CHOLERA VIBRIO BIOFILM: PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND ROLE IN RESERVATION OF CAUSATIVE AGENT IN WATER ENVIRONMENT

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Выяснение причин укоренения холеры в эндемичных странах позволило установить длительную циркуляцию популяции возбудителя в поверхностных водоемах, служащих в качестве резервуара и основного фактора передачи инфекции и играющих определенную самостоятельную роль в эпидемиологии холеры [5, 8]. Здесь возбудитель в результате его выраженной адаптационной способности часто сохраняется в измененных формах и в виде сообществ [7]. Жизненно важным процессом в экологии микроорганизмов является формирование биопленок бактерий как во внешней среде, так и в организме человека. Изучение особенностей формирования биопленок некоторых бактерий in vitro и in vivo показало существование межклеточных контактов, обусловленных наличием фимбрий и перемычек (с образованием трехмерной структуры), слияние клеточных стенок и протопластов [10]. Образование регулируемой системой «Quorum sensing» [19] биопленки происходит через стадии разрозненных одиночных клеток и монослоя [21] с формированием сложного экзополисахаридного матрикса, в котором имеются водные каналы для доставки питательных веществ и выведения переработанных продуктов [16]. Тесные структурные ассоциации клеток в составе биопленки ведут к интенсивному обмену метаболитами (химическая коммуникация) и, возможно, генетическим материалом, приводящим к адаптивной изменчивости функций всего сообщества [20]. Подобная способность возбудителя холеры обеспечивается экспрессией комплекса генов, определяющих его выживаемость не только в организме человека (связанную с патогенными свойствами), но и в неблагоприятных условиях внешней среды. Существование различных механизмов выживания холерного вибриона в окружающей среде, включая формирование биопленки [23], представляет интерес для изучения циклических процессов его адаптации в составе водных экосистем. Цель работы - экспериментальное получение, характеристика и оценка роли биопленки в резервации холерного вибриона. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследована способность формировать биопленку 33 изолятов Vibrio cholerae eltor О1 и V cholerae О139 разной эпидемической значимости из коллекции музея живых культур Иркутского противочумного института: 22 штамма V. cholerae eltor О1, из них 11 выделенных от больных и из объектов окружающей среды (ООС) во время эпидосложнений (генотип ctxAB+ tcpA+) и 11 - от вибриононосителей и из поверхностных водоемов в благополучный период (генотип ctxAB- tcpA-); 11 штаммов V. cholerae О139 серогруппы, включая 4 клинических изолята (генотип ctxAB+ tcpA+) и 7 - из воды и ила открытых водоемов в благополучный период (генотип ctxAB- tcpA-). Исследование штаммов холерного вибриона проводили в соответствии с [4]. Штаммы изучены в мультиплексной ПЦР (М-ПЦР) с использованием праймеров для детекции генов ctxAB, tcpA, toxR [9] и в ПЦР с одной парой праймеров для детекции гена mshQ (определяет персистентный потенциал микроба), hapA (отвечает за продукцию гемагглютининпротеазы), vpsR (кодирует выработку экзополисахарида) и mbaA1, mbaA2 (участвуют в формировании структуры биопленки) [13, 15, 22, 25]. Для получения и исследования биопленки проведено несколько серий опытов. В первой серии исследовали способность вибрионов к образованию биопленки в условиях культивирования в бульоне Хоттингера (пробирочный метод) при 22 и 37°C в течение 24 час инкубации. Результат оценивали визуально по наличию окрашенного 0,1% раствором кристаллического фиолетового ободка на стенках пробирок после трехкратного промывания дистиллированной водой. Во второй серии проводили количественное определение способности вибрионов к образованию биопленки фотометрическим методом. В этом случае устанавливали способность V. cholerae к адгезии на стенках 96-луночной полистироловой планшеты с инкубацией в течение 24 час при 22 и 37°C [11]. После отмывания неприкрепленных клеток, окрашивания 0,1% раствором кристалл-виолета и экстракции красителя измерение оптической плотности (OD) осуществляли на ИФА-анализаторе Multiscan Ascent при длине волны 570 нм [24]. Выполнено два независимых разновременных эксперимента, в которых каждый штамм при обоих температурных режимах тестировался в 12 повторностях. Для статистической обработки результатов применяли двухфакторный дисперсионный анализ: перекрестная классификация, равномерный комплекс, смешанная модель (фактор «штамм» - случайный, фактор «температура» или «опыт» - фиксированный) [1]. В третьей серии опытов с интервалом 7 дней исследовали способность вибрионов к образованию биопленки: каждую культуру в концентрации 108 м.к./мл по 0,3 мл помещали в пробирки с 3 мл автоклавированной речной воды, содержащей субстрат (хитин, 1,0 мкл), а также в пробирки с 3 мл автоклавированной воды (контроль) при 4 и 22°С в течение трех месяцев. Определение холероген-ности полученных в этой серии опытов субкультур токсигенного штамма проводили посредством внутрикишечного заражения взвесью холерного вибриона (в дозе 107 м.к./мл) кроликов-сосунков в возрасте 9 - 12 дней массой 100 - 120 г [18]. В четвертой серии выявление формируемой холерным вибрионом биопленки проводили с использованием метода микроскопии (светооптической и люминесцентной). Для постановки эксперимента 1 мл 18-час бульонной культуры холерного вибриона добавлялся к 9,0 мл автоклавированной водопроводной воды. Полученная суспензия разливалась по 2,0 мл в стерильные пробирки в трех вариантах: взвесь культуры в воде; взвесь культуры с добавлением кристаллического (порошкообразного) хитина (1 мг); взвесь культуры с добавлением коллоидного хитина (50 мкл суспензии с концентрацией 140 мг/мл) [3] с содержанием пробирок при 22°С. Приготовленные из биопленки со дна пробирки в разные сроки (от 72 ч до трех месяцев) мазки фиксировали 10% формалином в этаноле в течение 30 мин, окрашивали кристаллическим фиолетовым (0,1% водный раствор), параллельно - толуидиновым синим (0,5% водный и 0,1% раствор в 30% этаноле) - 30 - 60 мин [6] и просматривали под микроскопом. Антиген О1 в составе биопленки выявляли в реакции иммунофлуоресценции с препаратами коммерческого диагностического флюоресцирующего холерного адсорбированного иммуноглобулина или конъюгированными с флюоресцеин-изотиоционатом моноклональными антителами ФИТЦ-МКА О1 (F8612). Нефиксированные (высушенные) мазки или препарат «раздавленная капля» окрашивали раствором акридинового оранжевого (АО) на цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ, рабочий раствор 1:6000) [6]. Микросъемку проводили на микроскопе «Karl Zeiss» с видеосистемой. На заключительном этапе исследований для сканирующей электронной микроскопии проводили щадящую процедуру фиксации препаратов (с максимальным сохранением образованной микроорганизмом биопленки) и обеззараживание материала. Культуру холерного вибриона в конечной концентрации 107 м.к./ мл в объеме 20,0 мл каждого штамма помещали во флаконы с 200 мл автоклавированной речной воды, содержащие на дне стерильные покровные стекла, и инкубировали при 18 - 22°С. В разные (от 1 до 12 мес.) сроки покровные стекла отмывали трехкратно дистиллированной водой и подвергали фиксации по [2] в нашей модификации. После проведения контроля специфической стерильности покровные стекла с образцами биопленки напылялись золотом в вакуумной напылительной установке «BALZERS SCD-004» Sputter Coater, Германия и исследовались в сканирующем электронном микроскопе Philips SEM525M в режиме высокого вакуума, ускоряющего напряжения 30 кВт и разрешения 8 нм. РЕЗУЛЬТАТЫ Исследование в условиях лаборатории возможности штаммов холерного вибриона, выделенных при разных эпидемиологических ситуациях, формировать биопленку показало, что их адаптационная способность различна и в определенной мере связана с условиями существования. В бульоне Хоттингера, рН 7,6 (первая серия опытов) формирование холерным вибрионом биопленки проявляется уже к концу суток. Выявлена высокая способность прикрепления клеток к стенке пробирок при 22°C токсигенного вибриона эльтор О1 серогруппы (И-1330, выделен из поверхностного водоема на фоне вспышки в г. Владивосток, 1999 г.) и нетоксигенного вибриона О139 серогруппы (И-16, выделен из водоема в месте сброса сточных вод городских очистных сооружений г. Иркутск), усиливающего образование биопленки в присутствии хитина. Во второй серии опытов количественное определение способности вибрионов разной эпидемической значимости к образованию биопленки при двух температурных режимах показало, что штаммы V. cholerae eltor обладают широким диапазоном способности образовывать биопленку - от еле видимого кольца на границе двух сред со значением оптической плотности от чуть выше фоновых (OD570=0,20) до мощной толстой пленки с экстинцией OD570 до 4,33. Культуры V. cholerae O139 проявляют меньший размах показателя (в пределах OD570 0,30 - 3,04). В отдельных независимых опытах при проведении дисперсионного анализа общую фенотипическую изменчивость признака у всех исследованных штаммов разлагали на дисперсию, определяемую различиями между штаммами, изменением температуры, взаимодействием между этими факторами и остаточную дисперсию. Полученные результаты показали, что влияние особенностей штаммов на изменчивость OD570 высоко значимо (соответственно в первом и втором опытах F=168,64, P<0,001 и F=58,87, P<0,001). Доли влияния фактора «штамм» составили 41,7 и 58,7%. Эти данные позволили установить значительный вклад в общую вариабельность изучаемого признака биологических особенностей исследованных штаммов. Однако они не позволяют сделать однозначного и окончательного вывода о роли этого фактора в контроле фенотипического проявления способности к образованию биопленки, поскольку при таком анализе нельзя исключить действия неконтролируемых внешних факторов. При проведении дисперсионного анализа признака как при 22°C, так и при 37°C общую изменчивость OD570 разлагали на дисперсию, зависящую от различий между штаммами, особенностями опытов, взаимодействием между этими факторами и остаточную дисперсию Молекулярно-генетическая характеристика штаммов V. cholerae V. cholerae eltor О1 V. cholerae О139 Источник выделения Опре деляемые гены человек ООС человек ООС человек ООС токсигенные нетоксигенные токсигенные нетоксигенные сtxAB 8/8* 3/3 0/6 0/5 4/4 0/7 tcpA 8/8 3/3 0/6 0/5 4/4 0/7 toxR 8/8 3/3 6/6 5/5 4/4 7/7 hap A 8/8 3/3 4/6 4/5 4/4 4/7 mshQ 8/8 3/3 3/6 5/5 4/4 0/7 mbaA1 7/8 3/3 6/6 5/5 4/4 1/7 mbaA2 8/8 3/3 6/6 5/5 4/4 6/7 vpsR 8/8 3/3 6/6 5/5 4/4 5/7 Примечание. ных штаммов. * Наличие гена/количество исследован- Оказалось, что при обеих тем- О1 и О139 серотрупп пературах выращивания вклад различий между штаммами в общую изменчивость изучаемого признака высоко достоверен (при первой из них: F=63,81, P<0,001, при второй: F=70,86, P<0,001). Доля влияния фактора «штамм» при 22°C составила 31,4%, а при 37°C - 42,9%. Полученные результаты свидетельствует о том, что разные штаммы в целом имеют неодинаковую способность к образованию биопленки. Сравнение средних значений OD570 у вибрионов из разных серогрупп выявило, что независимо от их эпидемической значимости штаммы, выделенные из объектов окружающей среды, обладают более высокой способностью к образованию биопленки по сравнению с изолированными из клинического материала. При этом наибольшие показатели оптической плотности при формировании биопленки продемонстрировали токсигенные штаммы биовара эльтор, выделенные из поверхностных водоемов во время вспышки холеры, по сравнению с токсигенными клиническими изолятами и нетоксигенны-ми культурами О1 и О139 серогрупп. Молекулярно-генетическое исследование штаммов показало, что общим для образующих биопленку штаммов является наличие генов, кодирующих «архитектуру» биопленки - mbaA1 и mbaA2, выработку экзополисахарида - vpsR; регуляторного гена toxR и отвечающего за экспрессию гемагглютининпротеазы - hapA (табл.). В третьей серии опытов при культивировании штаммов при 22°С в автоклавированной речной воде с хитином выявлена фенотипическая изменчивость клеток. На третьей неделе от начала эксперимента среди типичных колоний в S-форме эпидемического токсигенного вибриона эльтор И-1330 обнаружены сморщенные, сухие колонии, агглютинирующиеся холерными О- и RO-сыворотками, стабильные при пассажах на плотной питательной среде (казеиново-дрожжевой агар, рН 7,6), с сохранившимися основными генами вирулентности - ctxA, tcpA, toxR и вызывающие выраженный холерогенный эффект у кроликов-сосунков. В условиях культивирования при 4°С происходят более глубокие изменения в морфологии вибрионов (кокковидные с плотной стенкой клетки, подобные некультивируемым формам вибриона). Высев в ходе исследования из пробирок на плотные питательные среды показал отсутствие роста микроба на 21 день культивирования у эпидемического вибриона эльтор И-1330 (физраствор с хитином) и выделенного из водоемов в благополучный период вибриона эльтор И-638 (речная вода) с полным переходом на 91 день всех взятых в эксперименты этой серии штаммов в некультивируемое состояние. В этих пробах при окрашивании акридиновым оранжевым и просмотре посредством люминесцентной микроскопии препарата «раздавленная капля» обнаруживаются подвижные округлой формы клетки, единичные и собранные в конгломераты, имеющие зеленое свечение. В ПЦР выявляется исходный набор генетических детерминант каждого штамма холерного вибриона. В четвертой серии опытов с использованием метода светооптической и люминесцентной микроскопии выявлена способность эпидемических и неэпидемических штаммов холерного вибриона эльтор к образованию биопленки с сохранением в ней жизнеспособных клеток длительное время. Признаками формирования биопленки с самого начала эксперимента являются наличие периферически располагающейся части из прилегающих друг к другу вибрионов; тяжи; полиморфизм вибрионов (наряду с типичными кокковидные и полые формы) и розоватая или базофильная субстанция - экзополисахаридный матрикс [3]. Окрашивание препаратов холерной люминесцирующей сывороткой О1 обнаруживает периферическую структуру и отходящие от нее тяжи из специфически светящихся полиморфных клеток - прозрачная зеленоватая субстанция, содержащая специфически окрашенные изолированные клетки и их конгломераты. Описанная структура имеет полости по типу каналов. Прижизненная окраска препаратов АО выявляет частички коллоидного хитина с прикрепленными вибрионами зеленого цвета в виде микроколонии с окружающим ее экзополисахаридным матриксом (красновато-оранжевого цвета). Электронно-микроскопическое изучение препаратов выявило особенности цитоархитектоники полученной в эксперименте (30 - 150 суток) биопленки четырех штаммов V.cholerae О1 и О139 в S- и R-форме. Установлено, что в первые (30 сут) сроки морфология вибрионов О1 серогруппы представлена в виде типичной и полой формы клеток с дальнейшим образованием (60 сут) тяжей из этих клеток и формированием микроколоний преимущественно из округлой формы Рис. 1. Морфология токсигенного V. cholerae О139 (гладкая S-форма). а - исходная культура, б - 120 сут инкубации. х9600 СЭМ. Рис. 2. Морфология токсигенного V. cholerae О139 (шероховатая R-форма). а - исходная культура, б - 120 сут инкубации. х9600 СЭМ. клеток (120 сут). В отдаленный срок (150 сут) морфология биопленки представлена подвергшимися лизису конгломератами и изолированными клетками типичной и округлой (кокковидной) формы. У вибриона О139 серогруппы (рис. 1) через 30 сут эксперимента выявляется состоящая из округлых форм с включенными в нее диффузно типичными клетками вибриона колония. Через 60 - 90 сут - значительное утолщение и укрупнение последней, а также располагающиеся диффузно с пилями отдельные в состоянии деления клетки. Через 120 сут - гроздевидные скопления из клеток округлой формы, погруженных в плотный матрикс, а также вновь формирующаяся из типичных форм вибриона микроколония. В дальнейший срок (150 сут) наблюдается лизис составляющих элементов. Исследование штамма V. cholerae O1 в R-форме через 30 сут выявило делящиеся клетки, а также сформированную (60 сут) микроколонию из плотно упакованных округлой и типичной формы клеток с дальнейшей (90 сут) ее деструкцией и сохранением по периферии клеток типичной и округлой формы. Через 120 сут - скопления из округлой формы клеток в виде тяжа и гроздевидных микроколоний. В более поздний срок исследования - типичной и округлой форм клетки вибрионов, их небольшие скопления. Для биопленки, формируемой вибрионом О139 серогруппы в R-форме (рис. 2) через 30 сут характерны типичные вибрионы и округлой формы с отчетливо выраженными пилями и соединительными тяжами клетки, объединенные между собой в виде микроколонии, нередко многослойные, иногда с сетчатой структурой матрикса и немногочисленными в нем вибрионами. Через 60 сут, наряду с типичной формы вибрионами и подвергшимися лизису их скоплениями, имеют место клетки с полым центром и утолщенной клеточной стенкой. Наглядны скопления в виде грозди винограда из округлой формы клеток, выявляющиеся на 90 - 120 сут, а также клеточный детрит. В поздний срок (150 сут) - микроколония из типичных вибрионов и единичных округлой формы клеток. ОБСУЖДЕНИЕ Результаты проведенных экспериментов с V. cholerae eltor О1 и V. cholerae О139 разной эпидемической значимости и различного происхождения позволили наблюдать формирование биопленки и изменчивость микроорганизма в его основных формах - переход в стабильный шероховатый RO-фенотип (сохраняющий исходный набор генов патогенности), экспрессирующий необходимый для построения биопленки экзополисахарид и переход в некультивируемое состояние. Деструкция клеточных элементов обеспечивает поступление питательных веществ и возникновение повторных циклов размножения и иммобилизации клеток. Такая пластичность и высокие адаптивные свойства позволяют вибриону приспосабливаться к существованию при попадании в окружающую среду и приводят к длительной персистенции в водных объектах даже в условиях резко континентального климата. Примером может служить расследование причин обнаружения на протяжении 2,5 месяцев 2006 г. вибриона О139 серогруппы (наряду с RO-вариантом микроба и вибрионами не О1/О139) из проб воды и ила р. Ангары в г. Иркутск в месте глубинного выпуска правобережных очистных сооружений, когда было установлено длительное сохранение микроорганизмов рода Vibrio в иловых отложениях на этапах очистки сточных вод канализационноочистных сооружений, предположительно в составе биопленки. Все это подтверждает данные Donlan R.M., Costerton J.W. [17] о том, что в биопленочных сообществах более 99,9% бактерий растут в естественных водных экосистемах не в виде свободно плавающих клеток, а прикрепляются к любым твердым поверхностям абиотической и (или) биотической природы, образуя биопленки, имеющие в своем составе экзополисахаридный матрикс, при этом бактериальные клетки составляют не более 15% их объема [12]. Обнаружение в препаратах для микроскопирования вибрионов (кокковидных или имеющих форму овала), скомпонованных в виде конгломератов, отмечено и в наших ранних экспериментальных работах при получении и описании некультивируемых форм вибрионов. В данном исследовании обнаружение таких структур (конгломератов) позволяет рассматривать их как одну из форм образованной вибрионом биопленки. О существовании холерного вибриона в виде биопленки в поверхностном водоеме свидетельствует также факт более длительного (несколько дней) пребывания возбудителя в воде поверхностного водоема во время вспышки холеры в г. Владивосток (1999 г.) в сравнении со сроком прекращения выделения культур от больных холерой. Указанный токсигенный штамм из поверхностного водоема во время вспышки холеры в сравнении с клиническим изолятом на этой же вспышке обнаружил большие показатели оптической плотности (оценке биопленки по количественным показателям). Количественное определение способности вибрионов к образованию биопленки выявило, что этот показатель является характеристикой штаммов и определяется их биологическими особенностями. В целом величина этого признака у V. cholerae, выделенных из объектов окружающей среды, выше, чем у клинических изолятов. Очевидно, что такие свойства являются следствием адаптации холерного вибриона к существованию в природе, в этих условиях для увеличения выживаемости ему выгоднее агрегированное состояние. Можно полагать, что естественный отбор в природных условиях посредством образования биопленки направлен на поддержание гомеостаза популяции холерного вибриона. Полученные в настоящем исследовании данные согласуются с положением Б.Л.Черкасского [14], согласно которому одним из этапов развития пандемии холеры является попадание завезенного на территорию токсигенного вибриона в водную популяцию, где он не только сохраняет исходный патогенный потенциал, но и, образуя биопленку, способен к обмену генетической информацией [20]. Таким образом, формирование биопленки способствует резервации вирулентных штаммов холерного вибриона (в сапрофитической фазе существования микроорганизма) в случае их появления на территории в результате заноса или в межэпидемический период (на эндемичных территориях).

About the authors

E. S Kulikalova

Irkutsk Research Institute of Plague Control

Irkutsk, Russia

L. Ya Urbanovich

Irkutsk Research Institute of Plague Control

Irkutsk, Russia

S. G Sappo

Irkutsk Research Institute of Plague Control

Irkutsk, Russia

L. V Mironova

Irkutsk Research Institute of Plague Control

Irkutsk, Russia

E. Yu Markov

Irkutsk Research Institute of Plague Control

Irkutsk, Russia

V. V Malnik

Limnologic Institute

Irkutsk, Russia

V. M Korzun

Irkutsk Research Institute of Plague Control

Irkutsk, Russia

S. K Mitkeeva

Irkutsk Research Institute of Plague Control

Irkutsk, Russia

S. V Balakhonov

Irkutsk Research Institute of Plague Control

Irkutsk, Russia

References

Supplementary files