Ability for vegetation and spore formation of  Bacillus anthracis  strains with different phenotypical properties under soil simulating conditions

Elena A. Koteneva; Котенева Елена Анатольевна; Olga I. Tsygankova; Цыганкова Ольга Ивановна; Aleksander V. Kalinin; Калинин Александр Васильевич; Alena V. Abramovich; Абрамович Алена Владимировна; Victoriya Yu. Shcherbakova; Щербакова Виктория Юрьевна; Ivan S. Rodionov; Родионов Иван Сергеевич

doi:10.36233/0372-9311-304

Способность к вегетированию и спорообразованию штаммов Bacillus anthracis c различными фенотипическими свойствами в условиях, имитирующих почву

Авторы: Котенева Е.А.¹^,2, Цыганкова О.И.¹, Калинин А.В.¹, Абрамович А.В.¹, Щербакова В.Ю.¹, Родионов И.С.¹
Учреждения:
1. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
2. Северо-Кавказский федеральный университет
Выпуск: Том 100, № 3 (2023)
Страницы: 186-193
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 11.07.2023
Дата принятия к публикации: 11.07.2023
Дата публикации: 11.07.2023
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/15834
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-304
EDN: https://elibrary.ru/ovreep
ID: 15834

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. Изучение способности штаммов Bacillus anthracis с различающимися фенотипическими свойствами к герминации спор, размножению и спорообразованию на среде, основой которой является водный экстракт почвы, может способствовать оценке значимости этих процессов в формировании и поддержании почвенных очагов сибирской язвы.

Цель работы — анализ индивидуальных особенностей развития вегетативной культуры штаммов возбудителя сибирской язвы с различным фенотипом на модели почвенной среды.

Материалы и методы. На группе штаммов сибиреязвенного микроба, имеющих разный плазмидный состав и вирулентность, исследована возможность прорастания спор, размножения бацилл и, по крайней мере у некоторых из них, продуктивное спорообразование на почвенной среде.

Результаты. Выявлены три варианта развития культуры штаммов B. anthracis: 1 — споры остаются интактными, не прорастая; 2 — после герминации спор формируются бациллы, которые с различной интенсивностью размножаются, переходя в инволюционные формы без образования спор; 3 — прохождение полного физиологического цикла «спора–бацилла–спора». Наличие 2% крови в почвенной среде способствовало прорастанию спор и размножению культуры, но тормозило процесс спорообразования в период наблюдения — 3 сут. Не выявлено корреляции между определённым фенотипом изученных штаммов B. anthracis и способностью к прорастанию и вегетации на почвенных средах.

Обсуждение. Полученные данные о том, что только 1–7% КОЕ даёт начало формированию колоний на почвенной среде, позволяют предположить неоднородность свойств популяции использованных штаммов. Выделение таких культур и их дальнейшее подробное изучение позволит выявить наиболее значимые для осуществления полного физиологического цикла в условиях, имитирующих почву, комплексы биологических свойств.

Ключевые слова

сибирская язва, штаммы Bacillus anthracis, почвенная среда, фенотипические свойства, герминация спор, спорообразование

Полный текст

Введение

Возбудитель сибирской язвы — Bacillus anthracis — является патогенным для большого количества видов животных и человека и обладает комплексом приспособительных механизмов для активного размножения в организме млекопитающих и сохранению бацилл в почве. Непродолжительная фаза существования в организме чувствительных животных подчинена цели быстрого и продуктивного размножения бацилл. В отличие от людей, болеющих в основном локализованной кожной формой, у чувствительных к данной инфекции животных наблюдается генерализованная форма заболевания, результатом которой является их гибель. В этом случае в предагональном периоде в биоматериале достигается очень высокая концентрация бацилл, прошедших отбор по признаку вирулентности. В естественных условиях (при отсутствии специальных мер человека) на протяжении длительного процесса эволюции сибиреязвенного микроба бациллы вместе с трупом и биологическими жидкостями попадали в почву, где происходил процесс формирования спор, обеспечивающий при определённых почвенно-климатических условиях их длительное сохранение [1, 2]. Учитывая, что в процессе вынужденной прирезки больных животных на почву попадает значительный объём крови, которая является прекрасной питательной средой, обеспечивающей размножение бацилл даже в виде незначительной добавки к различным субстратам (почве), можно предположить, что такие участки почвы способны стать микроочагами размножения бацилл и при определённых условиях накапливать споры. Несмотря на то что общепризнанной основной функцией почвенной фазы существования B. an- thracis является длительное сохранение микроба в виде спор, в научной литературе активно обсуждается вопрос и о возможности вегетирования сибиреязвенного микроба в почве, впервые поднятый в работе [3]. Подтверждением существования вегетативной фазы в почве может служить тот факт, что в определённых условиях B. anthracis может расти in vitro в виде биоплёнки [4], которая является предпочтительным состоянием для микроорганизмов в окружающей среде. Е. Saile и соавт. показали, что в модели системы ризосферы B. anthracis растёт как сапрофит [6]. В свете этих данных необходимо отметить, что сибиреязвенный микроб находится в близком генетическом родстве с группой очень успешных почвенных микроорганизмов — B. cereus sensu lato [6]. С учётом длительности «почвенной» фазы существования B. anthracis и ее важности в формировании резервуара инфекции очевидна необходимость изучения всех факторов и процессов, оказывающих воздействие на микроба в этой сложной и многофакторной экологической системе.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы B. anthracis: диплазмидные 1(СО), 12/16, 14/41, 12/16-1 4P, 228, 228 прот (с классическим капсулообразованием), 1(СО)-S, 1(СО)-5-1 SM, 14/41-1а SM и 12/16-S (формирующие капсулу в атмосфере воздуха); а также акапсульные моноплазмидные 228/8, 14/41 Trp⁺ (pXO1⁺, pXO2^–) и бесплазмидный 228/4. Среди исследованных штаммов были различающиеся по токсино- и капсулообразованию, протеолитической, гемолитической и лецитиназной активности, а также по принадлежности к основным генетическим группам А и В (таблица). Перечисленные свойства были изучены в соответствии с данными [3]. Штаммы B. anthracis были получены из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» Ставропольского противочумного института Роспотребнадзора. Вся работа с культурами штаммов B. anthracis проводилась с соблюдением требований СанПин 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней)». Споры для проведения эксперимента получали в соответствии с МУК 4.2.2413–08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы» на агаре Гладстона. После смывания спор со среды дистиллированной водой (ДВ) и отстаивания взвеси в холодильнике в течение 3–4 сут жидкость удаляли, а из осадка спор делали мазки и окрашивали методом Ребигера для контроля наличия бактериального дебриса и единичных вегетативных клеток. Для очистки спор от указанных примесей применяли процедуру последовательной отмывки спор в ДВ с промежуточным контролем в окрашенных мазках из осадка. Убедившись, что взвесь спор не содержит вегетативной культуры и дебриса, из неё готовили взвесь 1 × 10³ КОЕ/мл, которую использовали для засева питательных сред.

Фенотипические и генетические характеристики штаммов B. anthracis, использованных в работе / Phenotypic and genetic characteristics of B. anthracis strains used in the study

Наименование штаммов B. anthracis и их субкультур

Name of B. anthracis strains and their subcultures

Источник выделения

Selection source

Признак выделения

Feature of selection

Фенотип

Phenotype

Генетическая группа

Genetic group

Плазмидный состав

Plasmid composition

Категория вирулентности in vitro [12]

Virulence category

in vitro [12]

1CO

Кровь КРС

Blood of cattle

Принадлежность к B. anthracis

Belonging to B. anthracis

Cap(CO₂)⁺(O₂)^–Tox⁺ ProtA⁺Hly⁺ Lec^– Trp⁺

pXO1⁺ pXO2⁺

Высоковирулентные

Highly virulent

228 прот

Штамм 228

Strain 228

Независимость от Trp

Independence from Trp

12/16-1 4P

Штамм 12/16-1

Strain 12/16-1

После 4 пассажей** After 4 passages**

228

Производственный штамм

Manufacturing strain

Принадлежность к B. anthracis

Belonging to B. anthracis

Cap(CO₂)⁺(O₂)^–Tox^– ProtA^–Hly^– Lec^– Trp^–

Умеренно вирулентные

Moderately virulent

12/16

Отделяемое язвы

Ulcer discharge

14/41

Отделяемое язвы

Ulcer discharge

1CO-S

Штамм 1CO

Strain 1CO

Сар⁺ (О₂)

Cap(CO₂)⁺(O₂)⁺Tox^– ProtA^–Hly^– Lec^– Trp^–

Слабовирулентные

Weakly virulent

12/16-S

Штамм 12/16

Strain 12/16

1 СО-5-1 SM

Штамм 1CO-S

Strain 1CO-S

14/41-1a SM

Штамм 14/41-1

Strain 14/41-1

228/8

Штамм 228

Strain 228

Вакцинный штамм

Vaccine strain

Cap^–Tox⁺ ProtA^–Hly^– Lec^– Trp⁺

pXO1⁺ pXO2^–

Авирулентные

Аvirulent

14/41 Trp⁺

Штамм 14-41

Strain 14-41

Независимость от Trp

Independence from Trp

Cap^–Tox⁺ ProtA^–Hly^– Lec⁺Trp⁺

228/4

Штамм 228

Strain 228

Отсутствие капсулообразования

Аbsent capsule formation

Cap^–Tox^– ProtA^–Hly^– Lec^– Trp^–

pXO1^– pXO2^–

Апатогенные

Аpathogenic

Примечание. ⁺Наличие признака; ^–отсутствие признака; *признак не определён в связи с отсутствием роста. Cap(CO₂) — способность к образованию капсулы в атмосфере с 5% CO₂; Cap(O₂) — способность к образованию капсулы в атмосфере воздуха. Hly — способность лизировать отмытые эритроциты барана. Lec — фосфолипазная активность на плотной среде с яичным желтком. Trp — прототрофность по триптофану. Tox — формирование линий иммунопреципитации с противосибиреязвенным гамма-глобулином на среде СОПЭК.

**Данный штамм был выделен из популяции акапсульного штамма 12/16-1 путём последовательных 4 пассажей на беспородных белых мышах (при заражении культурой, полученной на предыдущем пассаже) и отличался от исходного по фенотипу, плазмидному составу и генотипу.

Note. ⁺Presence of a trait; ^–absence of a trait; *trait not defined due to lack of growth. Cap(CO₂) — ability to form a capsule in an atmosphere with 5% carbon dioxide; Cap(O₂) — the ability to form a capsule in an air atmosphere. Hly — ability to lyse washed sheep erythrocytes. Lec — phospholipase activity on solid medium with egg yolk. Trp — tryptophan prototrophy. Tox — formation of immunoprecipitation lines with anti-anthrax gammaglobulin on SOPEK medium.

**This strain was isolated from the population of the capsular strain 12/16-1 by 4 consecutive passages on outbred white mice (when infected with the culture obtained at the previous passage) and differed from the initial one in phenotype, plasmid composition and genotype.

Основой почвенной среды служил водный экстракт почвы, который получали, заливая пробу почвы стерильной ДВ в соотношении 1 : 1 (по объёму). После тщательного перемешивания отстаивали для осаждения грубых частиц, измеряли рН (7,2) надосадочной жидкости, добавляли агар до концентрации 1,5%, стерилизовали и разливали в чашки Петри. В часть приготовленной почвенной среды после охлаждения до 45^оС добавляли 2% крови человека, после чего разливали в чашки Петри.

Посев спор производили в дозе 1 × 10² КОЕ в объёме 100 мкл, распределяли шпателем по поверхности среды и инкубировали в термостате в атмосфере воздуха при 37^оС. Результаты оценивали визуально по наличию роста и просмотром мазков, окрашенных методом Ребигера. В качестве контроля использовали аналогичные посевы на LB-агар, BH-агар и почвенный агар с добавлением 2% гепаринизированной крови.

Результаты

Уже через 24 ч на всех контрольных средах наблюдался рост, соответствующий посевной дозе. В окрашенных мазках из культур с LB-агара и BH-агара наблюдались типичные для B. anthracis интенсивно окрашенные бациллы, расположенные цепочками, многие из которых содержали внутриклеточно формирующиеся споры (рис. 1, а, б). В мазках культур с почвенно-кровяного агара наблюдалась типичная морфология бацилл в виде цепочек (рис. 1, в).

Рис. 1. Микрофотография окрашенных мазков суточной культуры штамма B. anthracis 1(СО) с LB-агара (а), BH-агара (б) и почвенно-кровяного агара (в). Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 1. Micrograph of stained smears of daily culture of B. anthracis 1(СО) strain from LB-agar (a), BH-agar (b), and soil-blood agar (c). Rebiger staining, ×500.

Они не формировали споры за исключением штаммов B. anthracis 228/8 (рис. 2, а) и 14/41 (рис. 2, б), у которых очень небольшое количество клеток начинали формировать споры. Кроме того, на почвенно-кровяной среде выделялся штамм 1(СО)-S с атипичным капсулообразованием, бациллы которого в этих условиях формировали капсулу (рис. 2, в), которая выявлялась и через 3 сут после посева (рис. 2, г).

Рис. 2. Микрофотография окрашенных мазков суточной культуры штаммов B. anthracis 228/8 (а), 14/41 (б) и 1(СО)-S (в) и 3-суточной (г) с почвенно-кровяного агара. Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 2. Micrograph of stained smears of a daily culture of B. anthracis strains 228/8 (a), 14/41 (b), and 1(CO)-S (c) and a 3-day-old (d) from soil-blood agar. Rebiger staining, ×500.

В посевах на почвенной среде штаммы B. an- thracis различались по способности спор прорастать и формировать колонии на этой среде, а также образовывать споры. В первую очередь следует отметить, что по сравнению с контрольными средами рост на почвенной среде был очень скудным, штаммы формировали не более 1–7 колоний. Через 24 ч рост наблюдался только у штамма 1(СО), через 48 ч — у штаммов 1(СО)-5-1 SM, 228/4 и 228/8, а через 72 ч добавился рост штаммов 14/41, 14/41 Тrp⁺, 1(СО)-S и 228. Штамм 12/16 и его производные 12/16-S и 12/16 1 4Р, а также штаммы 14/41-1а SM и 228 прот не дали видимого роста в течение всего срока наблюдения (6 сут).

В окрашенных мазках 3-суточной культуры штамма B. anthracis 1(СО) (рис. 3, а), первым сформировавшего колонии на почвенном агаре, наблюдалось не только активное формирование внутриклеточных спор, но и значительное количество расположенных внеклеточно, часть из которых интенсивно прокрашены, возможно, вследствие начала герминации. В этот же срок на почвенно-кровяной среде образование спор не отмечалось, несмотря на то что значительная часть бацилл находилась в стадии лизиса (деградации) (рис. 3, б). Похожая картина наблюдалась и в мазках штамма 228/4 (рис. 3, в, г). Исключение составил штамм 228/8, в мазках из 3-суточной культуры которого наблюдалось большое количество свободных спор (рис. 3, д).

Рис. 3. Микрофотография окрашенных мазков 3-суточных культур штамма B. anthracis 1(СО) с почвенного агара (а) и почвенно-кровяного агара (б), штамма B. anthracis 228/4 с почвенного агара (в) и с почвенно-кровяного агара (г), штамма B. anthracis 228/8 с почвенно-кровяного агара (д). Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 3. Micrograph of stained smears of 3-day cultures of B. anthracis 1(СО) strain from soil agar (a) and soil-blood agar (b) and strain 228/4 from soil agar (c) and soil-blood agar (d), 228/8 from soil-blood agar. Rebiger staining, ×500.

По состоянию культуры на момент завершения эксперимента (6 сут) исследуемые штаммы B. anthracis можно разделить на несколько групп. Первую группу составляли штаммы B. anthracis 1(СО), 14/41 и 228/4 (рис. 4), в мазках у которых в эти сроки наблюдалось значительное количество вегетативной культуры, вероятно в различных физиологических фазах — интенсивно прокрашенные, с чёткими контурами бациллы и бледные «раздутые», нечётко контурированные клетки в виде теней. Встречались бациллы с изменённой формой (булавовидные и бочкообразные), увеличенные в размерах. В значительном количестве встречались расположенные внеклеточно споры.

Рис. 4. Микрофотография мазка культуры штаммов B. anthracis 1(СО) (а), 14/41 (б) и 228/4 (в) с почвенной среды (6 сут). Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 4. Micrograph of a culture smear of B. anthracis strains 1(СО) (a), 14/41 (b) and 228/4 (c) from the soil medium (6 days). Rebiger staining, ×500.

Культура штаммов B. anthracis 228, 1(СО)-S была представлена в основном изменёнными по форме и величине бациллами при отсутствии спор (рис. 5, а, б). При смыве минимальным количеством ДВ (0,05 мл) с поверхности почвенного агара после 6 сут инкубации штаммов B. anthracis 12/6 и 228 прот (рис. 5, в), которые не формировали видимых колоний, в мазках выявляли единичные бациллы, в том числе с изменённой морфологией. В мазке из смыва с почвенного агара, засеянного спорами штамма B. anthracis 14/41-1a SM, были обнаружены в небольшом количестве только неизменённые споры при полном отсутствии вегетативной формы (рис. 5, г), что свидетельствует об отсутствии условий для их прорастания.

Рис. 5. Микрофотография мазка культуры штаммов B. anthracis 228 (а), 1(СО)-S (б), 228 прот (в) и 14/41-1а SM (г) с почвенной среды (6 сут). Окраска методом Ребигера, ×500. / Fig. 5. Micrograph of a culture smear of B. anthracis strains 228 (a), 1(CO)-S (b), 228 prot (c) and 14/41-1a SM (d) from the soil medium (6 days). Rebiger staining, ×500.

Обсуждение

В результате проведённых экспериментов была выявлена способность спор большинства использованных штаммов B. anthracis проходить стадию герминации с последующим формированием вегетативной культуры, а у части культур и последующее образование спор на питательной среде, основой которой является экстракт почвы. Добавление в такую агаризованную среду 2% гепаринизированной крови обеспечивало прорастание спор и формирование колоний у всех изученных в данной работе штаммов после инкубации в течение 1 сут. Влияние наличия крови в почвенной среде на эффективное спорообразование, очевидно, неодинаково у различных штаммов сибиреязвенного микроба. Так, после суточной инкубации на почвенно-кровяном агаре единичные бациллы в стадии спорообразования наблюдались в мазках только двух из исследованных штаммов — 228/8 и 14/41, а значительное количество внеклеточно расположенных спор наблюдалось только у штамма B. anthracis 228/8 через 3 сут. Отсутствие спорообразования на почвенно-кровяной среде в течение 3 сут у большинства использованных в работе штаммов B. anthracis подтверждает ингибирующее влияние крови на процесс образования спор [7]. Следует отметить, что в дальнейшем разложение белков крови почвенными бактериями, изменение влажности и температурного режима могут создать более благоприятные условия для спорообразования у большего количества штаммов.

Инкубирование посевов спор на почвенном агаре выявило возможность прохождения полного физиологического цикла развития культуры B. anthracis (спора–вегетативные клетки–споры) со значительным накоплением бактериальной массы, а затем и спор, пригодных для дальнейшего длительного сохранения или вступления в следующий физиологический цикл. Такие штаммы, вероятно, способны поддерживать эпизоотологическую значимость почвенных очагов сибирской язвы при определённых почвенно-климатических условиях. Споры большинства использованных в работе штаммов прорастали, образуя вегетативную культуру с различной степенью интенсивности размножения (от образования визуально различимых колоний до прорастания спор с образованием одиночных-парных бацилл без интенсивного размножения). Через 6 сут в окрашенных мазках из колоний и смывах с поверхности среды таких штаммов вне зависимости от количества вегетативной культуры, только в некоторых из них встречались единичные во всём препарате споры (от 1 до 5) или вовсе отсутствовали, несмотря на то что культуры уже находились в стадии деградации в виде инволюционных форм — шарообразные и веретенообразные бациллы и их раздутые бледные тени. Такие штаммы вряд ли способны воспроизводить и тем более наращивать потенциал очага. Споры некоторых штаммов не способны прорастать в условиях данного опыта.

Анализ фенотипических свойств штаммов из различных групп по способности размножаться и формировать споры на почвенном агаре не позволил на данном этапе выявить корреляцию между этими параметрами. Так, штаммы B. anthracis 1(СО), 14/41 и 228/4, которые не только демонстрировали рост в виде колоний, но и формировали зрелые споры, т.е. теоретически были наиболее перспективными для поддержания «почвенной популяции», различались по принадлежности к основным генетическим группам А или В, плазмидному составу, токсино- и капсулообразованию, протеолитической активности и наличию дополнительных питательных потребностей в триптофане (таблица). Следует, однако, учитывать, что указанные в таблице свойства характеризуют использованные штаммы в целом. В то же время при посевной дозе 1 × 10² КОЕ штаммы B. anthracis 1(СО), 1(СО) S, 1(СО)-5-1 SM, 228, 228/4, 228/8, 14/41, 14/41 Trp⁺ формировали 1–7 колоний, что свидетельствует о возможности неоднородности популяции изученных штаммов и делает возможным присутствие отдельных клеток с фенотипом, отличающимся от подавляющего большинства популяции каждого штамма. Исходя из этого важным для оценки значения вегетирования сибиреязвенных бацилл в условиях, приближенных к почве, является характеристика свойств культур, непосредственно способных к росту на почвенной среде. Всё это делает актуальным выделение таких культур и изучение их фенотипических свойств, генетических характеристик и особенностей экспрессии различных генов.

Актуальным представляется изучение влияния свойств различных типов почв и цикличности параметров температуры и влажности в условиях эксперимента на способность осуществлять полный цикл морфофункционального развития культур возбудителя сибирской язвы с различными свойствами.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Об авторах

Елена Анатольевна Котенева

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора; Северо-Кавказский федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: postgenom_stv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4525-1594

к.б.н., зав. лаб. постгеномных технологий, доцент каф. общей биологии и биоразнообразия

Россия, Ставрополь; Ставрополь