Ability for vegetation and spore formation of  Bacillus anthracis  strains with different phenotypical properties under soil simulating conditions

Elena A. Koteneva; Котенева Елена Анатольевна; Olga I. Tsygankova; Цыганкова Ольга Ивановна; Aleksander V. Kalinin; Калинин Александр Васильевич; Alena V. Abramovich; Абрамович Алена Владимировна; Victoriya Yu. Shcherbakova; Щербакова Виктория Юрьевна; Ivan S. Rodionov; Родионов Иван Сергеевич

doi:10.36233/0372-9311-304

Ability for vegetation and spore formation of Bacillus anthracis strains with different phenotypical properties under soil simulating conditions

Authors: Koteneva E.A.¹^,2, Tsygankova O.I.¹, Kalinin A.V.¹, Abramovich A.V.¹, Shcherbakova V.Y.¹, Rodionov I.S.¹
Affiliations:
1. Stavropol Research Antiplague Institute
2. North Caucasian Federal University
Issue: Vol 100, No 3 (2023)
Pages: 186-193
Section: ORIGINAL RESEARCHES
Submitted: 11.07.2023
Accepted: 11.07.2023
Published: 11.07.2023
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/15834
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-304
EDN: https://elibrary.ru/ovreep
ID: 15834

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. The study of the ability of Bacillus anthracis strains with different phenotypic properties to spore germination, reproduction and sporulation on a medium based on an aqueous soil extract can help assess the significance of these processes in the formation and maintenance of soil anthrax foci.

Aim. The analysis of individual characteristics of the development of a vegetative culture of anthrax pathogen strains with different phenotypes in a soil medium model.

Materials and methods. On a group of anthrax microbe strains with different plasmid composition and virulence, the possibility of spore germination, reproduction of bacilli and, at least in some of them, productive spore formation on the soil medium was studied.

Results. Three variants of culture development of B. anthracis strains were identified: 1 — spores remain intact, not germinating; 2 — after germination of spores, bacilli are formed, which multiply with different intensity, passing into involutional forms without spore formation; 3 — the passage of a complete physiological cycle "spore–bacillus–spore". The presence of 2% blood in the soil environment contributed to the germination of spores and reproduction of the culture, but inhibited the process of sporulation during the observation period of 3 days. No correlation was found between a certain phenotype of the studied strains of B. anthracis and the ability to germinate and vegetate on soil media.

Conclusion. The data obtained that only 1–7% of CFU gives rise to the formation of colonies on the soil medium suggest the heterogeneity of the properties of the population of the studied strains. Isolation of such cultures and their further detailed study will make it possible to identify the most significant complexes of biological properties for the realization of a complete physiological cycle under soil-simulating conditions.

Keywords

anthrax, Bacillus anthracis strains, soil environment, phenotypic properties, spore germination, spore formation

Full Text

Введение

Возбудитель сибирской язвы — Bacillus anthracis — является патогенным для большого количества видов животных и человека и обладает комплексом приспособительных механизмов для активного размножения в организме млекопитающих и сохранению бацилл в почве. Непродолжительная фаза существования в организме чувствительных животных подчинена цели быстрого и продуктивного размножения бацилл. В отличие от людей, болеющих в основном локализованной кожной формой, у чувствительных к данной инфекции животных наблюдается генерализованная форма заболевания, результатом которой является их гибель. В этом случае в предагональном периоде в биоматериале достигается очень высокая концентрация бацилл, прошедших отбор по признаку вирулентности. В естественных условиях (при отсутствии специальных мер человека) на протяжении длительного процесса эволюции сибиреязвенного микроба бациллы вместе с трупом и биологическими жидкостями попадали в почву, где происходил процесс формирования спор, обеспечивающий при определённых почвенно-климатических условиях их длительное сохранение [1, 2]. Учитывая, что в процессе вынужденной прирезки больных животных на почву попадает значительный объём крови, которая является прекрасной питательной средой, обеспечивающей размножение бацилл даже в виде незначительной добавки к различным субстратам (почве), можно предположить, что такие участки почвы способны стать микроочагами размножения бацилл и при определённых условиях накапливать споры. Несмотря на то что общепризнанной основной функцией почвенной фазы существования B. an- thracis является длительное сохранение микроба в виде спор, в научной литературе активно обсуждается вопрос и о возможности вегетирования сибиреязвенного микроба в почве, впервые поднятый в работе [3]. Подтверждением существования вегетативной фазы в почве может служить тот факт, что в определённых условиях B. anthracis может расти in vitro в виде биоплёнки [4], которая является предпочтительным состоянием для микроорганизмов в окружающей среде. Е. Saile и соавт. показали, что в модели системы ризосферы B. anthracis растёт как сапрофит [6]. В свете этих данных необходимо отметить, что сибиреязвенный микроб находится в близком генетическом родстве с группой очень успешных почвенных микроорганизмов — B. cereus sensu lato [6]. С учётом длительности «почвенной» фазы существования B. anthracis и ее важности в формировании резервуара инфекции очевидна необходимость изучения всех факторов и процессов, оказывающих воздействие на микроба в этой сложной и многофакторной экологической системе.

Цель работы — анализ индивидуальных особенностей развития вегетативной культуры штаммов возбудителя сибирской язвы с различным фенотипом на модели почвенной среды.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы B. anthracis: диплазмидные 1(СО), 12/16, 14/41, 12/16-1 4P, 228, 228 прот (с классическим капсулообразованием), 1(СО)-S, 1(СО)-5-1 SM, 14/41-1а SM и 12/16-S (формирующие капсулу в атмосфере воздуха); а также акапсульные моноплазмидные 228/8, 14/41 Trp⁺ (pXO1⁺, pXO2^–) и бесплазмидный 228/4. Среди исследованных штаммов были различающиеся по токсино- и капсулообразованию, протеолитической, гемолитической и лецитиназной активности, а также по принадлежности к основным генетическим группам А и В (таблица). Перечисленные свойства были изучены в соответствии с данными [3]. Штаммы B. anthracis были получены из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» Ставропольского противочумного института Роспотребнадзора. Вся работа с культурами штаммов B. anthracis проводилась с соблюдением требований СанПин 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней)». Споры для проведения эксперимента получали в соответствии с МУК 4.2.2413–08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы» на агаре Гладстона. После смывания спор со среды дистиллированной водой (ДВ) и отстаивания взвеси в холодильнике в течение 3–4 сут жидкость удаляли, а из осадка спор делали мазки и окрашивали методом Ребигера для контроля наличия бактериального дебриса и единичных вегетативных клеток. Для очистки спор от указанных примесей применяли процедуру последовательной отмывки спор в ДВ с промежуточным контролем в окрашенных мазках из осадка. Убедившись, что взвесь спор не содержит вегетативной культуры и дебриса, из неё готовили взвесь 1 × 10³ КОЕ/мл, которую использовали для засева питательных сред.

Фенотипические и генетические характеристики штаммов B. anthracis, использованных в работе / Phenotypic and genetic characteristics of B. anthracis strains used in the study

Наименование штаммов B. anthracis и их субкультур

Name of B. anthracis strains and their subcultures

Источник выделения

Selection source

Признак выделения

Feature of selection

Фенотип

Phenotype

Генетическая группа

Genetic group

Плазмидный состав

Plasmid composition

Категория вирулентности in vitro [12]

Virulence category

in vitro [12]

1CO

Кровь КРС

Blood of cattle

Принадлежность к B. anthracis

Belonging to B. anthracis

Cap(CO₂)⁺(O₂)^–Tox⁺ ProtA⁺Hly⁺ Lec^– Trp⁺

pXO1⁺ pXO2⁺

Высоковирулентные

Highly virulent

228 прот

Штамм 228

Strain 228

Независимость от Trp

Independence from Trp

12/16-1 4P

Штамм 12/16-1

Strain 12/16-1

После 4 пассажей** After 4 passages**

228

Производственный штамм

Manufacturing strain

Принадлежность к B. anthracis

Belonging to B. anthracis

Cap(CO₂)⁺(O₂)^–Tox^– ProtA^–Hly^– Lec^– Trp^–

Умеренно вирулентные

Moderately virulent

12/16

Отделяемое язвы

Ulcer discharge

14/41

Отделяемое язвы

Ulcer discharge

1CO-S

Штамм 1CO

Strain 1CO

Сар⁺ (О₂)

Cap(CO₂)⁺(O₂)⁺Tox^– ProtA^–Hly^– Lec^– Trp^–

Слабовирулентные

Weakly virulent

12/16-S

Штамм 12/16

Strain 12/16

1 СО-5-1 SM

Штамм 1CO-S

Strain 1CO-S

14/41-1a SM

Штамм 14/41-1

Strain 14/41-1

228/8

Штамм 228

Strain 228

Вакцинный штамм

Vaccine strain

Cap^–Tox⁺ ProtA^–Hly^– Lec^– Trp⁺

pXO1⁺ pXO2^–

Авирулентные

Аvirulent

14/41 Trp⁺

Штамм 14-41

Strain 14-41

Независимость от Trp

Independence from Trp

Cap^–Tox⁺ ProtA^–Hly^– Lec⁺Trp⁺

228/4

Штамм 228

Strain 228

Отсутствие капсулообразования

Аbsent capsule formation

Cap^–Tox^– ProtA^–Hly^– Lec^– Trp^–

pXO1^– pXO2^–

Апатогенные

Аpathogenic

Примечание. ⁺Наличие признака; ^–отсутствие признака; *признак не определён в связи с отсутствием роста. Cap(CO₂) — способность к образованию капсулы в атмосфере с 5% CO₂; Cap(O₂) — способность к образованию капсулы в атмосфере воздуха. Hly — способность лизировать отмытые эритроциты барана. Lec — фосфолипазная активность на плотной среде с яичным желтком. Trp — прототрофность по триптофану. Tox — формирование линий иммунопреципитации с противосибиреязвенным гамма-глобулином на среде СОПЭК.

**Данный штамм был выделен из популяции акапсульного штамма 12/16-1 путём последовательных 4 пассажей на беспородных белых мышах (при заражении культурой, полученной на предыдущем пассаже) и отличался от исходного по фенотипу, плазмидному составу и генотипу.

Note. ⁺Presence of a trait; ^–absence of a trait; *trait not defined due to lack of growth. Cap(CO₂) — ability to form a capsule in an atmosphere with 5% carbon dioxide; Cap(O₂) — the ability to form a capsule in an air atmosphere. Hly — ability to lyse washed sheep erythrocytes. Lec — phospholipase activity on solid medium with egg yolk. Trp — tryptophan prototrophy. Tox — formation of immunoprecipitation lines with anti-anthrax gammaglobulin on SOPEK medium.

**This strain was isolated from the population of the capsular strain 12/16-1 by 4 consecutive passages on outbred white mice (when infected with the culture obtained at the previous passage) and differed from the initial one in phenotype, plasmid composition and genotype.

Основой почвенной среды служил водный экстракт почвы, который получали, заливая пробу почвы стерильной ДВ в соотношении 1 : 1 (по объёму). После тщательного перемешивания отстаивали для осаждения грубых частиц, измеряли рН (7,2) надосадочной жидкости, добавляли агар до концентрации 1,5%, стерилизовали и разливали в чашки Петри. В часть приготовленной почвенной среды после охлаждения до 45^оС добавляли 2% крови человека, после чего разливали в чашки Петри.

Посев спор производили в дозе 1 × 10² КОЕ в объёме 100 мкл, распределяли шпателем по поверхности среды и инкубировали в термостате в атмосфере воздуха при 37^оС. Результаты оценивали визуально по наличию роста и просмотром мазков, окрашенных методом Ребигера. В качестве контроля использовали аналогичные посевы на LB-агар, BH-агар и почвенный агар с добавлением 2% гепаринизированной крови.

Результаты

Уже через 24 ч на всех контрольных средах наблюдался рост, соответствующий посевной дозе. В окрашенных мазках из культур с LB-агара и BH-агара наблюдались типичные для B. anthracis интенсивно окрашенные бациллы, расположенные цепочками, многие из которых содержали внутриклеточно формирующиеся споры (рис. 1, а, б). В мазках культур с почвенно-кровяного агара наблюдалась типичная морфология бацилл в виде цепочек (рис. 1, в).

Рис. 1. Микрофотография окрашенных мазков суточной культуры штамма B. anthracis 1(СО) с LB-агара (а), BH-агара (б) и почвенно-кровяного агара (в). Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 1. Micrograph of stained smears of daily culture of B. anthracis 1(СО) strain from LB-agar (a), BH-agar (b), and soil-blood agar (c). Rebiger staining, ×500.

Они не формировали споры за исключением штаммов B. anthracis 228/8 (рис. 2, а) и 14/41 (рис. 2, б), у которых очень небольшое количество клеток начинали формировать споры. Кроме того, на почвенно-кровяной среде выделялся штамм 1(СО)-S с атипичным капсулообразованием, бациллы которого в этих условиях формировали капсулу (рис. 2, в), которая выявлялась и через 3 сут после посева (рис. 2, г).

Рис. 2. Микрофотография окрашенных мазков суточной культуры штаммов B. anthracis 228/8 (а), 14/41 (б) и 1(СО)-S (в) и 3-суточной (г) с почвенно-кровяного агара. Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 2. Micrograph of stained smears of a daily culture of B. anthracis strains 228/8 (a), 14/41 (b), and 1(CO)-S (c) and a 3-day-old (d) from soil-blood agar. Rebiger staining, ×500.

В посевах на почвенной среде штаммы B. an- thracis различались по способности спор прорастать и формировать колонии на этой среде, а также образовывать споры. В первую очередь следует отметить, что по сравнению с контрольными средами рост на почвенной среде был очень скудным, штаммы формировали не более 1–7 колоний. Через 24 ч рост наблюдался только у штамма 1(СО), через 48 ч — у штаммов 1(СО)-5-1 SM, 228/4 и 228/8, а через 72 ч добавился рост штаммов 14/41, 14/41 Тrp⁺, 1(СО)-S и 228. Штамм 12/16 и его производные 12/16-S и 12/16 1 4Р, а также штаммы 14/41-1а SM и 228 прот не дали видимого роста в течение всего срока наблюдения (6 сут).

В окрашенных мазках 3-суточной культуры штамма B. anthracis 1(СО) (рис. 3, а), первым сформировавшего колонии на почвенном агаре, наблюдалось не только активное формирование внутриклеточных спор, но и значительное количество расположенных внеклеточно, часть из которых интенсивно прокрашены, возможно, вследствие начала герминации. В этот же срок на почвенно-кровяной среде образование спор не отмечалось, несмотря на то что значительная часть бацилл находилась в стадии лизиса (деградации) (рис. 3, б). Похожая картина наблюдалась и в мазках штамма 228/4 (рис. 3, в, г). Исключение составил штамм 228/8, в мазках из 3-суточной культуры которого наблюдалось большое количество свободных спор (рис. 3, д).

Рис. 3. Микрофотография окрашенных мазков 3-суточных культур штамма B. anthracis 1(СО) с почвенного агара (а) и почвенно-кровяного агара (б), штамма B. anthracis 228/4 с почвенного агара (в) и с почвенно-кровяного агара (г), штамма B. anthracis 228/8 с почвенно-кровяного агара (д). Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 3. Micrograph of stained smears of 3-day cultures of B. anthracis 1(СО) strain from soil agar (a) and soil-blood agar (b) and strain 228/4 from soil agar (c) and soil-blood agar (d), 228/8 from soil-blood agar. Rebiger staining, ×500.

По состоянию культуры на момент завершения эксперимента (6 сут) исследуемые штаммы B. anthracis можно разделить на несколько групп. Первую группу составляли штаммы B. anthracis 1(СО), 14/41 и 228/4 (рис. 4), в мазках у которых в эти сроки наблюдалось значительное количество вегетативной культуры, вероятно в различных физиологических фазах — интенсивно прокрашенные, с чёткими контурами бациллы и бледные «раздутые», нечётко контурированные клетки в виде теней. Встречались бациллы с изменённой формой (булавовидные и бочкообразные), увеличенные в размерах. В значительном количестве встречались расположенные внеклеточно споры.

Рис. 4. Микрофотография мазка культуры штаммов B. anthracis 1(СО) (а), 14/41 (б) и 228/4 (в) с почвенной среды (6 сут). Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 4. Micrograph of a culture smear of B. anthracis strains 1(СО) (a), 14/41 (b) and 228/4 (c) from the soil medium (6 days). Rebiger staining, ×500.

Культура штаммов B. anthracis 228, 1(СО)-S была представлена в основном изменёнными по форме и величине бациллами при отсутствии спор (рис. 5, а, б). При смыве минимальным количеством ДВ (0,05 мл) с поверхности почвенного агара после 6 сут инкубации штаммов B. anthracis 12/6 и 228 прот (рис. 5, в), которые не формировали видимых колоний, в мазках выявляли единичные бациллы, в том числе с изменённой морфологией. В мазке из смыва с почвенного агара, засеянного спорами штамма B. anthracis 14/41-1a SM, были обнаружены в небольшом количестве только неизменённые споры при полном отсутствии вегетативной формы (рис. 5, г), что свидетельствует об отсутствии условий для их прорастания.

Рис. 5. Микрофотография мазка культуры штаммов B. anthracis 228 (а), 1(СО)-S (б), 228 прот (в) и 14/41-1а SM (г) с почвенной среды (6 сут). Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 5. Micrograph of a culture smear of B. anthracis strains 228 (a), 1(CO)-S (b), 228 prot (c) and 14/41-1a SM (d) from the soil medium (6 days). Rebiger staining, ×500.

Обсуждение

В результате проведённых экспериментов была выявлена способность спор большинства использованных штаммов B. anthracis проходить стадию герминации с последующим формированием вегетативной культуры, а у части культур и последующее образование спор на питательной среде, основой которой является экстракт почвы. Добавление в такую агаризованную среду 2% гепаринизированной крови обеспечивало прорастание спор и формирование колоний у всех изученных в данной работе штаммов после инкубации в течение 1 сут. Влияние наличия крови в почвенной среде на эффективное спорообразование, очевидно, неодинаково у различных штаммов сибиреязвенного микроба. Так, после суточной инкубации на почвенно-кровяном агаре единичные бациллы в стадии спорообразования наблюдались в мазках только двух из исследованных штаммов — 228/8 и 14/41, а значительное количество внеклеточно расположенных спор наблюдалось только у штамма B. anthracis 228/8 через 3 сут. Отсутствие спорообразования на почвенно-кровяной среде в течение 3 сут у большинства использованных в работе штаммов B. anthracis подтверждает ингибирующее влияние крови на процесс образования спор [7]. Следует отметить, что в дальнейшем разложение белков крови почвенными бактериями, изменение влажности и температурного режима могут создать более благоприятные условия для спорообразования у большего количества штаммов.

Инкубирование посевов спор на почвенном агаре выявило возможность прохождения полного физиологического цикла развития культуры B. anthracis (спора–вегетативные клетки–споры) со значительным накоплением бактериальной массы, а затем и спор, пригодных для дальнейшего длительного сохранения или вступления в следующий физиологический цикл. Такие штаммы, вероятно, способны поддерживать эпизоотологическую значимость почвенных очагов сибирской язвы при определённых почвенно-климатических условиях. Споры большинства использованных в работе штаммов прорастали, образуя вегетативную культуру с различной степенью интенсивности размножения (от образования визуально различимых колоний до прорастания спор с образованием одиночных-парных бацилл без интенсивного размножения). Через 6 сут в окрашенных мазках из колоний и смывах с поверхности среды таких штаммов вне зависимости от количества вегетативной культуры, только в некоторых из них встречались единичные во всём препарате споры (от 1 до 5) или вовсе отсутствовали, несмотря на то что культуры уже находились в стадии деградации в виде инволюционных форм — шарообразные и веретенообразные бациллы и их раздутые бледные тени. Такие штаммы вряд ли способны воспроизводить и тем более наращивать потенциал очага. Споры некоторых штаммов не способны прорастать в условиях данного опыта.

Анализ фенотипических свойств штаммов из различных групп по способности размножаться и формировать споры на почвенном агаре не позволил на данном этапе выявить корреляцию между этими параметрами. Так, штаммы B. anthracis 1(СО), 14/41 и 228/4, которые не только демонстрировали рост в виде колоний, но и формировали зрелые споры, т.е. теоретически были наиболее перспективными для поддержания «почвенной популяции», различались по принадлежности к основным генетическим группам А или В, плазмидному составу, токсино- и капсулообразованию, протеолитической активности и наличию дополнительных питательных потребностей в триптофане (таблица). Следует, однако, учитывать, что указанные в таблице свойства характеризуют использованные штаммы в целом. В то же время при посевной дозе 1 × 10² КОЕ штаммы B. anthracis 1(СО), 1(СО) S, 1(СО)-5-1 SM, 228, 228/4, 228/8, 14/41, 14/41 Trp⁺ формировали 1–7 колоний, что свидетельствует о возможности неоднородности популяции изученных штаммов и делает возможным присутствие отдельных клеток с фенотипом, отличающимся от подавляющего большинства популяции каждого штамма. Исходя из этого важным для оценки значения вегетирования сибиреязвенных бацилл в условиях, приближенных к почве, является характеристика свойств культур, непосредственно способных к росту на почвенной среде. Всё это делает актуальным выделение таких культур и изучение их фенотипических свойств, генетических характеристик и особенностей экспрессии различных генов.

Актуальным представляется изучение влияния свойств различных типов почв и цикличности параметров температуры и влажности в условиях эксперимента на способность осуществлять полный цикл морфофункционального развития культур возбудителя сибирской язвы с различными свойствами.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

About the authors

Elena A. Koteneva

Stavropol Research Antiplague Institute; North Caucasian Federal University

Author for correspondence.
Email: postgenom_stv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4525-1594

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of postgenomic investigations, Associate Professor, Department of general biology and biodiversity

Россия, Stavropol; Stavropol