Development of a methodology for molecular genetic monitoring for the cholera causative agent

Full Text

Введение

Седьмая пандемия холеры, вызванная эпидемически значимыми штаммами Vibrio cholerae О1 El Tor, началась в 1961 г. и продолжается до сих пор, её эндемичные очаги сформированы на территории многих стран Азии и Африки. Индийский субконтинент является местом формирования нескольких вариантов V. cholerae, впоследствии распространившихся по всему миру. Территория России не является эндемичной по холере, все зарегистрированные случаи холеры имели завозное происхождение.

Геном возбудителя холеры чрезвычайно пластичен, что приводит к формированию штаммов с повышенной вирулентностью, где, помимо точечных мутаций в различных генах, отмечены различные виды делеций [1–3].

Интенсивное развитие молекулярно-генетических технологий значительно увеличило возможности секвенирования полных геномов бактериальных патогенов с параллельным созданием баз данных, в связи с чем филогенетический анализ является одним из часто используемых методов получения эпидемиологических интерпретаций на основе геномных данных патогенов [4]. Однако нет единого подхода к проведению анализа. Так, данные полногеномного секвенирования (WGS) были использованы при анализе крупной вспышки холеры в Йемене в 2016–2017 гг., что позволило отнести выделяемые штаммы к одной из подлиний 7-й пандемической линии 7PET, которая произошла из Южной Азии и первоначально вызвала вспышки в Восточной Африке [5].

В ряде случаев, несмотря на наличие полных геномов, для проведения анализа используется ограниченное число генов. Так, при изучении штаммов холерных вибрионов О1-серогруппы, циркулирующих в Таиланде, было проведено типирование по однонуклеотидным полимофизмам (single nucleotide polymorphism, SNP) 7 генов «домашнего хозяйства» (adk, gyrB, metE, mdh, pntA, purM и pyrC), что позволило провести дифференциацию клинических и водных изолятов O1 и O139, а также выявить вибрионы, относящиеся к другим серологическим группам [6]. При изучении генетического профиля штаммов V. cholerae O1, выделенных от больных холерой в Дакке и Бангладеш, был проведён филогенетический анализ на основе 4141 SNP, который позволил выявить близкое родство с эпидемическими клонами V. cholerae O1, выделенными в 2010 г. от больных холерой в Пакистане [7]. Т. Ramamurthy и соавт. проведено исследование 136 штаммов V. cholerae El Tor, выделенных в различных регионах мира, по 20 тыс. SNP, что позволило показать существование 8 филогенетических линий [8]. Анализ данных WGS широко используется и отечественными исследователями для выявления клональных связей между различными штаммами V. cholerae [9–11].

Большое значение имеет набор SNP, используемых для анализа. Как правило, он составляется во время проведения исследования для определённой группы анализируемых изолятов V. cholerae. Так, большинство работ посвящено одномоментному изучению ограниченных наборов штаммов [6, 7, 9, 11]. Это, с одной стороны, может являться причиной расхождения результатов даже при изучении геномов одних и тех же штаммов, с другой стороны, такой подход ограничивает возможности проведения постоянного мониторинга с оперативным включением в анализ выделяемых штаммов V. cholerae [12]. На наш взгляд, это делает актуальным разработку методик, основанных на использовании единого перечня SNP, что позволит повысить оперативность проведения анализа при выделении свежих штаммов. Стоит отметить, что подобный подход, предусматривающий анализ по заранее определённому перечню SNP, уже с успехом реализован для возбудителя сибирской язвы [13–15] и туляремии [16, 17].

Одной из задач исследователей в нашей стране является импортозамещение, что предусматривает преодоление зависимости от импортных поставок программных средств и использование преимущественно отечественного программного обеспечения¹. Это подчёркивает актуальность разработки отечественных программных продуктов. Не менее актуальными проблемами являются анализ и визуализация получаемых результатов. Одним из наиболее часто используемых методов анализа является построение дендрограммы, отражающей филогенетические связи между различными штаммами V. cholerae. Однако, чем больше штаммов взято в исследование, тем более громоздкой получается итоговая дендрограмма, что осложняет проведение её анализа. Вместе с тем одним из универсальных инструментов анализа являются геоинформационные системы (ГИС), позволяющие комбинировать пространственные, временны́е и эпидемиологические данные. В настоящее время широкое распространение получили онлайн-ГИС и интерактивные базы данных, размещаемые в сети Интернет, что обеспечивает возможность работы с ними широкому кругу исследователей [18–21].

В связи с этим цель настоящего исследования состояла в разработке методики молекулярно-генетического мониторинга за возбудителем холеры с использованием онлайн-ГИС и анализе с её помощью штаммов, выделенных ранее на территории России.

Материалы и методы

В работе использованы 220 токсигенных (ctxAB⁺tcpA⁺) штаммов V. cholerae О1 El Tor из коллекции Музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института, секвенирование которых проведено на платформе «Illumina MiSeq». Для сравнительного анализа в работу были взяты 1848 геномов из базы данных NCBI и 530 геномов из базы ENA (European Nucleotide Archive), представленных в виде ридов, сборку которых проводили с использованием программы «Spades» [22].

Программное обеспечение для составления перечня SNP, проведения SNP-типирования и построения дендрограммы (минимальное остовное дерево) разрабатывали на языках программирования Java и Python.

Для визуализации дендрограммы использовали программу «Cytoscape» [23]. Геокодирование мест выделения штаммов проводили с использованием API-сервиса Nominatum. Разработку онлайн-ГИС осуществляли с использованием языков программирования HTML, JavaScript и PHP. В качестве ядра использовали свободно распространяемую библиотеку «Leaflet», написанную на языке JavaScript. В качестве картографических данных использовали карты, полученные от сообщества «OpenStreetmap».

Результаты и обсуждение

Первый этап работы заключался в создании коллекции геномов токсигенных (ctxAB⁺tcpA⁺) штаммов V. cholerae O1 El Tor. Для этой цели все имеющиеся данные WGS были проверены на наличие генов wbe (rbfN), tcpA, ctxA, ctxB, что позволило отобрать 2598 геномов, выделенных с 1941 по 2022 г. (см. приложение в дополнительных файлах к статье на сайте журнала: DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-388-1).При этом некоторые геномы V. cholerae О1 были дублированы в случае проведения секвенирования разными авторами на разных технологических платформах. Существенной сложностью на данном этапе явилось отсутствие полноценных данных о месте выделения штаммов. Для дальнейшего анализа были оставлены штаммы, для которых указаны год и место выделения.

Следующий этап работы состоял в составлении универсального перечня SNP, позволяющего проводить анализ данных WGS штаммов возбудителя холеры. Одной из значимых проблем при проведении подобных исследований является существенное возрастание требований производительности вычислительной мощности при увеличении количества исследуемых штаммов. С этой целью нами ранее был разработан алгоритм последовательного анализа геномов, при котором перечень SNP изучаемого штамма сохраняется в отдельном файле [12]. Это обеспечивает линейную зависимость времени работы от количества изучаемых штаммов, а также позволяет организовать многопоточность, т.е. проведение одновременного анализа сразу нескольких геномов. Помимо этого данный приём в совокупности с универсальным перечнем SNP даёт возможность экономить время при необходимости добавления новых штаммов в анализ.

Для составления перечня SNP в рамках настоящей работы был проведён анализ случайной выборки из 50 геномов V. cholerae из базы данных NCBI, выделенных в период с 2016 по 2020 г., что позволило составить единый перечень, включающий данные о 54 858 SNP.

Следующий этап заключался в построении матрицы различий, основанной на попарном сравнении изучаемых штаммов. При этом каждый вариант SNP учитывался для дальнейшего анализа только в случае наличия такого же аллеля как минимум у 3 штаммов, что позволяет исключать ошибки секвенирования. Сложностью данного этапа является квадратичная зависимость времени от количества штаммов. В зависимости от мощности используемого компьютера данный этап составлял 12–72 ч.

Для анализа полученной информации было построено минимальное остовное дерево, отражающее генетическую близость между различными группами штаммов (рис. 1). Для облегчения визуального анализа штаммы V. cholerae O1, изолированные в России, отмечены красным цветом, на Украине — зелёным.

 

Рис. 1. Дендрограмма, отражающая генетическую близость между 2598 геномами токсигенных штаммов V. cholerae О1-серогруппы.

Fig. 1. Dendrogram reflecting the genetic affinity between 2598 genomes of toxigenic strains of V. cholerae of the O1 serogroup.

 

Технологические платформы секвенирования различаются по характеру генерируемых ошибок. Например, при использовании технологии «MiSeq» («Illumina») ошибки секвенирования чаще всего проявляются в виде единичных нуклеотидных замен, в то время как для «Ion Torrent» больше были характерны делеции-вставки [24]. Это может являться существенной проблемой при сравнительном анализе данных, полученных разными авторами. Для решения этой проблемы ранее нами был предложен метод «контрольных геномов», заключающийся в добавлении в анализ одних и тех же штаммов, сиквенс которых проведён на различных типах секвенаторов [24]. В рамках настоящего исследования в анализ были включены пары геномов штаммов V. cholerae О1 El Tor № 81 и № 18899, секвенирование каждого из которых проведено на платформах «MiSeq» («Illumina») и «IonTorrent» («Thermo Fisher»). Попарная группировка таких штаммов, на наш взгляд, доказывает корректность построенной дендрограммы.

Анализ дендрограммы показывает, что основная масса токсигенных изолятов V. cholerae распределяется между несколькими большими кластерами. Наибольший интерес, на наш взгляд, представляет анализ штаммов, изолированных в России. Геномы токсигенных штаммов V. cholerae № 19187, 19188 и 19188а, выделенные в Москве в 2010 г., оказались генетически близки штаммам, циркулировавшим в это же время в Индии и Непале (рис. 2). В то время как изоляты V. cholerae О1-серогруппы № 19191 и 19191а, также выделенные в Москве, оказались близки «гаитянской» группе штаммов, циркулировавших на о. Гаити в 2010 г., что согласуется с данными, полученными ранее [24].

 

Рис. 2. Фрагмент дендрограммы, отражающей близость штаммов V. cholerae, выделенных в Москве, к штаммам из Индии и Непала. Для каждого штамма указаны номер штамма, место и год выделения.

Fig. 2. Fragment of a dendrogram reflecting the relatedness of V. cholerae strains isolated in Moscow to strains from India and Nepal. For each strain, the strain number, place and year of isolation are indicated.

 

Особый интерес представляют штаммы V. cholerae, вызвавшие вспышку холеры на Украине в 2011 г. Данные штаммы имеют «гаитянский» тип гена ctxB (ctx-B7 по классификации [25]) и, по мнению ряда авторов, образуют общий кластер со штаммами, вызвавшими вспышку холеры на о. Гаити в 2010 г. [26]. Однако, по данным настоящего исследования, «украинские» штаммы образовали отдельный кластер со штаммами, изолированными в Индии в 2010–2016 гг. В этот же кластер попал изолят V. cholerae № 6878, выделенный в Москве в 2012 г. (рис. 3). Примечательно, что данный кластер является дочерним от кластера штаммов, выделенных непосредственно на о. Гаити в 2010–2013 гг., что согласуется с данными, полученными K.V. Kuleshov и соавт. [27]. Это позволяет сделать вывод о продолжающихся мутационных изменениях в данной группе штаммов.

 

Рис. 3. Фрагмент дендрограммы, содержащий штаммы, изолированные во время вспышки холеры в Мариуполе в 2011 г.

Для каждого штамма указаны номер штамма, место и год выделения.

Fig. 3. A fragment of a dendrogram containing strains isolated during a cholera outbreak in Mariupol in 2011.

For each strain, the strain number, place and year of isolation are indicated.

 

Весьма интересным представлялось изучение токсигенных штаммов, выделенных в Ростовской области в 2011 и 2014 гг., ввиду того что ранее проведённое исследование не позволило выявить близкородственные геномы [24]. В рамках настоящего исследования данные изоляты попали в общий кластер со штаммами, циркулировавшими в Мозамбике на протяжении более 10 лет. Кроме того, в этот же кластер вошли штаммы, изолированные в 2005 г. в Твери и Москве (рис. 4).

 

Рис. 4. Фрагмент дендрограммы, содержащий штаммы, изолированные в России в 2005–2014 гг.

Для каждого штамма указаны номер штамма, место и год выделения.

Fig. 4. A fragment of a dendrogram containing strains isolated in Russia in 2005–2014.

For each strain, the strain number, place and year of isolation are indicated.

 

В ходе эпидемиологического расследования вспышки холеры (52 больных и 18 вибриононосителей) в Казани в 2001 г. было высказано предположение о завозе возбудителя из-за рубежа [28]. В рамках настоящего исследования установлено, что штаммы V. cholerae, выделенные во время вспышки в 2001 г., оказались генетически близки изолятам из Афганистана (рис. 5), а также штаммам, изолированным в Ростове-на-Дону (2001 г.). Примечательно, что близость между штаммами из Ростова-на-Дону и Казани уже была показана ранее по итогам VNTR-анализа [29, 30]

 

Рис. 5. Фрагмент дендрограммы, содержащей штаммы, изолированные в России в 2001 г.

Для каждого штамма указаны номер штамма, место и год выделения.

Fig. 5. Fragment of a dendrogram containing strains isolated in Russia in 2001.

For each strain, the strain number, place and year of isolation are indicated.

 

Актуальным, на наш взгляд, является сопоставление результатов изучения геномов V. cholerae, полученных различными авторами. В этом плане весьма интересна работа F.X. Weill и соавт., посвящённая изучению геномов вибрионов, изолированных на африканском континенте [31]. На основе байесовского анализа авторы выделили 12 волн распространения холеры в Африке. Нам удалось сопоставить данные о принадлежности штамма к той или иной волне для 237 изолятов, взятых в наше исследование. При этом каждая из волн занимает от 1 до 4 кластеров, при этом отсутствуют кластеры, в который попадали бы штаммы из разных волн. На наш взгляд, это может свидетельствовать о хорошей сходимости результатов, полученных различными методами.

Следующий этап работы состоял в разработке онлайн-ГИС, содержащей данные о геномах токсигенных штаммов V. cholerae О1. С этой целью нами были отобраны геномы вибрионов, для которых имелась информация о месте и дате их выделения (2598 геномов). После геокодирования с использованием сервиса Nominatum данные были нанесены на электронную карту (рис. 6). В случае изоляции нескольких штаммов в одной точке они автоматически группируются в единый пространственный кластер с отображением их количества. При нажатии на него отображаются все штаммы, входящие в такой кластер. Для фильтрации по времени выделения штаммов предусмотрена кнопка «Выборка по годам», позволяющая указать необходимый временной диапазон.

 

Рис. 6. Внешний вид разработанной ГИС «Молекулярно-генетический мониторинг за V. cholerae».

Fig. 6. The appearance of the developed GIS "Molecular genetic monitoring for V. cholerae".

 

Для выборки и фильтрации штаммов на основе их генетической близости был создан серверный программный модуль, позволяющий выявлять генетически близкие варианты с помощью матрицы, построенной на предыдущем этапе. При нажатии на маркер штамма отображается диалоговое окно, содержащее краткую информацию о геноме и кнопку «Найти похожие», позволяющую выбрать все геномы, отличающиеся не более чем на 5 SNP. Для облегчения визуального анализа размер маркера отражает генетическую близость. Например, результат поиска близкородственных геномов штамма V. cholerae № I-1330, выделенного во Владивостоке в 1999 г., представлен на рис. 7. Стоит отметить, что наиболее генетически близкими данному штамму являются изоляты, выделенные в Китае, Камбодже и Лаосе, что, в свою очередь, коррелирует с данными, полученными другими авторами [32].

 

Рис. 7. Фрагмент ГИС «Молекулярно-генетический мониторинг V. cholerae» — штаммы, генетически близкородственные штамму V. cholerae № I-1330.

Fig. 7. The fragment of GIS "Molecular genetic monitoring for V. cholerae" — strains genetically closely related to V. cholerae strain I-1330.

 

Выводы

В ходе проведённого исследования отобраны 54 858 SNP, позволяющие дифференцировать эпидемиологически значимые штаммы, и создано программное обеспечение для проведения пакетного филогенетического анализа токсигенных штаммов V. cholerae на основе данных WGS.

Построена дендрограмма, отражающая филогенетические связи между 2598 геномами токсигенных изолятов V. cholerae. Показано, что большинство штаммов распределяются между несколькими большими кластерами. Установлено, что штаммы из Ростовской области (2011 и 2014 гг.) оказались близки к группе штаммов, длительно циркулировавших в Мозамбике. Изоляты V. cholerae, выделенные в Москве в 2010 г., представлены двумя разными кластерами, один из которых образован штаммами из Непала и Индии, в то время как второй представлен штаммами, вызвавшими вспышку холеры на о. Гаити в 2010 г. Установлено, что эпидемические осложнения вспышки холеры в г. Казани в 2001 г. вызваны штаммами, генетически близкородственными штаммам из Афганистана.

Создана онлайн-ГИС «Молекулярно-генетический мониторинг V. cholerae», позволяющая проводить выборку близкородственных штаммов непосредственно на электронной карте. ГИС расположена на сервере Ростовского-на-Дону противочумного института и доступна для работы сотрудникам учреждений Роспотребнадзора и других заинтересованных ведомств.

 

¹ Указ Президента РФ от 13.05.2017 № 208 «О Стратегии экономической безопасности Российской Федерации на период до 2030 года» и Указ Президента РФ от 07.05.2018 № 204 «О национальных целях и стратегических задачах развития Российской Федерации на период до 2024 года»

About the authors

Alexey S. Vodopyanov

Rostov-on-Don Antiplague Scientific Research Institute

Author for correspondence.
Email: vodopyanov_as@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-9056-3231

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of molecular biology of natural focal and zoonotic infections

Россия, Rostov-on-Don

Sergey O. Vodopyanov

Rostov-on-Don Antiplague Scientific Research Institute

Email: vodopyanov_as@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0003-4336-0439

D. Sci. (Med.), main researcher, Laboratory of microbiology of cholera

Россия, Rostov-on-Don

Ruslan V. Pisanov

Rostov-on-Don Antiplague Scientific Research Institute

Email: vodopyanov_as@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-7178-8021

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of molecular biology of natural focal and zoonotic infections

Россия, Rostov-on-Don

Igor P. Oleynikov

Rostov-on-Don Antiplague Scientific Research Institute

Email: vodopyanov_as@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-2390-9773

researcher, Laboratory of microbiology of cholera

Россия, Rostov-on-Don

Aleksey K. Noskov

Rostov-on-Don Antiplague Scientific Research Institute

Email: vodopyanov_as@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0003-0550-2221

Cand. Sci. (Med.), Director

Россия, Rostov-on-Don

References

Supplementary files