ADJUVANTED INFLUENZA VACCINES: DATA FROM DIRECT COMPARATIVE STUDIES

Full Text

Грипп остается одной из наиболее актуальных проблем современного здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [35, 36] ежегодно гриппом заболевают до 10% взрослого населения и до 30% детей. Осложнения при гриппе, в первую очередь пневмония, определяют тяжесть течения и летальный исход. Кроме того, ежегодные сезонные эпидемии гриппа приводят к значительным экономическим потерям. Актуальность гриппа для современного здравоохранения также во многом обусловлена пандемическим потенциалом этого вируса. На уровне ВОЗ [33, 34] вероятность вызвать следующую пандемию гриппа отмечается, прежде всего, для вирусов гриппа птиц (серотипы H5N1, H7N9), а также свиней и свиного происхождения, в особенности тройных реассортантов (серотипы H3N2, H1N1). События последних лет [33, 34, 36] четко показывают, что в любом месте и в любое время может появиться новый штамм вируса гриппа с высоким пандемическим потенциалом. Основа контроля гриппа и подготовки к возможной пандемии - своевременная вакцинопрофилактика [4, 35, 36]. Проблемы профилактики и терапии гриппа с использованием специфических препаратов, в первую очередь индукция резистентности вирусов гриппа и безопасность при массовом применении [3, 36], подчеркивают актуальность вакцинопрофилактики как основного подхода борьбы с гриппом. В настоящее время для профилактики ежегодных сезонных эпидемий в основном применяются инактивированные (расщепленные и субъединичные) трехвалентные вакцины, вводимые внутримышечно (подкожно), а для подготовки к возможной пандемии разрабатывают различные препандемические вакцины [4, 36, 38]. В то же время, имеющиеся инактивированные вакцины против гриппа не лишены ряда ограничений. Это, прежде всего, недостаточная эффективность при иммунизации групп риска по гриппу (маленькие дети, беременные, пожилые люди, лица с различными хроническими заболеваниями), а также низкая иммуногенность против антигенно отличных штаммов, не входящих в состав вакцины [1, 4, 36, 38]. Кроме того, имеются ограничения по мощности всех производителей вакцин против гриппа в мире, что затрудняет массовую вакцинопрофилактику, а также иммунизацию (прай-мирование популяции) с использованием препандемических вакцин. Ограничения препандемических вакцин очевидны и определяются тем, что до появления собственно пандемического штамма предсказать этот штамм невозможно [2, 33, 34]. Живые аттенуированные вакцины против гриппа на основе холодоадаптированных (ха) штаммов, вводимые интраназально, также разрешены к применению у человека. Однако некоторые аспекты эффективности и безопасности, в особенности объективная оценка эффективности, реверсия фенотипа аттенуированного штамма, биобезопасность и безопасность при массовом применении, реактогенность интра-назального пути введения, требуют более детального изучения [6]. Для решения ряда проблем вакцинопрофилактики гриппа с использованием, прежде всего, инактивированных вакцин предложено использовать иммуноадъюванты (адъюванты) [1, 2, 4, 36, 38]. Добавление адъювантов к вакцинам против гриппа позволит повысить эффективность и иммуногенность против не только вакцинного штамма (что важно при иммунизации групп риска по гриппу), но также различных антигенно отличных штаммов. Возможность индукции перекрестного иммунитета (против широкого набора антигенно отличных штаммов) крайне важна для препандемических вакцин. Кроме того, добавление адъювантов позволяет при сохранении достаточной иммуногенности переходить на простые (однократные) схемы иммунизации, а также снижать дозу антигена (гемагглютинина). Все это позволяет иммунизировать больше людей при той же мощности производства вакцин против гриппа. Адъюванты для вакцин против гриппа. К настоящему времени для вакцин против гриппа в доклинических и клинических исследованиях описан и изучен ряд адъювантов различной природы и механизма действия [1, 2, 4], на чем и основана их классификация. По природе можно выделить следующие адъюванты: на основе минеральных солей и оснований: гидроксид алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция, смеси этих адъювантов; на основе эмульсий: по типу масло в воде (м/в; MF59, AS03) и по типу вода в масле (в/м; полный и неполный адъюванты Фрейнда - CFA и IFA, соответственно); различные иммуномодуляторы: компоненты вирусов и бактерий - элементы клеточной стенки, нуклеиновые кислоты (РНК, ДНК), поверхностные и внутренние белки, их производные и синтетические аналоги; модифицированные (ареактогенные) токсины (эндотоксины), липополисахариды (LPS) также относятся к этой группе. По механизму действия выделяют: формирующие депо в месте введения, обеспечивающие замедленное высвобождение антигена в нативной форме, а также его защиту от деградации: к этой группе обычно относят минеральные соли и основания, а также эмульсии; обладающие прямым иммуномодулирующим действием: к этой группе обычно относят различные компоненты вирусов и бактерий, TLR-агонисты. Необходимо подчеркнуть, что не существует адъюванта, который бы имел только один механизм действия. Любой адъювант обладает комплексным механизмом действия и, по крайне мере в некоторой степени, взаимодействует как с антигеном, так и с иммунной системой. В то же время, для адъювантов, в особенности монокомпонентных (простого состава), можно выделить преимущественный механизм действия. Кроме того, для комплексных и многокомпонентных адъювантов, как CFA, очевиден сложный механизм действия - создание депо в месте введения и замедленное высвобождение антигена за счет эмульсии по типу в/м и прямая иммуномодуляция за счет бактериальных компонентов. Использование масляных адъювантов (эмульсий по типу в/м) заведомо сопряжено с высокой реактогенностью (что подтверждается свойствами CFA и IFA), в связи с чем, перспективными в группе эмульсий можно считать только эмульсии по типу м/в. Более того, именно в таких эмульсиях в водной фазе диспергируется масляная фаза, в которой могут быть стабилизированы гидрофобные компоненты, в том числе иммуномодуляторы, а также обеспечена защита антигена от внешних факторов. Таким образом, целесообразно классифицировать адъюванты для вакцин против гриппа и других актуальных инфекционных агентов человека и животных с использованием обоих подходов: 1. минеральные соли и основания (гидроксид алюминия, фосфат кальция и т.п.); 2. эмульсии (по типу м/в - MF59, AS03); 3. прямые иммуномодуляторы различного происхождения (природные и синтетические, TLR-агонисты). Несмотря на такой широкий набор, имеющиеся адъюванты для вакцин против гриппа и других актуальных инфекций также не лишены ограничений [1, 2, 36, 38]. В целом, адъюванты либо просто недостаточно повышают иммуногенность (эффективность) при добавлении к вакцине против гриппа, либо при повышении иммуноген-ности также повышается реактогенность. Классический пример эффективного, но небезопасного препарата - CFA, который позволяет получать, например, гипериммунную кроличью сыворотку с высокими титрами, но также весьма часто вызывает местные реакции. Оценка эффективности вакцин против гриппа с адъювантами. Основной подход оценки эффективности вакцин против гриппа, также входящий в материалы ВОЗ [36] - определение титров сывороточных антител по реакции задержки (торможения) гемагглютинации (РЗГА). При этом считается, что титры сывороточных антител по РЗГА коррелируют с защитной эффективностью, а титр 1:40 определяет 50% защиту, то есть иммуногенность по РЗГА является суррогатным показателем защиты от инфекции. Это понимание, в свою очередь, основано на данных классических исследований инактивированных вакцин против гриппа 70-х годов прошлого века [20], в которых проводили контролируемую инфекцию с участием добровольцев. Следует подчеркнуть, что в настоящее время объективная оценка эффективности инактивированных вакцин против гриппа возможна только при определении сывороточных антител по РЗГА, за исключением определения защитной эффективности напрямую (например, на модели летальной инфекции животных). Это связано с тем, что данные по корреляции с защитной эффективностью имеются только в отношении иммуногенности по РЗГА, а также тем, что только этот подход входит в материалы международных организаций и учреждений здравоохранения на различных уровнях: ВОЗ [36], CDC [10], EMEA [12]. Необходимо отметить, что даже на уровне ВОЗ [36] признается отсутствие данных по корреляции серологических методов (даже РЗГА) с защитной эффективностью для живых аттенуированных (ха) вакцин против гриппа. При этом далеко не во всех исследованиях вакцин против гриппа с адъювантами, в особенности сравнительных, определяются сывороточные антитела по РЗГА. В последние годы появились различные подходы оценки иммуногенности вакцин против гриппа, причем как инактивированных, так и живых аттенуированных, например: реакция нейтрализации (РН) с использованием перевиваемых линий культур клеток (прежде всего, MDCK); ELISA (определение классов и субклассов (изотипов) антител, прежде всего IgG и IgA, причем не только в сыворотке, но и в смывах (экстрактах) различных отделов респираторного тракта); определение индукции клеточных компонентов иммунитета, прежде всего поляризации Th1/2 по уровню некоторых цитокинов (в частности, IL-2, Il-4, IFNy), а также CD4 и CD8 маркеров. В то же время, опубликованных исследований по корреляции защитной эффективности с этими подходами практически нет даже на уровне модели репродукции дикого варианта вируса в легких после инфекции иммунизированных мышей. При этом опубликовано большое количество исследований различных вакцин против гриппа с адъювантами, в которых используются всевозможные подходы оценки, в том числе вышеперечисленные [1, 2, 4, 6]. Однако далеко не во всех таких исследованиях определяются титры сывороточных антител по РЗГА и защитный эффект, что отмечается и для сравнительных исследований адъювантов для вакцин против гриппа. Следует также отметить, что появляются данные об отсутствии связи защиты от инфекции и титров сывороточных антител по РЗГА, а также компонентов клеточного иммунитета [25]. Что касается определения сывороточных антител по РЗГА, то в нескольких исследованиях была показана крайне высокая вариабельность результатов между лабораториями, причем реакцию ставили с теми же сыворотками и антигенами. Среднегеометрический коэффициент вариации достигал 112% (различия до 32 раз) [37] и 261% [29]. Подавляющее большинство исследований вакцин против гриппа с адъювантами сравнивают собственно вакцину с адъювантом с плацебо или вакциной без адъюванта. Даже если представлены данные по РЗГА в условиях, когда результаты этого метода различаются в десятки раз при проведении анализа в разных лабораториях, объективное сравнение адъювантов для вакцин против гриппа по данным независимых исследований не представляется возможным. Таким образом, единственный объективный подход сравнительной оценки адъювантов для вакцин против гриппа - по данным прямых сравнительных исследований 2 и более адъювантов. В то же время, далеко не все прямые сравнительные исследования адъювантов для вакцин против гриппа соответствуют высокому научнометодическому уровню. Они часто не включают определение титров сывороточных антител по РЗГА (основополагающий показатель), а также изучение адъювантов всех основных групп (в соответствии с вышеизложенной классификацией; не менее 3 - минеральные соли/основания, эмульсии по типу м/в, прямые иммуномодуляторы). Данные прямых сравнительных исследований адъювантов для вакцин против гриппа крайне необходимы для объективного выбора оптимального (по эффективности и безопасности) адъюванта из имеющихся. Кроме того, такие данные незаменимы для научно обоснованного поиска принципиально новых адъювантов, а также разработки действительно инновационных адъювантов для вакцин следующего поколения против гриппа и других актуальных инфекционных агентов человека и животных. Доклинические исследования. Основные данные по прямому сравнению адъювантов получены в рамках доклинических исследований, а также при использовании инактивированных вакцин против гриппа. Инактивированные вакцины против гриппа (сравнение 2 адъювантов). Большая часть прямых сравнительных доклинических исследований адъювантов на модели инактивированных вакцин против гриппа включает лишь несколько адъювантов, обычно не более 2. При этом к решению проблемы поиска оптимальных по эффективности и безопасности адъювантов для инактивированных вакцин против гриппа в рамках прямых сравнительных исследований обращались, начиная с 70-х годов прошлого века. В классическом исследовании (1976 г.) на модели расщепленных вакцин против гриппа сравнивали частицы на основе полиметилметакрилата и гидроксид алюминия. Отмечалось большее повышение титров антител для частиц на основе полиметилметакрилата, причем как при полимеризации мономеров в присутствии антигена, так и при добавлении готовых частиц к вакцине [14]. На модели двухвалентной субъединичной вакцины против гриппа A/Victoria/3/75 (H3N2) и B/Hongkong/5/72 при внутримышечной иммунизации мышей сравнивали монофосфорил липид А (MPL) и гидроксид алюминия. Иммуногенность (РЗГА) против обоих вирусов была выше для MPL в сравнении с гидроксидом алюминия. Комбинации MPL с мурамил дипептидом (MDP) не были эффективны [17]. MPL - липид (эндотоксин) клеточной стенки бактерий (например, Re мутантов Salmonella typhimurium), токсичность которого снижается на несколько порядков путем химической обработки. В литературе монофосфорил липид А также обозначается как MPLA. В этой работе авторы также показали, что MPL в сочетании с димиколатом трегалозы (TDM) при внутривенном введении мышам без антигенов полностью защищает от летальной инфекции - адаптированный к мышам вирус A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), что связано со снижением титров вируса в легких. MDP (N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин) и TDM - иммуномодулирующие компоненты клеточных стенок бактерий (в особенности микобактерий и коринебактерий). Сравнение Syntex и CFA на модели инактивированной трехвалентной вакцины против гриппа при внутримышечной иммунизации мышей показало, что Syntex сравним или даже более иммуногенен, чем CFA (РЗГА). Титры сывороточных антител коррелировали с защитой от инфекции - уровень репродукции вируса A/Sichuan/2/87 (H3N2) в легких иммунизированных мышей. Авторы обнаружили, что треонил-MDP, входящий в состав Syntex, не определяет адъювантную активность. Однако при разведении Syntex с треонил-MDP до 1:202 существенный адъювантный эффект сохранялся [13]. Syntex - эмульсия по типу м/в, в состав которой входит производное MDP (треонил-MDP), а также полоксамер 401 (например, Pluronic L121). CFA (по классическому рецепту) - парафиновое (минеральное) масло, маннид моноолеат (эмульгатор) в соотношении 85:15, а также инактивированные температурой Mycobacterium tuberculosis. Современные модификации включают компоненты других микобактерий. При смешивании с антигеном (в физиологическом растворе, фосфатно-солевом буфере и т.п.) CFA образует эмульсию по типу м/в. Однако при модификации соотношений и состава эмульгаторов можно получить и эмульсию по типу м/в. Сам адъювант представляет собой масляный раствор, при этом эмульгирование водной фазы в этом адъюванте весьма трудоемко, как и собственно иммунизация. В другом исследовании иммуностимулирующие комплексы (iscom) - частицы размером 40 нм на основе сапонинов Quillaja сравнивали с CFA на модели антигенов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) (поверхностных гликопротеинов) при подкожной иммунизации мышей. Оценивали распределение антигена, Т-клеточный ответ в лимфоузлах и селезенке. Авторы отмечают, что различные адъюванты неодинаково влияют на локализацию и цитокиновый профиль Т-клеточных ответов. Так, праймированные CFA клетки в большей степени локализовались в лимфоузлах в сравнении с iscom. Кроме того, праймированные iscom клетки селезенки продуцировали IL-2, IL-4, IFNy (после in vitro стимуляции), то есть отмечался Th1 профиль, тогда как для CFA отмечался высокий уровень только IL-2 [27]. На модели гемагглютинина штамма X31 (H3N2), выделенного бромелаином, сравнивали CFA и фосфат алюминия, также исследовали конъюгат гемагглютинина и мышиных моноклональных антител (иммунотаргетинг: антитела специфичны к видокроссреактивным детерминантам MHC II). Иммунизация кроликов и хорьков индуцировала сывороточные IgG (ELISA), уровень был сравним с фосфатом алюминия, но составил лишь 1/4 уровня CFA. По РЗГА конъюгат был более иммуногенен, чем фосфат алюминия, и менее иммуногенен, чем CFA [28]. На модели расщепленной вакцины при внутрибрюшинной иммунизации мышей сравнивали MPL (из Bordetella pertussis) и гидроксид алюминия, а также смесь этих адъювантов. MPL был существенно более иммуногенен (РЗГА) в сравнении с гидроксидом алюминия, при этом использование смеси позволяет в большей степени повысить иммуногенность (при дозе MPL от 0,1 мкг). Авторы также отмечают Th2 поляризацию при использовании гидроксида алюминия в отличие от более сбалансированного уровня IgG1/IgG2a для MPL. Комбинация адъювантов также в наибольшей степени индуцировала IFNy и IL-4. Кроме того, авторы отмечают, что добавление сквалена незначительно влияло на иммуногенность MPL с добавлением или без гидроксида алюминия, однако эти данные не представлены [22]. На модели вирусоподобных частиц - гемагглютинин - A/Indonesia/05/2005 (H5N1), нейраминидаза - A/Thailand/1(KAN-1)/04 (H5N1), а также HIV gag при иммунизации мышей в возрасте 4 или 24 месяца сравнивали смесь гидроксида алюминия и магния (внутримышечное введение) с poly I:C (поли-инозиновая:поли-цитидиловая кислота, агонист TLR3; интраназальное введение). Иммунизация мышей возрастом 4 месяца вакциной без адъюванта защищала животных от летальной инфекции: реассортант на основе A/Indonesia/05/2005 (H5N1) (гемагглютинин и нейраминидаза), остальные сегменты генома - A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1). В то же время, высокая защита от инфекции для мышей в возрасте 24 месяцев отмечалась при добавлении адъювантов. Данные по защите от летальной инфекции представлены лишь для poly I:C (интраназальное введение): треть мышей выживала при иммунизации только вакциной, а использование только адъюванта не индуцировало защиту. Авторы не выявили связи защиты с титрами антител по РЗГА или специфичными к гемагглютинину CD8+ Т-клетками, которые индуцировались при добавлении к вакцине адъювантов у мышей в возрасте 4, но не 24 месяцев [25]. Следует однако отметить, что в этой работе нет четких указаний на прямое сравнение адъювантов (несмотря на разные пути введения вакцины). Для сравнения mOMV и гидроксида алюминия мышей иммунизировали внутримышечно инактивированной цельновирионной вакциной: гемагглютинин A/ Environment/Korea/W149/06 (H5N1), нейраминидаза - A/Chicken/Korea/ma116/04 (H9N2), остальные сегменты генома - A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Авторы отмечают, что оба адъюванта повышали защитный эффект (летальная инфекция вирусами H5N1 и H9N2, сегменты которых использовались в вакцинном штамме). В то же время, mOMV в большей степени индуцировал перекрестный иммунный ответ (серологический и защиту от инфекции) [15]. mOMW - модифицированные везикулы внешней мембраны, полученные на основе мутантной Escherichia coli W3110 AmsbB/pagP, представляют собой нереплицирующиеся наночастицы бактериального происхождения. Состоят из пента-ацилированных остатков липида А (LPS, TLR4 агониста), которые в меньшей степени проявляют активность эндотоксина. В другом исследовании на модели нескольких антигенов - поверхностный антиген гепатита В, овальбумин и гемагглютинин штамма А/Texas1/77(H3N2) при внутримышечной иммунизации мышей было показано, что комбинация CpG (олигоде-зоксинуклеотид, TLR9 агонист) и ISCOMATRIX (в сравнении с использованием по отдельности) дополнительно усиливает адъювантный эффект. Авторы отмечают индукцию IFNy при комбинации адъювантов для всех изученных антигенов [18]. ISCOMATRIX - сапонин ISCOPREP (очищенная фракция экстракта коры Quillaja saponaria; CSL, Австралия), фосфолипиды (дипальмитоил фосфатидилхолин) и холестерин. Необходимо отметить, что на модели антигена гепатита также изучали гидроксид алюминия. На модели расщепленной вакцины на основе штамма A/Anhui/1/2005 (H5N1) при внутримышечной иммунизации мышей проводили сравнения PLA (микрочастицы на основе поли(молочной кислоты) и гидроксида алюминия. Авторы отмечают, что гидроксид алюминия индуцировал гуморальный иммунный ответ (ELISA), а PLA - как гуморальный, так клеточный (по IFNy, IL-2 и IL-12; CD4, CD8). По механизмам действия авторы отмечают эффект депо в месте введения, местное воспаление и улучшенный транспорт антигена в лимфатические узлы, а также усиление экспрессии MHC II на дендритных клетках лимфоидных органов для гидроксида алюминия. Для PLA - усиление транспорта антигена в лимфатические узлы и усиление экспрессии MHC I и II, а также других ко-стимулирующих молекул в лимфоидных органах [40]. Необходимо подчеркнуть, что данные по иммуногенности (РЗГА и РН) не приведены. Следует отметить несколько сравнительных исследований иммунобиопрепаратов на основе хитозана (популярное направление разработок последних десятилетий) и других адъювантов. На модели инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа птиц - NIBRG-14 (H5N1) при внутрибрюшинной иммунизации мышей сравнивали адъювант на основе хитозана и гидроксид алюминия. Авторы отмечают сравнимый адъювантный эффект по защите животных от летальной инфекции - адаптированный к мышам штамм A/chicken/Henan/12/2004 (H5N1) и индукции сывороточных антител (IgG, ELISA) [11]. Отсутствие адекватной информации по источнику хитозана (указано лишь «Sigma»), физико-химическим характеристикам (по крайне мере, молекулярный вес, вязкость и степень деацетилирования), чистоте (по крайней мере, уровень эндотоксинов), методике приготовления и стерилизации не позволяет говорить о том, что препарат на основе хитозана был сравним по адъювантным свойствам с гидроксидом алюминия. Более того, исследование в принципе нельзя воспроизвести. Также следует отметить, что в работе не представлены результаты основного подхода оценки иммуногености - титры сывороточных антител по РЗГА. В другом исследовании при интраназальной иммунизации мышей рекомбинантным гемагглютинином на основе штамма A/EM/Korea/W149/06 (H5N1) сравнивали холерный токсин и микрочастицы поли-у-глутаминовой кислоты (yPGA)/хито-зана. Авторы отмечают потенциал микрочастиц yPGA/хитозана по индукции сывороточных IgG (в том числе субклассов), секреторных IgA (ELISA), а также РЗГА и РН (сыворотки и гомогенат легких), индукции IL-4 и IFNy в спленоцитах и защите от летальной инфекции. Исходный хитозан (указано лишь «Sigma-Aldrich») подвергали ферментативному гидролизу, базовые характеристики не представлены (отмечено лишь, что гидролиз проводили для снижения молекулярной массы до <15 кДа, метод подтверждения показателя не указан). Данные по размеру частиц также не приведены, хотя отмечено использование метода динамического светорассеяния (DLS) [19]. В еще одном сравнительном исследовании при интраназальной иммунизации мышей субъединичной вакциной на основе штамма NIBRG-14 (H5N1) сравнивали хитозан и (3’, 5’)-циклический димер гуанозин монофосфата (c-di-GMP). Все адъюванты, в том числе смесь этих препаратов, повышали гуморальный и секреторный (местный) иммунный ответ, наибольший уровень отмечался для смеси. В отношении c-di-GMP также отмечалась возможность снижения дозы гемагглютинина. Кроме того, c-di-GMP индуцировал преимущественно Th1 иммунный ответ (CD4, IFNy, TNFa, IL-2), хитозан - Th2, а их комбинация - сбалансированный ответ по Th поляризации [30]. Однако информация по хитозану противоречива - указан источник (ChiSys, Archimedes Development, Соединенное Королевство), однако также отмечается, что использовался хитозан глутамат 213 (FMC BioPolymer, Норвегия), который был деацитилирован на 75 - 90% и содержал 35 - 50% глутамата. Не указаны молекулярная масса хитозана, уровень эндотоксинов, методика приготовления и стерилизации. Таким образом, ни в одном из сравнительных исследований хитозана и других адъювантов для вакцин против гриппа, количество которых весьма ограничено, не представлена даже базовая характеристика хитозана: источник субстанции, физикохимические свойства - по крайней мере, молекулярный вес (масса), вязкость, степень деацетилирования, чистота (по крайней мере, уровень эндотоксинов), краткая методика приготовления (в особенности используемая форма - раствор, микрочастицы и т.п.) и стерилизации. Все это делает такие исследования невоспроизводимыми, а научное обсуждение объективных адъювантных свойств хитозана - невозможными. Необходимо подчеркнуть, что в настоящее время объективных данных об адъювантных свойствах препаратов на основе хитозана нет, а для решения этой проблемы, тем более в рамках сравнительных исследований с другими адъювантами, недопустимо использование не охарактеризованных хотя бы по базовым параметрам субстанций хитозана, а также полученных из неустановленных источников [31]. Инактивированные вакцины против гриппа (сравнение 3 и более адъювантов). Данные доклинических исследований, сравнивающих 3 и более адъювантов (особенно более 3), тем более с учетом научно-методического уровня (определение иммуногенности прежде всего по РЗГА и РН), весьма ограничены. Синтетический MDP, CFA и адъювант на основе алюминия сравнивали на модели синтетической вакцины против гриппа (пептид на основе последовательности гемагглютинина 91-108). Все адъюванты индуцировали сравнимый уровень антител против пептида (ELISA, сыворотка) при внутрибрюшинной иммунизации мышей, однако лишь CFA индуцировал значительный уровень перекрестной активности против вируса A/Texas/77 (H3N2). Авторы выделяют MDP, ковалентно связанный с пептидом, как достойную замену CFA по индукции защиты от инфекции - адаптированный к мышам вирус A/Texas/77 (H3N2). При этом простая смесь вакцины и MDP практически не индуцировала защитный эффект [26]. В работе не указано, какой именно адъювант на основе алюминия использовался, приведено лишь собирательное название «алюм». Среди адъювантов на основе алюминия можно выделить гидроксид и фосфат алюминия, их смесь, возможны и другие варианты, а алюм - это обозначение алюмокалиевых квасцов, которые также изучались как возможный адъювант. В другом исследовании на модели расщепленной вакцины на основе штамма A/ New York/55/2004 (H3N2) при внутримышечной и интраназальной иммунизации мышей сравнивали гидроксид алюминия, AS03 и протоллин. Необходимо отметить, что вакцину с протоллином вводили интраназально, а вакцины с гидроксидом алюминия и AS03 - внутримышечно. Гидроксид алюминия и AS03 существенно повышали титры антител против вакцинного и антигенно отличного (дрейфового) штамма A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), отмечался тренд Th2 поляризации. Для вакцины с протоллином, напротив, отмечался тренд Th1 поляризации, а также только этот вариант индуцировал мукозальные IgA (ELISA). Большая иммуногенность (РЗГА, РН) отмечалась для AS03 в сравнении с протоллином. Кроме того, вакцина с гидроксидом алюминия и протоллином (в меньшей дозе) в большей степени индуцировали CD4 Th1 и Th2 ответ и больший уровень IFNy-продуцирующих CD8 Т-клеток в сравнении с вакциной без адъюванта [7]. AS03 - эмульсия по типу м/в на основе сквалена и токоферола. Протоллин-протеосомы (белки внешней мембраны Neisseria meningitidis группы В), нековалентно связанные в комплекс с LPS Shigella flexneri серотип 2а. Следует подчеркнуть, что данные по иммуногенности (РЗГА, РН) в работе представлены как соотношение обратных титров относительно контроля, что существенно затрудняет независимый анализ и интерпретацию. На модели виросомальной вакцины против вируса гриппа птиц на основе штамма A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) при внутримышечной иммунизации мышей сравнивали 4 адъюванта: фосфат и гидроксид алюминия, MF59, а также Matrix-M. Все адъюванты существенно повышали иммуногенность - титры сывороточных антител по РЗГА, а также уровень сывороточных IgG по ELISA в сравнении с вакциной без адъюванта. Кроме того, появлялась возможность использования сниженных доз вакцины. Авторы отмечают различия адъювантов по индукции субклассов IgG - Matrix-M в большей степени индуцировал IgG2, то есть Th1 поляризацию. Добавление адъювантов не усиливало индукцию CD4+ T-клеточного ответа, однако добавление MF59 или Matrix-M существенно усиливало CD8+ Т-клеточный ответ. По совокупности данных авторы отмечают наибольший потенциал для Matrix-M, затем MF59 и препаратов на основе алюминия [23]. MF59 - эмульсия по типу м/в на основе сквалена; Matrix-M - смесь 2 раздельно приготовленных моно-фракций сапонина, образующих пространственные структуры (cages). Следует подчеркнуть, что в описании рисунков отмечено проведение 3 независимых экспериментов, причем не указано, какие адъюванты входили в каждую серию экспериментов (кроме контроля и собственно виросомальной вакцины), то есть, все представленные данные (РЗГА, ELISA, компоненты клеточного иммунитета) могли и не быть получены в рамках прямых сравнительных исследований. Не ясно, почему это существенное ограничение работы не было вынесено в резюме, а также раздел «Материалы и методы». Кроме того, виросомальная вакцина против гриппа - так называемое 4 поколение, но авторы обозначают эти вакцины как препараты с адъювантом, то есть в ходе работы добавляют дополнительные адъюванты, что вносит некоторую сложность при оценке представленных данных, при этом типовая вакцина без адъюванта (например, расщепленная или субъединичная) в сравнение включена не была. Несмотря на определение индукции гуморальных и клеточных компонентов иммунитета, данных по РН нет. На мышах с использованием расщепленной сезонной трехвалентной вакцины против гриппа при внутримышечной иммунизации проводили сравнение механизмов действия 4 адъювантов: Matrix-M, гидроксида алюминия, CFA и AS03. Matrix-M был особенно эффективен при активации клеток врожденной иммунной системы (нейтрофилы, дендритные клетки, макрофаги). При изучении повторного иммунного ответа (рестимуляция спленоцитов) сравнивали Matrix-M, гидроксид алюминия и AS03, и авторы отмечают, что Matrix-M в большей степени индуцировал Th1 и Th2 иммунный ответ, при этом выделяя роль продукции нейтрофилами хемоаттрактанта KC. В исследовании также изучался иммуностимулирующий потенциал Matrix-M при введении без антигена. Кроме того, авторы отмечают, что данные других исследований (токсичность, клинические испытания) показывают умеренный или средний уровень реактогенности Matrix-M [16]. Matrix-M в этой работе - AbISCO-100 (Isconova, Швеция), 2 фракции частиц размером 40 нм - Matrix-A и Matrix-C (разные фракции сапонина). При внутримышечной иммунизации мышей на модели субъединичной вакцины против гриппа сравнивали 5 адъювантов: MF59, гидроксид алюминия, CpG, небольшую молекулу R848 (resiquimod) и липопептид Pam3CSK4. Лишь MF59 и Pam3CSK4 повышали иммуногенность (титры антител по РЗГА и ELISA), при этом на модели вакцины против столбняка все адъюванты повышали титры антител (ELISA). Авторы отмечают, что адъювантный эффект для вакцины против гриппа коррелировал с индукцией провоспалительных генов, а также других генов, связанных с трансэндотелиальной миграцией лейкоцитов в месте иммунизации. Кроме того, MF59 и Pam3CSK4 в наибольшей степени индуцировали рекрутинг эритроцитов в мышце, при этом не были мощными индукторами IFN-опосредованных иммунных реакций, то есть являются IFN-независимыми адъювантами. В то же время, R848, как отмечалось выше, не был иммуногенным (не индуцировал антитела), но активировал IFN-опосредованные иммунные реакции в мышце и лимфатических узлах [9]. CpG, R848 и Pam3CSK4 - TLR-агонисты, TLR9, TLR7/8 и TLR2, соответственно. Следует отметить, что производитель вакцины в статье не указан, а в разделе «Материалы и методы» нет указаний на тип вакцины (субъединичная). В другом исследовании на модели субъединичной культуральной (MDCK) трехвалентной вакцины против гриппа при внутримышечной иммунизации мышей сравнивали 5 адъювантов: гидроксид алюминия, фосфат кальция, MF59, PLG и CpG. Авторы выделяют наибольший потенциал MF59 по индукции титров сывороточных антител (РЗГА, РН), а также Т-клеточного ответа (индукция различных цитокинов при стимуляции клеток селезенки антигенами). Кроме того, авторы отмечают, что добавление CpG к другим адъювантам (гидроксид алюминия, MF59, фосфат кальция, PLG) в целом несколько повышает титры антител. Добавление CpG к MF59 приводит также к большей Th1 поляризации (по субкла^ам IgG и уровню IFNy в клетках селезенки). Следует однако отметить, что данные по уровню субклассов IgG и нейтрализации представлены только для экспериментов по изучению влияния добавления CpG к MF59 [32]. PLG - суспензии микрочастиц на основе поли-(лактид ко-гликолида), биосовместимого и биодеградируемого материала. Следует отметить исследование, в котором сравнивали 5 адъювантов на модели морских свинок с использованием антигена вируса гриппа линии B/Panama. К вакцине добавляли в 2 вариантах дозировки CFA, IFA, Syntex, RIBI, TiterMax и фосфат алюминия. Авторы отмечают, что практически все адъюванты в различных дозах, за исключением Syntex, существенно повышали титры антител на 28 и 42 день в сравнении с контролем. В то же время, более иммуногенные адъюванты, особенно в большей дозе, также индуцировали более выраженные местные реакции, а Syntex, как и вакцина без адъюванта, не были реактогенны. По соотношению высокой иммуно-генности и низкой реактогенности выделялся адъювант TiterMax [24]. IFA - масло и эмульгатор (как в CFA), но без бактериального компонента, образует эмульсию по типу в/м. Адъювант RIBI - эмульсия по типу м/в на основе сквалена и твин-80, также содержащая очищенные компоненты микобактерий (современные модификации используют синтетические бактериальные компоненты) и MPL. TiterMax - адъювант на основе сурфактантов - неионных сополимеров полиоксипропилена и полиоксиэтилена, а также сквалена и эмульгатора (в частности, спан-80). TiterMax образует эмульсию по типу в/м. Эта работа четко показывает, что классические эмульсии (даже эмульсии по типу м/в) не обладают оптимальным сочетанием эффективности и безопасности. Сравнение 6 адъювантов на модели субъединичной вакцины на основе штамма A/Beijing/353/89 (H3N2) при подкожной иммунизации мышей показало, что добавление L180.5 с LPS, а также CFA существенно повышали титры антител. В то же время, Q-VAC, L180.5 со скваленом, L180.5 без добавок и Montanide ISA 740 лишь умеренно повышали иммуногенность вакцины или даже были неэффективны. Кроме того, для Q-VAC и L180.5 с LPS отмечалась большая индукция IgG2a и IgG2b субклассов. Уровень нейтрализующих антител (в культуре клеток LLC-MK2D) и профиль IgG (ассоциированные с клетками антигены) определялись в сыворотке иммунохимически [8]. Q-VAC - смесь сапонинов (природные сурфактанты) коры Quillaia saponaria Molina. Montanide ISA 740 - эмульсия по типу в/м (соотношение 30:70), в состав входят частично метаболизируемые масла и октадеканоевые эфиры маннитола. L180.5 - неионный сополимер (сурфактант), к которому добавляли LPS, использовали как эмульсию по типу вода в масле в воде (в качестве масляного компонента выступал сквален) или без добавок. Таким образом, основные данные по сравнительному изучению адъювантов для инактивированных вакцин против гриппа были получены в последнее время, уже после 2000 г. Результаты исследований высокого научно-методического уровня, которых насчитывается лишь несколько, также были опубликованы в этот период. Живые аттенуированные вакцины против гриппа. Альтернативный подход вакцинопрофилактики гриппа - использование живых аттенуированных вакцин, прежде всего на основе ха штаммов [6], которые уже разрешены к применению в некоторых регионах мира. В то же время, данные сравнительных исследований живых аттенуированных и инактивированных вакцин против гриппа разнонаправлены и ограничены. Также практически отсутствуют данные прямых сравнительных исследований адъювантов для живых аттенуированных вакцин против гриппа. В то же время, живые аттенуированные вакцины против гриппа - крайне перспективная модель оценки механизма адъювантного действия, поскольку используется антиген в нативной форме (живой вирус) при интраназальном пути введения, что соответствует естественной инфекции. Клинические исследования. Количество прямых сравнительных клинических исследований адъювантов для вакцин против гриппа весьма ограничено, особенно в сравнении с доклиническим уровнем. В одном из немногих клинических исследований (266 взрослых добровольцев) на модели расщепленной вакцины против гриппа свиного происхождения H1N1 2009 г. в разных дозах при внутримышечной иммунизации сравнивали несколько адъювантов и их смеси. В качестве адъювантов изучали гидроксид алюминия, смесь гидроксида алюминия с MPL (из Bordetella pertussis) и/или скваленом, а также смесь из всех 3 этих адъювантов (4 адъюванта в сумме). Оценка иммуногенности проводилась по титрам сывороточных антител (РЗГА). Авторы отмечают достаточную иммуногенность уже после первой иммунизации для вакцины в дозе 15 мкг гемагглютинина без адъюванта, 7,5 мкг гемагглютинина с гидроксидом алюминия, MPL и скваленом, 3,75 мкг гемагглютинина с гидроксидом алюминия и MPL или гидроксидом алюминия и скваленом [21]. В исследовании однако не представлены все комбинации изученных адъювантов. Кроме того, представляет несомненный интерес сравнение этих препаратов с другими известными адъювантами для вакцин против гриппа, прежде всего эмульсиями по типу м/в. Сравнительное клиническое исследование адъювантов было проведено и в Российской Федерации. На модели расщепленной вакцины на основе штамма NIBRG-14 (H5N1) изучали гидроксид алюминия и полиоксидоний. Наибольшая иммуногенность отмечалась для дозы гидроксида алюминия 0,5 мг при дозе гемагглютинина 15 мкг и для дозы полиоксидония 0,75 мг при дозе гемагглютинина 45 мкг. С учетом эффекта снижения дозы гемагглютинина авторы отдают предпочтение вакцине с добавлением в качестве адъюванта гидроксида алюминия [5]. Таким образом, сравнительных данных, полученных в рамках клинических исследований, по основным группам адъювантов для вакцин против гриппа в настоящее время нет. Мета-анализы и систематические обзоры. Как отмечалось выше, клинические исследования, в которых с использованием вакцин против гриппа напрямую сравниваются различные адъюванты, практически отсутствуют. В связи с этим, данных для объективного проведения систематического обзора, тем более мета-анализа, нет. Тем не менее, был опубликован мета-анализ и систематический обзор клинических исследований вакцин против гриппа свиного происхождения H1N1 2009 г. (16 статей, почти 18 000 добровольцев). В этом исследовании делается заключение о превосходстве вакцин без адъюванта и вакцин с эмульсиями по типу м/в (MF59, AS03) над вакцинам с адъювантами на основе алюминия [39]. Следует отметить, что хотя основной критерий оценки - уровень сывороточных антител по РЗГА (серозащита), прямое сравнение адъювантов не являлось обязательным для включения. Таким образом, становится очевидно, что данные прямых сравнительных исследований 2 и более адъювантов достаточно ограничены, а с учетом адекватного научнометодического уровня и включения адъювантов 3 основных групп (минеральные соли и основания, эмульсии по типу м/в и иммуномодуляторы) практически отсутствуют. Более того, далеко не во всех сравнительных исследованиях приводятся данные по иммуногенности даже по титрам сывороточных антител в РЗГА. В ряде случаев нечетко указаны подходы оценки эффективности и иммуногенности, в особенности влияния на клеточные компоненты, а также оптимальный по мнению авторов вариант (монопрепарат или смесь). Следует также отметить, что в исследованиях в качестве модели используются различные варианты вакцин против гриппа, в частности препандемические, виросо-мальные, культуральные, рекомбинантные, однако основа вакцинопрофилактики гриппа в настоящее время и в ближайшем будущем - типовые сезонные инактивированные эмбриональные вакцины, прежде всего расщепленные и субъединичные. Тем не менее, совокупность данных позволяет, по крайней мере, наметить перспективные векторы научных исследований адъювантов для вакцин против гриппа и других актуальных инфекционных агентов: 1. Прежде всего, отмечается потенциал адъювантов на основе хитозана, однако ряд проблем в биомедицинских исследованиях препаратов хитозана не просто стоит крайне остро, но даже не получает должного внимания. В подавляющем большинстве исследований характеристика хитозана (исходной субстанции, адъюванта на ее основе), методика приготовления, подходы стандартизации (методы определения характеристик) представлены неполностью или вообще отсутствует [31]. Другими словами, полученные результаты нельзя воспроизвести. На первых этапах в рамках научных исследований необходимо изучить адъювантный эффект препаратов на основе адекватно охарактеризованных субстанций (в том числе по чистоте), полученных из открытых источников, с полным указанием методики приготовления (в том числе стерилизации) и подходов стандартизации. Такие работы позволят получить объективную оценку потенциала адъювантов на основе хитозана для вакцин против гриппа и других актуальных инфекционных агентов. 2. Весьма интересно совершенствование эмульсий по типу м/в, тем более, что такие адъюванты как MF59 и AS03, как правило, показывают очень высокую имму-ногенность, однако при высокой реактогенности. CFA до сих пор является одним из наиболее мощных адъювантов, хотя в силу реактогенности его применение ограничено. Оптимизация состава и доз компонентов эмульсий по типу м/в, использование потенцирующего эффекта, переход на масла и поверхностно-активные вещества с высокой биосовместимостью, обеспечение максимальной дисперсности, возможно, позволят снизить реактогенность таких адъювантов при сохранении высокой имму-ногенности и эффективности. 3. Наибольший интерес представляют многокомпонентные адъюванты. В некоторых исследованиях простое смешивание отдельных адъювантов приводило к потенцированию иммуногенности и даже нормализации клеточных компонентов иммунной системы (в частности, Th-поляризации) [18, 22, 30, 32], хотя и не всегда [21, 26]. По нашему мнению, многокомпонентные адъюванты по общей формуле депо + иммуномодулятор - одно из наиболее перспективных направлений совершенствования вакцинопрофилактики. Возможно, они станут основой вакцин следующего поколения против гриппа и других актуальных инфекционных агентов человека и животных. Инновационность подхода - потенцирование адъювантного действия каждого из компонентов, что позволяет снижать дозу и обеспечивает высокую безопасность, а также экономическую целесообразность даже при использовании дорогостоящих индивидуальных компонентов. При этом используются компоненты с принципиально различными механизмами действия, что определяет комплексное и продолжительное воздействие на все компоненты иммунной системы. Возможно, в состав перспективных многокомпонентных адъювантов войдет и хитозан, но только после решения вопросов по объективной оценке адъювантной активности, а также стандартизации. К настоящему времени назрела острая необходимость проведения прямых сравнительных исследований адъювантов для вакцин против гриппа на высоком научнометодическом уровне. В исследования должны быть включены адъюванты всех основных групп, различных по природе и механизму действия (прежде всего, минеральные соли и основания, эмульсии по типу м/в, а также иммуномодуляторы природного и синтетического происхождения прямого действия). В частности, в базовую панель адъювантов различной природы и механизма действия для сравнения с перспективными компонентами и/или адъювантами-кандидатами целесообразно заложить такие препараты как гидроксид алюминия и CpG или другой TLR-агонист, эмульсии по типу м/в на основе сквалена и токоферола. Такие данные будут незаменимы не только для объективного выбора оптимального из имеющихся адъювантов, но и для научно обоснованного поиска принципиально новых адъювантов для эффективных и безопасных вакцин против гриппа следующего поколения, а также других актуальных инфекций человека и животных. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

M. I Chernikova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Yu. M Vasiliev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

References

Supplementary files