Whole-genome sequencing of two clinical strains of Mycobacterium tuberculosis with phenotypic susceptibility to rifampicin but predicted resistance by Xpert MTB/RIF

Cover Image


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. More than 40% of Mycobacterium tuberculosis strains are resistant to rifampicin (RIF) and isoniazid, the first-line drugs. The tuberculosis pathogen becomes resistant to RIF mainly due to mutations in the rpoB gene. The aim of the study was to search for the most probable compensatory mutations in the rpoA, rpoB and rpoC genes encoding α-, β- and β′-subunits of M. tuberculosis RNA polymerase.

Materials and methods. A cross-sectional analysis of phenotypic and genetic resistance to RIF among 2298 clinical strains of M. tuberculosis revealed 8 cases in which resistance as determined by the Xpert Ultra MTB/RIF test was not confirmed bacteriologically. In all cases, these were chronic multidrug-resistant or extensively drug-resistant M. tuberculosis patients in whom RIF was discontinued due to the detection of resistance to this drug in the isolated strains. Two strains were obtained for genotype testing, Sanger sequencing and whole-genome sequencing.

Results. Repeat Xpert Ultra MTB/RIF test, Sanger sequencing and whole genome sequencing revealed the presence of a single S450L mutation in the rpoB gene with phenotypic sensitivity in both strains. Phylogenetic analysis revealed that both genomes belonged to the Beijing B0/W148 genotype. The strains were characterized by a higher growth rate than the other isolates. Two potential compensatory mutations V483G and H748P in the groC gene were identified in the absence of other significant changes in the rpoA and rpoB genes.

Conclusion. It is suggested that the phenomenon of discrepancy between results of bacteriological and molecular genetic tests is associated with the acquisition of compensatory mutations in the groC gene during RIF treatment of Beijing B0/W148 strains, and the identified mutations affect the conformation of the β'-subunit, restoring the transcription efficiency of affected by the major S450L mutation.

Full Text

Введение

Туберкулёз с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) развивается у больных, которым назначаются рифампицин (RIF) и изониазид — наиболее эффективные противотуберкулёзные препараты (ПТП), называемые также препаратами первого ряда1. В глобальном масштабе более 40% штаммов Mycobacterium tuberculosis (МБТ) становятся МЛУ или как минимум устойчивыми к RIF. RIF связывается близко к активному сайту в субъединице β (ген rpoB) фермента РНК-полимеразы бактерий [1] в области, определяющей устойчивость к RIF (RRDR). Связывание RIF с RRDR стерически затрудняет элонгацию вновь синтезируемой РНК, что в конечном итоге блокирует синтез белков микробной клеткой. У МБТ нет известного механизма горизонтального переноса генов, устойчивость RIF в основном возникает из-за хромосомных мутаций в пределах RRDR [2]. Плата за устойчивость к RIF весьма высока и выражается у МБТ в большинстве случаев в снижении скорости роста и меньшей конкурентоспособности RIF-устойчивых мутантов относительно предковых чувствительных форм [3]. Однако замечено, что формы МБТ с низкой приспособленностью могут со временем частично или полностью восстанавливать фенотипические свойства, в частности увеличивать скорость роста за счёт появления так называемых компенсаторных мутаций [4]. Идентификация компенсаторных мутаций весьма сложна и зависит от используемой методики.

Молекулярно-эпидемиологические исследования геномов Beijing B0/W148, относящегося к генетической линии L2 [5, 6], свидетельствуют о том, что более 95% клинических штаммов этого генотипа содержат мутации в RRDR и являются одним из ключевых факторов эпидемического распространения туберкулёза с первичной лекарственной устойчивостью к RIF в России [6, 7]. Практически 90% этих штаммов несут наиболее распространённую аминокислотную замену S450L (нуклеотидная замена C→T в 761155-й позиции генома) [6], при этом отмечено, что генетическая цена этой замены в RRDR гена rpoB для мутантов — наименьшая [2].

Цель исследования: поиск наиболее вероятных компенсаторных мутаций в генах rpoA, rpoB и rpoC, кодирующих α-, β- и β′-субъединицы РНК-полимеразы МБТ, вызывающих появление феномена фенотипической чувствительности к RIF.

Материалы и методы

Проведён ретроспективный перекрёстный анализ Xpert Ultra MTB/RIF и фенотипических бактериологических результатов за 2022 г., полученных в лабораторном отделении Иркутской областной клинической туберкулёзной больницы. Исследование проводилось при добровольном информированном письменном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека (протокол № 2 от 18.02.2020).

Исследовано 2298 образцов, из них 529 чувствительных к RIF, 363 — устойчивых; у 90 чувствительность к RIF при использовании Xpert Ultra MTB/RIF не определена. Основная причина отсутствия положительного результата ПЦР — низкая концентрация мишени при проведении Xpert Ultra MTB/RIF. В 8 случаях устойчивость, определяемая тестом Xpert Ultra, в мокроте не была подтверждена бактериологическими методами. Во всех случаях это были хронические больные туберкулёзом с МЛУ или широкой лекарственной устойчивостью, которым был отменён RIF по причине наличия или приобретения устойчивости к этому препарату у ранее выделенного штамма.

Для проведения повторного Xpert Ultra MTB/RIF, исследования генотипа, секвенирования по Сэнгеру и полногеномного секвенирования (WGS) были получены 2 штамма (табл. 1). Выделение ДНК, приготовление библиотек, WGS и биоинформатический, филогенетический и статистический анализ проводили, как описано ранее [6]. Первичные нуклеотидные последовательности депонированы в биопроект PRJNA1215569 NCBI. Устойчивость к ПТП определяли на бактериологическом анализаторе «BD Bactec» («Becton Dickinson») и на среде Левенштейна–Йенсена согласно Приказу Минздрава России от 21.03.2003 № 109 (ред. от 05.06.2017). Генетическую гетерорезистентность в отдельных позициях генома определяли по числу альтернативных коротких прочтений при проведении WGS, как описано ранее [8].

 

Таблица 1. Характеристика изолятов M. tuberculosis

Группа учёта больного

ВИЧ

Лекарственная устойчивость

Генотип

Irk1

Неэффективный курс лечения туберкулёза

+

К изониазиду, RIF*, капреомицину, пиразинамиду, протианамиду, бедаквилину, линезолиду

Beijing B0/W148

Irk2

Рецидив туберкулёза

_

К изониазиду, RIF*, этамбутолу, капреомицину, пиразинамиду, левофлоксацину, бедаквилину, линезолиду

Beijing B0/W148

Примечание. *По результатам Xpert Ultra MTB/RIF, но не микробиологического теста.

 

Вероятность замены аминокислот в обнаруженных мутациях была исследована с использованием двух подходов: PAM-матриц (Point Accepted Mutation matrices) — PAM30 и PAM250 [9] и алгоритма SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) для предсказания аминокислотных замен, влияющих на функцию белка [10].

Результаты

Повторный тест Xpert Ultra MTB/RIF, секвенирование по Сэнгеру и WGS выявили наличие единственной мутации S450L в гене rpoB при наличии фенотипической чувствительности у обоих штаммов. При филогенетическом анализе выяснено, что оба генома принадлежат к генотипу Beijing B0/W148. Штаммы отличались более высокой скоростью роста, чем другие изоляты. После выяснения генотипической принадлежности исследуемых штаммов к генотипу Beijing B0/W148 в качестве модельных геномов были использованы 513 полных геномов B0/W148 из онлайн-сервиса Short Read Archive (NCBI), опубликованных в период с 1995 по 2020 г. для штаммов из Северной Евразии.

Для этого набора геномов всего обнаружено 34 миссенс-мутаций в гене rpoB [11]. Мутации 1-го уровня значимости были в 9 вариантах; 2-го уровня — в 2; 3-го уровня — в 20 (табл. 2). Также в гене rpoB были обнаружены 3 мутации, отсутствующие в описании каталога ВОЗ: E82G, I90M, R219G. В гене rpoC обнаружены 45 миссенс-мутации, все они относились к мутациям 2-го уровня значимости (табл. 1). В гене rpoA обнаружено только 5 миссенс-мутаций, также относящихся к мутациям 2-го уровня значимости (табл. 1).

 

Таблица 2. Наличие мутаций 1, 2 и 3-го уровней значимости [11]

Ген

Мутации 1-го уровня значимости

Мутации 2-го уровня значимости

Мутации 3-го уровня значимости

rpoB

L430P; Q432P; D435V; D435Y; H445D; H445L; S450L; L452P; H723D

T427A; S431R

P45S; G79S; V305I; G376V; T400A; P454S; I491M; V496A; L554P; Y564H; S672Y; L731P; V800A; R827C; R827L; H835P; G836S; K891E; Q980K; R1008C

rpoC

Нет

E187G; G311R; G332S; G433C; P434A; P434L; K445R; L449R; F452C; V483G; D485N; E488Q; I491V; I491T; L507V; L516P; V517L; G519S; A521D; Q523E; H525N; L527V; L558L; Y586H; Q693H; N698H; N698S; N698K; E702K; D735N; D735E; D747A; H748P; E757A; R770H; T812I; S838C; D943N; D943G; M983I; P1040S; P1040R; I1046M; V1147A; K1152N

Нет

rpoA

Нет

G31C; R153R; T187P; V183A; R182Q

Нет

 

В 2 исследованных штаммах обнаружены следующие комбинации мутаций. В штамме Irk1 rpoB S450L; rpoC H748P; в штамме Irk2 rpoB S450L; rpoC V483G. Интересно, что аналогичный случай лекарственной чувствительности при наличии комбинации мутаций rpoB S450L; rpoC V483G был описан в 2024 г. у штамма Евро-Американской линии (4.2.2.2.1) [12]. Однако авторы предположили, что полученный результат является лабораторной ошибкой, связанной с использованием завышенных концентраций RIF при тестировании. Мутация H748P в гене rpoC в окончательной версии статьи не рассматривается как компенсаторная, хотя она была описана в качестве таковой в исходной рукописи этих же авторов2 [12].

Тестируемые геномы Irk1 и Irk2 занимают наиболее высокие позиции по значениям гетерорезистентности (214 и 212) в позиции 761155 (нуклеотидная замена rpoB S450L; рисунок). Наибольшая гетерорезистентность (235), выражающаяся в наличии альтернативных коротких прочтений при WGS на исследуемую позицию, наблюдалась только у одного генома из Якутии, выделенного в 2013 г. Проведено исследование вероятности появления обнаруженных замен аминокислот в гене rpoC с использованием двух подходов: PAM-матриц (Point Accepted Mutation matrices) — PAM30 и PAM250 [9] и алгоритма SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) [10]. Для предсказания аминокислотных замен, влияющих на функцию белка, PAM-матрицы использовали для оценки вероятности замены аминокислот в процессе эволюции [9]. Алгоритмом SIFT определяли, влияют ли аминокислотные замены на функцию белка, используя эволюционную информацию и выравнивание гомологичных последовательностей [10].

 

Оценка гетерорезистентности выборки из 515 геномов в позиции 761155 (нуклеотидная замена rpoB S450L).

 

Для V483G (IRK2) получено значение SIFT 0,00 указывающее на низкую толерантность, что может свидетельствовать о значительном влиянии этой замены на функцию β'-субъединицы РНК-полимеразы. Однако умеренные значения PAM10 (0) и PAM250 (–1) предполагают, что эта мутация не приводит к полной потере функции и может стабилизировать комплекс РНК-полимеразы, компенсируя дестабилизацию, вызванную S450L. В свою очередь, мутация H748P (IRK1) с SIFT 0,05 и PAM250 (–3) демонстрирует умеренную толерантность, что указывает на небольшое негативное воздействие на белок. Можно предположить, что указанные мутации влияют на конформацию β'-субъединицы, восстанавливая эффективность транскрипции, вызванную мажорной мутацией S450L, где V483G может играть более выраженную компенсаторную роль.

Обсуждение

Феномен появления «чувствительности» у штаммов наблюдался нами и ранее в рамках двух международных проектов [8] при последовательном определении минимальной ингибирующей концентрации у штаммов МБТ от одного больного. Было неоднократно замечено (данные не опубликованы), что отмена некоторых ПТП, в том числе RIF, ведёт к уменьшению минимальной ингибирующей концентрации вплоть до значений «пограничной чувствительности», определяемой производителем наборов «Sensititre MYCOTB» («TREK Diagnostics»). Основной гипотезой, которая могла бы объяснить этот феномен, было предположение, что в популяции возбудителя после отмены ПТП из пула персистеров начинают более активно размножаться чувствительные к данному антибиотику клоны [8]. Генотип Beijing B0/W148, более чем в 95% случаев несёт устойчивость к RIF при первичном заражении, т. е. все необходимые компенсаторные мутации для выживания вне организма он уже получил в процессе эволюции. Ключевой вопрос: какие фитнесс-мутации приводят к появлению феномена «чувствительности» на фоне наличия мажорной мутации rpoB S450L? Обнаруженные нами миссенс-мутации V483G и H748P в гене rpoС при отсутствии других значимых изменений в генах rpoA и rpoB могут свидетельствовать о том, что отмена некоторых ПТП может приводить к появлению компенсаторных фитнесс-мутаций, проявляющихся как «чувствительность» к ПТП при наличии основной замены, определяемой при проведении клинической ПЦР. Можно также предположить, что на фоне высокой гетерогенности по гену rpoB в популяции возбудителя описываемая комбинация мутаций S450L совместно с V483G/H748P находится под действия стабилизирующего отбора только на фоне лечения RIF. Отмена RIF приводит к постепенному возвращению популяции возбудителя к более устойчивой модели, при которой клоны, содержащие V483G/H748P и другие фитнес-мутации, элиминируются. Источником этого являются персисторы с S450L, но без мутаций в гене rpoC.

Выводы

Можно предположить, что феномен расхождения бактериологических и молекулярно-генетических результатов связан с приобретением в процессе лечения RIF штаммами Beijing B0/W148 компенсаторных мутаций в гене rpoС. Выявленные мутации влияют на конформацию β'-субъединицы, восстанавливая эффективность транскрипции, вызванную мажорной мутацией S450L. Необходимы дальнейшие исследования феномена уменьшения устойчивости к ПТП у возбудителя туберкулёза после его отмены.

 

1 WHO. Global tuberculosis report 2024. Geneva: World Health Organization; 2024. URL: https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024

2 URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.22.481565v1.full.pdf

×

About the authors

Oleg B. Ogarkov

Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems

Author for correspondence.
Email: obogarkov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3168-1983

Dr. Sci. (Med.), Director, Institute of Epidemiology and Microbiology

Россия, Irkutsk

Viacheslav V. Sinkov

Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: vsinkov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3396-9590

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of epidemiologically and socially significant infections

Россия, Irkutsk

Tatyana A. Kuhtina

Irkutsk Regional Clinical Tuberculosis Hospital

Email: tuyanatsta@mail.ru

bacteriologist, Head, Bacteriological laboratory

Россия, Irkutsk

Svetlana N. Zhdanova

Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: svetnii@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7160-9700

Dr. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of epidemiologically and socially significant infections, Institute of Epidemiology and Microbiology

Россия, Irkutsk

Ilya G. Kondratov

Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: kondratovig@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2631-4724

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Laboratory of epidemiologically and socially significant infections, Institute of Epidemiology and Microbiology

Россия, Irkutsk

References

  1. Lin W., Mandal S., Degen D., et al. Structural basis of Mycobacterium tuberculosis transcription and transcription inhibition. Mol. Cell. 2017;66(2):169–79.e8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001
  2. Brunner V.M., Fowler P.W. Compensatory mutations are associated with increased in vitro growth in resistant clinical samples of Mycobacterium tuberculosis. Microb. Genom. 2024;10(2): 001187. DOI: https://doi.org/10.1099/mgen.0.001187
  3. Gagneux S., Long C.D., Small P.M., et al. The competitive cost of antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis. Science. 2006;312(5782):1944–6. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1124410
  4. Alame Emane A.K., Guo X., Takiff H.E., Liu S. Drug resistance, fitness and compensatory mutations in Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb.). 2021;129:102091. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tube.2021.102091
  5. Merker M., Rasigade J.P., Barbier M., et al. Transcontinental spread and evolution of Mycobacterium tuberculosis W148 European/Russian clade toward extensively drug resistant tuberculosis. Nat. Commun. 2022;13(1):5105. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32455-1
  6. Синьков В.В., Огарков О.Б. Популяционная структура субтипа B0/W148 Mycobacterium tuberculosis: филогенетический анализ и особенности генотипической лекарственной устойчивости. Acta Biomedica Scientifica. 2024;9(4):248–59. Sinkov V.V., Ogarkov O.V. Population structure of the B0/W148 Mycobacterium tuberculosis subtype: Phylogenetic analysis and characteristics of genotypic drug resistance. Acta Biomedica Scientifica. 2024;9(4):248–59. DOI: https://doi.org/10.29413/ABS.2024-9.4.27
  7. Хромова П.А., Синьков В.В., Савилов Е.Д. и др. Распространение эндемичных субклонов Beijing B0/W148 M. tuberculosis на территориях Сибирского и Дальневосточного федеральных округов по результатам полногеномного секвенирования. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2020;19(3):41–5. Khromova P.A., Sinkov V.V., Savilov E.D., et al. Dispersal of Beijing b0/w148 M. tuberculosis endemic subclones in territories of the Siberia and Far Eastern Federal District by whole genome study. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2020;19(3):41–5. DOI: https://doi.org/10.31631/2073-3046-2020-19-3-41-45 EDN: https://elibrary.ru/anmivn
  8. Operario D.J., Koeppel A.F., Turner S.D., et al. Prevalence and extent of heteroresistance by next generation sequencing of multidrug-resistant tuberculosis. PLoS One. 2017;12(5):e0176522. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181284
  9. Dayhoff M.O. A model of evolutionary change in proteins. In: Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5. Washington;1972:89–99.
  10. Ng P.C., Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 2003;31(13):3812–4. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkg509
  11. Walker T.M., Miotto P., Köser C.U., et al. The 2021 WHO catalogue of Mycobacterium tuberculosis complex mutations associated with drug resistance: а genotypic analysis. Lancet Microbe. 2022;3(4):e265–73. DOI: https://doi.org/10.1016/S2666-5247(21)00301-3
  12. Conkle-Gutierrez D., Ramirez-Busby S.M., Gorman B.M., et al. Novel and reported compensatory mutations in rpoABC genes found in drug resistant tuberculosis outbreaks. Front. Microbiol. 2024;8(14):1265390. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1265390

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
2. Evaluation of heteroresistance of a sample of 515 genomes at position 761155 (rpoB nucleotide substitution - S450L).

Download (553KB)

Copyright (c) 2025 Ogarkov O.B., Sinkov V.V., Kuhtina T.A., Zhdanova S.N., Kondratov I.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies