные) разведения в дистиллированной воде в диапазоне концентраций 0,016–1,000 мг/л и заполняли ими 96-луночный планшет.

Инокуляты всех тест-штаммов готовили в физиологическом растворе с концентрацией 1–2 × 10⁸ КОЕ/мл и по 0,1 мл добавляли в 9,9 мл МХБ с двойной концентрацией. Инокуляты в МХБ вносили в соотношении 1 : 1 в подготовленные планшеты, которые инкубировали при 35 ± 1°C в течение 18 ± 2 ч, планшеты с S. pneumoniae ATCC 49619 — в атмосфере 4–6% СО₂. Учёт результатов проводили по методологии EUCAST.

Результаты обрабатывали при помощи пакета программ «MS Excel». Достоверность различных средних величин оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Для сравнительного анализа использовали двусторонний критерий Фишера. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты

МПК тигециклина для всех тест-штаммов при использовании базовых растворов, хранившихся при 2–6°С до 3 ч, соответствовали целевым значениям, а при дальнейшем хранении до 5 ч — входили в допустимый интервал (табл. 1). Далее с увеличением времени хранения значения МПК превышали допустимый интервал.

 

Таблица 1. Влияние времени хранения при 2–6°С базового раствора тигециклина на величину МПК, мг/л

Время хранения базового (основного) раствора тигециклина	E. соli АТСС 25922	S. aureus АТСС 29213	E. faecalis ATCC 29212	S. pneumoniae ATCC 49619
0 ч (контроль)	0,06–0,12	0,06–0,12	0,03–0,06	0,03–0,06
1–2 ч	0,06–0,12	0,06–0,12	0,03–0,06	0,03–0,06
3 ч	0,06–0,12	0,06–0,12	0,03–0,06	0,03–0,06
4 ч	0,12–0,25	0,12–0,25	0,03–0,12	0,06–0,12
5 ч	0,12–0,25	0,12–0,25	0,06–0,12	0,06–0,12
6 ч	0,5–1,0	0,5–1,0	0,5–1,0	0,5–1,0
7 ч	0,5–1,0	0,5–1,0	0,5–1,0	0,5–1,0
8–10 ч	≥ 1,0	≥ 1,0	≥ 1,0	≥ 1,0
Допустимый интервал, мг/л	0,03–0,25	0,03–0,25	0,03–0,12	0,016–0,12
Целевые значения, мг/л	0,06–0,12	0,06–0,12	0,06	0,03–0,06

 

Величина МПК тигециклина для всех тест-штаммов при использовании базовых растворов антибиотика, хранившихся при –70°С до 31 сут, соответствовала целевым значениям, при дальнейшем хранении до 43 сут — входила в допустимые интервалы (табл. 2). Более длительное хранение (≥ 44 сут) приводило к получению значений МПК для всех 4 тест-штаммов, превышающих допустимые диапазоны.

 

Таблица 2. Влияние времени хранения при –70°С базовых растворов тигециклина на значение МПК, мг/л

Время хранения растворов тигециклина, сут	E. соli АТСС 25922	S. aureus АТСС 29213	E. faecalis ATCC 29212	S. pneumoniae ATCC 49619
1–18	0,06–0,12	0,06–0,12	0,03–0,06	0,03–0,06
19–31	0,06–0,12	0,06–0,12	0,03–0,06	0,03–0,06
32–43	0,12–0,25	0,12–0,25	0,06–0,12	0,06–0,12
44–56	0,5–1,0	0,5–1,0	0,25–0,50	0,25–0,50
57–68	0,5–1,0	0,5–1,0	0,25–0,50	0,25–0,50
69–80	0,5–1,0	0,5–1,0	0,5–1,0	0,5–1,0
≥ 81	≥ 1,0	≥ 1,0	≥ 1,0	≥ 1,0
Допустимый интервал, мг/л	0,03–0,25	0,03–0,25	0,03–0,12	0,016–0,120
Целевые значения, мг/л	0,06–0,12	0,06–0,12	0,06	0,03–0,06

 

Результаты, полученные на первом этапе исследования, показали, что активность базовых растворов тигециклина сохранялась более длительное время при –70°С (до 43 сут), чем при 2–6°С (не более 5 ч), что обеспечивало получение МПК тигециклина для всех тест-штаммов в допустимых интервалах значений.

Второй этап исследования посвящен изучению влияния добавки оксиразы на величину МПК тигециклина для 4 тест-штаммов. Увеличение концентрации оксиразы способствовало более длительному хранению базовых растворов тигециклина при –2–6°С по сравнению с растворами без стабилизатора, т. к. полученные значения МПК для исследованных тест-штаммов соответствовали допустимым значениям более длительное время (рисунок, табл. 3). Добавление оксиразы в концентрациях 5 и 8% к базовому раствору тигециклина увеличивало время его хранения при 2–6°С с 4–5 ч до 16 сут и обеспечивало получение допустимых значений МПК для 4 тест-штаммов.

 

Зависимость значений МПК тигециклина для E. coli ATCC 25922 (а), S. aureus ATCC 29213 (б), E. faecalis ATCC 29212 (в) и S. pneumoniae ATCC 49619 (г) от концентрации оксиразы, добавленной в базовые растворы антибиотика, и сроков их хранения при 2–6°С.

 

Таблица 3. Сроки хранения при 2–6°С базовых растворов тигециклина при различных концентрациях оксиразы, обеспечивающие получение допустимых значений МПК, сут

Тест-штаммы	Без оксиразы	Концентрация оксиразы, %
		2	3	5	8
E. соli АТСС 25922	5 ч	7	9	16	16
S. aureus АТСС 29213	5 ч	7	8	16	16
E. faecalis ATCC 29212	4 ч	7	9	16	16
S. pneumoniae ATCC 49619	5 ч	6	8	16	16

 

Результаты измерений МПК тигециклина для тест-штаммов, полученные с помощью стабилизированных оксиразой базовых растворов антибиотика в процессе хранения при –70°С, приведены в табл. 4. Для удобства результаты МПК представлены в условных единицах: средние значения МПК из 3 измерений, входящие в допустимый интервал, обозначали «С» (Correct); средние значения из 3 измерений, превышающие допустимый интервал, обозначали «HE» (High error).

 

Таблица 4. Зависимость условных значений МПК тигециклина для тест-штаммов от концентрации оксиразы в базовых растворах антибиотика и сроков их хранения при –70°С

Срок хранения базовых растворов, нед

E. соli АТСС 25922

S. aureus АТСС 29213

E. faecalis ATCC 29212

S. pneumoniae ATCC 49619

2%

3%

5%

8%

2%

3%

5%

8%

2%

3%

5%

8%

2%

3%

5%

8%

0

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

12

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

18

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

28

HE

C

C

C

HE

C

C

C

HE

C

C

C

HE

C

C

C

48

HE

HE

C

C

HE

HE

C

C

HE

HE

C

C

HE

HE

C

C

 

Как видно из табл. 4, использование оксиразы в качестве стабилизатора базовых растворов тигециклина показало, что стабильность данных растворов сохраняется до 18 нед при добавлении 2% оксиразы, до 28 нед при добавлении 3% оксиразы, до 48 нед при добавлении 5 или 8% оксиразы и приводит к получению значений МПК тигециклина для всех исследованных тест-штаммов, соответствующих допустимым величинам (С).

Обсуждение

В настоящее время тигециклин является препаратом выбора при лечении многих тяжёлых инфекций, вызванных микроорганизмами с множественной лекарственной устойчивостью. Из-за своей антибактериальной активности широкого спектра действия тигециклин часто применяют эмпирически, что приводит к появлению устойчивых к нему бактерий [17].

Поэтому лечение инфекционных болезней, в том числе тигециклином, целесообразно проводить на основе результатов идентификации возбудителя и определения чувствительности к антимикробным препаратам.

Определение чувствительности к тигециклину методом микроразведений в бульоне сопряжено с проблемой, связанной с его нестабильностью в водных растворах. Для получения достоверных результатов тестирования стандартами CLSI и EUCAST предложено использовать свежеприготовленный МХБ.

В данном исследовании изучено влияние различных способов стабилизации базовых водных растворов тигециклина: с помощью изменения температуры хранения и использования стабилизатора оксиразы в различных концентрациях для 4 тест-штаммов, включая тест-штамм со сложными питательными потребностями — S. pneumoniae ATCC 49619.

В ходе исследования использован заранее приготовленный МХБ и хранившийся в течение 24–48 ч. Определено, что при 2–6°С стабильность базовых растворов тигециклина без оксиразы сохраняется не более 5 ч, а с 5 и 8% оксиразы увеличивается до 16 сут. При хранении данных растворов без оксиразы при –70°С их стабильность увеличивается до 43 сут, а с добавлением 5 и 8% оксиразы — минимум до 48 нед. Полученные результаты коррелируются с опубликованными данными [12, 14, 16], в которых показано, что активность тигециклина в МХБ сохраняется до 6 нед (42 сут) при –17–18°С, а при 4–6°С с добавлением 2% растворов оксиразы — до 7 сут (табл. 3).

В ряде публикаций авторы отмечают, что оксираза и химически чистая субстанция тигециклина — достаточно дорогостоящие продукты [12–14]. Проведённые нами расчёты затрат показали, что из 5 мг химически чистой субстанции тигециклина (по цене в среднем 45 000 руб./5 мг) можно приготовить более 200 планшетов с рабочим диапазоном концентраций тигециклина (0,06–4,00) мг/л. При этом затраты на приготовление одного планшета составят около 270 руб. (с учётом стоимости самого планшета)⁸. Метод микроразведений в бульоне является трудоёмким процессом, поэтому не каждая бактериологическая лаборатория может использовать за один опыт такое количество планшетов. Неиспользованный базовый раствор тигециклина можно разлить по аликвотам в криопробирки и хранить при отрицательных температурах до следующего использования, а дополнительное введение оксиразы позволит еще увеличить время хранения и возможность использования хранившегося 24–48 ч МХБ. Стоимость того же количества планшетов с добавлением 5% оксиразы увеличивается незначительно (в среднем на 7–10%).

Заключение

Определена возможность стабилизации растворов тигециклина, хранившихся при отрицательных температурах (с добавлением оксиразы и без неё), для получения допустимых значений МПК при определении чувствительности контрольных штаммов к антимикробным препаратам. Применение данных растворов позволило снизить затраты на тестирование за счет рационального использования антибиотика. В дальнейшем будут продолжены работы по изучению возможности использования данных растворов тигециклина при тестировании клинических штаммов.

 

¹ WHO. Critically important antimicrobials for human medicine (6th revision ed.) URL: https://www.who.int/publications/i/item/9789241515528 (дата обращения: 03.03.2025).

² Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Thirty-third Informational Supplement. CLSI document M100, 33rd Edition. USA; 2022. 402 p.

³ European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters (Version 15.0). URL.: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_15.0_Breakpoint_Tables.pdf (дата обращения: 12.03.2025).

⁴ Российские рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 2024-02). URL: https://www.antibiotic.ru/files/334/ocmap2024.pdf

⁵ Fawzi M.B., Zhu T., Shah S.M. Tigecycline compositions and methods of preparation (patent). United States US-8975242-B2. 2011. URL.: https://patentimages.storage.googleapis.com/c2/25/07/73a12f6c15cdfa/US8975242.pdf (дата обращения: 07.03.2025).

⁶ Справочник лекарственных средств. Тигацил. Инструкция по применению. 2024. URL: https://www.vidal.ru/drugs/tigacil__23094 (дата обращения 12.03.2025).

⁷ ГОСТ Р ИСО 20776-1-2022 Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод микроразведений в бульоне для лабораторного исследования активности антимикробных агентов по отношению к быстрорастущим аэробным бактериям, вызывающим инфекционные заболевания. 2022, 20 с.

⁸ Merck — электронный каталог химических веществ, реагентов, расходных материалов для научных исследований и промышленности. URL: https://www.sigmaaldrich.com/RU/en/search/pz0021-5mg?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=PZ0021-5MG&type=product (дата обращения: 10.03.2025).

About the authors

Irina S. Kosilova

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Author for correspondence.
Email: kosilova.irina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4020-0894

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Nutrient medium development laboratory

Россия, Obolensk, Moscow Region

Lyubov V. Domotenko

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: domotenko@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0002-4785-6418

Cand. Sci. (Chem.), leading researcher, Nutrient medium development laboratory

Россия, Obolensk, Moscow Region

Mikhail V. Khramov

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology

Email: khramov@obolensk.org
ORCID iD: 0000-0002-4553-3826

Cand. Sci. (Med.), Deputy director for quality and development

Россия, Obolensk, Moscow Region

References

Supplementary files