Отправить статью по E-mail Полногеномное секвенирование двух клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis c фенотипической чувствительностью к рифампицину при прогнозируемой Xpert MTB/RIF устойчивости
- Авторы: Огарков О.Б.1, Синьков В.В.1, Кухтина Т.А.2, Жданова С.Н.1, Кондратов И.Г.2
-
Учреждения:
- Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека
- Иркутская областная клиническая туберкулёзная больница
- Выпуск: Том 102, № 3 (2025)
- Страницы: 343-349
- Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18754
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-644
- EDN: https://elibrary.ru/SCQHMA
- ID: 18754
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Введение. Более 40% штаммов Mycobacterium tuberculosis устойчивы к рифампицину (RIF) и изониазиду — препаратам первого ряда. Возбудитель туберкулёза приобретает устойчивость к RIF главным образом за счёт мутаций в гене rpoB.
Цель исследования — поиск наиболее вероятных компенсаторных мутаций в генах rpoA, rpoB и rpoC, кодирующих α-, β- и β′-субъединицы РНК-полимеразы M. tuberculosis.
Материалы и методы. Перекрёстный анализ фенотипической и генетической устойчивости к RIF среди 2298 клинических штаммов M. tuberculosis выявил 8 случаев, когда устойчивость, определённая тестом Xpert Ultra MTB/RIF, не подтверждалась бактериологическим методом. Во всех случаях это были хронические больные туберкулёзом с множественной или широкой лекарственной устойчивостью, у которых был отменён RIF по причине обнаружения устойчивости к этому препарату у выделенного штамма. Для исследования генотипа, секвенирования по Сэнгеру и полногеномного секвенирования были получены 2 штамма.
Результаты. Повторный тест Xpert Ultra MTB/RIF, секвенирование по Сэнгеру и полногеномное секвенирование выявили наличие единственной мутации S450L в гене rpoB при наличии фенотипической чувствительности у обоих штаммов. При филогенетическом анализе выяснено, что оба генома принадлежали к генотипу Beijing B0/W148. Штаммы отличались более высокой скоростью роста, чем другие изоляты. Выявлены две потенциальные компенсаторные мутации V483G и H748P в гене rpoС при отсутствии других значимых изменений в генах rpoA и rpoB.
Заключение. Высказано предположение, что феномен расхождения бактериологических и молекулярно-генетических результатов связан с приобретением в процессе лечения RIF штаммами Beijing B0/W148 компенсаторных мутаций в гене rpoС, а выявленные мутации влияют на конформацию β'-субъединицы, восстанавливая эффективность транскрипции, вызванную мажорной мутацией S450L.
Ключевые слова
Полный текст
Введение
Туберкулёз с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) развивается у больных, которым назначаются рифампицин (RIF) и изониазид — наиболее эффективные противотуберкулёзные препараты (ПТП), называемые также препаратами первого ряда1. В глобальном масштабе более 40% штаммов Mycobacterium tuberculosis (МБТ) становятся МЛУ или как минимум устойчивыми к RIF. RIF связывается близко к активному сайту в субъединице β (ген rpoB) фермента РНК-полимеразы бактерий [1] в области, определяющей устойчивость к RIF (RRDR). Связывание RIF с RRDR стерически затрудняет элонгацию вновь синтезируемой РНК, что в конечном итоге блокирует синтез белков микробной клеткой. У МБТ нет известного механизма горизонтального переноса генов, устойчивость RIF в основном возникает из-за хромосомных мутаций в пределах RRDR [2]. Плата за устойчивость к RIF весьма высока и выражается у МБТ в большинстве случаев в снижении скорости роста и меньшей конкурентоспособности RIF-устойчивых мутантов относительно предковых чувствительных форм [3]. Однако замечено, что формы МБТ с низкой приспособленностью могут со временем частично или полностью восстанавливать фенотипические свойства, в частности увеличивать скорость роста за счёт появления так называемых компенсаторных мутаций [4]. Идентификация компенсаторных мутаций весьма сложна и зависит от используемой методики.
Молекулярно-эпидемиологические исследования геномов Beijing B0/W148, относящегося к генетической линии L2 [5, 6], свидетельствуют о том, что более 95% клинических штаммов этого генотипа содержат мутации в RRDR и являются одним из ключевых факторов эпидемического распространения туберкулёза с первичной лекарственной устойчивостью к RIF в России [6, 7]. Практически 90% этих штаммов несут наиболее распространённую аминокислотную замену S450L (нуклеотидная замена C→T в 761155-й позиции генома) [6], при этом отмечено, что генетическая цена этой замены в RRDR гена rpoB для мутантов — наименьшая [2].
Цель исследования: поиск наиболее вероятных компенсаторных мутаций в генах rpoA, rpoB и rpoC, кодирующих α-, β- и β′-субъединицы РНК-полимеразы МБТ, вызывающих появление феномена фенотипической чувствительности к RIF.
Материалы и методы
Проведён ретроспективный перекрёстный анализ Xpert Ultra MTB/RIF и фенотипических бактериологических результатов за 2022 г., полученных в лабораторном отделении Иркутской областной клинической туберкулёзной больницы. Исследование проводилось при добровольном информированном письменном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека (протокол № 2 от 18.02.2020).
Исследовано 2298 образцов, из них 529 чувствительных к RIF, 363 — устойчивых; у 90 чувствительность к RIF при использовании Xpert Ultra MTB/RIF не определена. Основная причина отсутствия положительного результата ПЦР — низкая концентрация мишени при проведении Xpert Ultra MTB/RIF. В 8 случаях устойчивость, определяемая тестом Xpert Ultra, в мокроте не была подтверждена бактериологическими методами. Во всех случаях это были хронические больные туберкулёзом с МЛУ или широкой лекарственной устойчивостью, которым был отменён RIF по причине наличия или приобретения устойчивости к этому препарату у ранее выделенного штамма.
Для проведения повторного Xpert Ultra MTB/RIF, исследования генотипа, секвенирования по Сэнгеру и полногеномного секвенирования (WGS) были получены 2 штамма (табл. 1). Выделение ДНК, приготовление библиотек, WGS и биоинформатический, филогенетический и статистический анализ проводили, как описано ранее [6]. Первичные нуклеотидные последовательности депонированы в биопроект PRJNA1215569 NCBI. Устойчивость к ПТП определяли на бактериологическом анализаторе «BD Bactec» («Becton Dickinson») и на среде Левенштейна–Йенсена согласно Приказу Минздрава России от 21.03.2003 № 109 (ред. от 05.06.2017). Генетическую гетерорезистентность в отдельных позициях генома определяли по числу альтернативных коротких прочтений при проведении WGS, как описано ранее [8].
Таблица 1. Характеристика изолятов M. tuberculosis
№ | Группа учёта больного | ВИЧ | Лекарственная устойчивость | Генотип |
Irk1 | Неэффективный курс лечения туберкулёза | + | К изониазиду, RIF*, капреомицину, пиразинамиду, протианамиду, бедаквилину, линезолиду | Beijing B0/W148 |
Irk2 | Рецидив туберкулёза | _ | К изониазиду, RIF*, этамбутолу, капреомицину, пиразинамиду, левофлоксацину, бедаквилину, линезолиду | Beijing B0/W148 |
Примечание. *По результатам Xpert Ultra MTB/RIF, но не микробиологического теста.
Вероятность замены аминокислот в обнаруженных мутациях была исследована с использованием двух подходов: PAM-матриц (Point Accepted Mutation matrices) — PAM30 и PAM250 [9] и алгоритма SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) для предсказания аминокислотных замен, влияющих на функцию белка [10].
Результаты
Повторный тест Xpert Ultra MTB/RIF, секвенирование по Сэнгеру и WGS выявили наличие единственной мутации S450L в гене rpoB при наличии фенотипической чувствительности у обоих штаммов. При филогенетическом анализе выяснено, что оба генома принадлежат к генотипу Beijing B0/W148. Штаммы отличались более высокой скоростью роста, чем другие изоляты. После выяснения генотипической принадлежности исследуемых штаммов к генотипу Beijing B0/W148 в качестве модельных геномов были использованы 513 полных геномов B0/W148 из онлайн-сервиса Short Read Archive (NCBI), опубликованных в период с 1995 по 2020 г. для штаммов из Северной Евразии.
Для этого набора геномов всего обнаружено 34 миссенс-мутаций в гене rpoB [11]. Мутации 1-го уровня значимости были в 9 вариантах; 2-го уровня — в 2; 3-го уровня — в 20 (табл. 2). Также в гене rpoB были обнаружены 3 мутации, отсутствующие в описании каталога ВОЗ: E82G, I90M, R219G. В гене rpoC обнаружены 45 миссенс-мутации, все они относились к мутациям 2-го уровня значимости (табл. 1). В гене rpoA обнаружено только 5 миссенс-мутаций, также относящихся к мутациям 2-го уровня значимости (табл. 1).
Таблица 2. Наличие мутаций 1, 2 и 3-го уровней значимости [11]
Ген | Мутации 1-го уровня значимости | Мутации 2-го уровня значимости | Мутации 3-го уровня значимости |
rpoB | L430P; Q432P; D435V; D435Y; H445D; H445L; S450L; L452P; H723D | T427A; S431R | P45S; G79S; V305I; G376V; T400A; P454S; I491M; V496A; L554P; Y564H; S672Y; L731P; V800A; R827C; R827L; H835P; G836S; K891E; Q980K; R1008C |
rpoC | Нет | E187G; G311R; G332S; G433C; P434A; P434L; K445R; L449R; F452C; V483G; D485N; E488Q; I491V; I491T; L507V; L516P; V517L; G519S; A521D; Q523E; H525N; L527V; L558L; Y586H; Q693H; N698H; N698S; N698K; E702K; D735N; D735E; D747A; H748P; E757A; R770H; T812I; S838C; D943N; D943G; M983I; P1040S; P1040R; I1046M; V1147A; K1152N | Нет |
rpoA | Нет | G31C; R153R; T187P; V183A; R182Q | Нет |
В 2 исследованных штаммах обнаружены следующие комбинации мутаций. В штамме Irk1 rpoB — S450L; rpoC — H748P; в штамме Irk2 rpoB — S450L; rpoC — V483G. Интересно, что аналогичный случай лекарственной чувствительности при наличии комбинации мутаций rpoB — S450L; rpoC — V483G был описан в 2024 г. у штамма Евро-Американской линии (4.2.2.2.1) [12]. Однако авторы предположили, что полученный результат является лабораторной ошибкой, связанной с использованием завышенных концентраций RIF при тестировании. Мутация H748P в гене rpoC в окончательной версии статьи не рассматривается как компенсаторная, хотя она была описана в качестве таковой в исходной рукописи этих же авторов2 [12].
Тестируемые геномы Irk1 и Irk2 занимают наиболее высокие позиции по значениям гетерорезистентности (214 и 212) в позиции 761155 (нуклеотидная замена rpoB — S450L; рисунок). Наибольшая гетерорезистентность (235), выражающаяся в наличии альтернативных коротких прочтений при WGS на исследуемую позицию, наблюдалась только у одного генома из Якутии, выделенного в 2013 г. Проведено исследование вероятности появления обнаруженных замен аминокислот в гене rpoC с использованием двух подходов: PAM-матриц (Point Accepted Mutation matrices) — PAM30 и PAM250 [9] и алгоритма SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) [10]. Для предсказания аминокислотных замен, влияющих на функцию белка, PAM-матрицы использовали для оценки вероятности замены аминокислот в процессе эволюции [9]. Алгоритмом SIFT определяли, влияют ли аминокислотные замены на функцию белка, используя эволюционную информацию и выравнивание гомологичных последовательностей [10].
Оценка гетерорезистентности выборки из 515 геномов в позиции 761155 (нуклеотидная замена rpoB — S450L).
Для V483G (IRK2) получено значение SIFT 0,00 указывающее на низкую толерантность, что может свидетельствовать о значительном влиянии этой замены на функцию β'-субъединицы РНК-полимеразы. Однако умеренные значения PAM10 (0) и PAM250 (–1) предполагают, что эта мутация не приводит к полной потере функции и может стабилизировать комплекс РНК-полимеразы, компенсируя дестабилизацию, вызванную S450L. В свою очередь, мутация H748P (IRK1) с SIFT 0,05 и PAM250 (–3) демонстрирует умеренную толерантность, что указывает на небольшое негативное воздействие на белок. Можно предположить, что указанные мутации влияют на конформацию β'-субъединицы, восстанавливая эффективность транскрипции, вызванную мажорной мутацией S450L, где V483G может играть более выраженную компенсаторную роль.
Обсуждение
Феномен появления «чувствительности» у штаммов наблюдался нами и ранее в рамках двух международных проектов [8] при последовательном определении минимальной ингибирующей концентрации у штаммов МБТ от одного больного. Было неоднократно замечено (данные не опубликованы), что отмена некоторых ПТП, в том числе RIF, ведёт к уменьшению минимальной ингибирующей концентрации вплоть до значений «пограничной чувствительности», определяемой производителем наборов «Sensititre MYCOTB» («TREK Diagnostics»). Основной гипотезой, которая могла бы объяснить этот феномен, было предположение, что в популяции возбудителя после отмены ПТП из пула персистеров начинают более активно размножаться чувствительные к данному антибиотику клоны [8]. Генотип Beijing B0/W148, более чем в 95% случаев несёт устойчивость к RIF при первичном заражении, т. е. все необходимые компенсаторные мутации для выживания вне организма он уже получил в процессе эволюции. Ключевой вопрос: какие фитнесс-мутации приводят к появлению феномена «чувствительности» на фоне наличия мажорной мутации rpoB — S450L? Обнаруженные нами миссенс-мутации V483G и H748P в гене rpoС при отсутствии других значимых изменений в генах rpoA и rpoB могут свидетельствовать о том, что отмена некоторых ПТП может приводить к появлению компенсаторных фитнесс-мутаций, проявляющихся как «чувствительность» к ПТП при наличии основной замены, определяемой при проведении клинической ПЦР. Можно также предположить, что на фоне высокой гетерогенности по гену rpoB в популяции возбудителя описываемая комбинация мутаций S450L совместно с V483G/H748P находится под действия стабилизирующего отбора только на фоне лечения RIF. Отмена RIF приводит к постепенному возвращению популяции возбудителя к более устойчивой модели, при которой клоны, содержащие V483G/H748P и другие фитнес-мутации, элиминируются. Источником этого являются персисторы с S450L, но без мутаций в гене rpoC.
Выводы
Можно предположить, что феномен расхождения бактериологических и молекулярно-генетических результатов связан с приобретением в процессе лечения RIF штаммами Beijing B0/W148 компенсаторных мутаций в гене rpoС. Выявленные мутации влияют на конформацию β'-субъединицы, восстанавливая эффективность транскрипции, вызванную мажорной мутацией S450L. Необходимы дальнейшие исследования феномена уменьшения устойчивости к ПТП у возбудителя туберкулёза после его отмены.
1 WHO. Global tuberculosis report 2024. Geneva: World Health Organization; 2024. URL: https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024
2 URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.22.481565v1.full.pdf
Об авторах
Олег Борисович Огарков
Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека
Автор, ответственный за переписку.
Email: obogarkov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3168-1983
д-р мед. наук, директор Института эпидемиологии и микробиологии
Россия, ИркутскВячеслав Владимирович Синьков
Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека
Email: vsinkov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3396-9590
канд. мед. наук, с. н. с. лаб. эпидемиологически и социально значимых инфекций Института эпидемиологии и микробиологии
Россия, ИркутскТуяна Анандуевна Кухтина
Иркутская областная клиническая туберкулёзная больница
Email: tuyanatsta@mail.ru
врач-бактериолог, зав. бактериологической лабораторией
Россия, ИркутскСветлана Николаевна Жданова
Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека
Email: svetnii@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7160-9700
д-р мед. наук, в. н. с. лаб. эпидемиологически и социально значимых инфекций Института эпидемиологии и микробиологии
Россия, ИркутскИлья Геннадьевич Кондратов
Иркутская областная клиническая туберкулёзная больница
Email: kondratovig@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2631-4724
канд. биол. наук, н. с. лаб. эпидемиологически и социально значимых инфекций Института эпидемиологии и микробиологии
Россия, ИркутскСписок литературы
- Lin W., Mandal S., Degen D., et al. Structural basis of Mycobacterium tuberculosis transcription and transcription inhibition. Mol. Cell. 2017;66(2):169–79.e8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001
- Brunner V.M., Fowler P.W. Compensatory mutations are associated with increased in vitro growth in resistant clinical samples of Mycobacterium tuberculosis. Microb. Genom. 2024;10(2): 001187. DOI: https://doi.org/10.1099/mgen.0.001187
- Gagneux S., Long C.D., Small P.M., et al. The competitive cost of antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis. Science. 2006;312(5782):1944–6. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1124410
- Alame Emane A.K., Guo X., Takiff H.E., Liu S. Drug resistance, fitness and compensatory mutations in Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb.). 2021;129:102091. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tube.2021.102091
- Merker M., Rasigade J.P., Barbier M., et al. Transcontinental spread and evolution of Mycobacterium tuberculosis W148 European/Russian clade toward extensively drug resistant tuberculosis. Nat. Commun. 2022;13(1):5105. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32455-1
- Синьков В.В., Огарков О.Б. Популяционная структура субтипа B0/W148 Mycobacterium tuberculosis: филогенетический анализ и особенности генотипической лекарственной устойчивости. Acta Biomedica Scientifica. 2024;9(4):248–59. Sinkov V.V., Ogarkov O.V. Population structure of the B0/W148 Mycobacterium tuberculosis subtype: Phylogenetic analysis and characteristics of genotypic drug resistance. Acta Biomedica Scientifica. 2024;9(4):248–59. DOI: https://doi.org/10.29413/ABS.2024-9.4.27
- Хромова П.А., Синьков В.В., Савилов Е.Д. и др. Распространение эндемичных субклонов Beijing B0/W148 M. tuberculosis на территориях Сибирского и Дальневосточного федеральных округов по результатам полногеномного секвенирования. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2020;19(3):41–5. Khromova P.A., Sinkov V.V., Savilov E.D., et al. Dispersal of Beijing b0/w148 M. tuberculosis endemic subclones in territories of the Siberia and Far Eastern Federal District by whole genome study. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2020;19(3):41–5. DOI: https://doi.org/10.31631/2073-3046-2020-19-3-41-45 EDN: https://elibrary.ru/anmivn
- Operario D.J., Koeppel A.F., Turner S.D., et al. Prevalence and extent of heteroresistance by next generation sequencing of multidrug-resistant tuberculosis. PLoS One. 2017;12(5):e0176522. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181284
- Dayhoff M.O. A model of evolutionary change in proteins. In: Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5. Washington;1972:89–99.
- Ng P.C., Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 2003;31(13):3812–4. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkg509
- Walker T.M., Miotto P., Köser C.U., et al. The 2021 WHO catalogue of Mycobacterium tuberculosis complex mutations associated with drug resistance: а genotypic analysis. Lancet Microbe. 2022;3(4):e265–73. DOI: https://doi.org/10.1016/S2666-5247(21)00301-3
- Conkle-Gutierrez D., Ramirez-Busby S.M., Gorman B.M., et al. Novel and reported compensatory mutations in rpoABC genes found in drug resistant tuberculosis outbreaks. Front. Microbiol. 2024;8(14):1265390. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1265390
Дополнительные файлы
