STUDY OF HUMORAL IMMUNE RESPONSE FEATURES BASED ON MODELLING OF ANTIGEN DETERMINANTS OF HEPATITIS С VIRUS BY SYNTHETIC PEPTIDES AND GENETICALLY ENGINEERED POLYPEPTIDES

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Авторами ряда работ, опубликованных на начальном этапе исследования гепатита С (ГС), указывалось на то, что выявление антител к отдельным антигенным детерминантам (белки и отдельные эпитопы) вируса ГС (ВГС) коррелирует с определенной фазой течения заболевания и позволяет оценить активность патологического процесса [5, 16]. Однако эти первоначальные исследования, как правило, либо ограничивались сопоставлением частоты выявления IgG к core- и NS4-белкам, либо их титров у различных групп больных, либо проводилось аналогичное сравнительное исследование частоты выявления IgG и их уровня к отдельным фрагментам из последовательности структурных белков ВГС. В ходе ранее проводившихся нами исследований были установлены различия в динамике гуморального иммунного ответа (антител как класса G, так и класса M) у больных ГС по отношению к отдельным фрагментам вирусных белков, в том числе в острой фазе заболевания. Таким образом, было проведено исследование спектра антител в динамике у больных ГС в зависимости от перспективы дальнейшего развития патологического процесса по благоприятному или неблагоприятному варианту [10]. В частности, было показано, что быстрое развитие выраженного гуморального иммунного ответа именно по отношению к нуклекапсидному белку ВГС (HCcoreAg), особенно его N-концевому иммунодоминантному региону в течение первых месяцев заболевания, с достижением максимального показателя к 4 месяцу коррелирует с дальнейшим благоприятным исходом. Особенности гуморального иммунного ответа у больных ГС, таким образом, заслуживают дальнейшего более подробного изучения. В последующие годы рядом исследователей были опубликованы работы, посвященные как совершенствованию диагностики ГС с учетом особенностей гуморального иммунного ответа [6, 14], так и взаимосвязи особенностей гуморального иммунного ответа с патогенезом и саноге-незом ГС [1 - 4, 7 - 9, 11, 13, 15]. В настоящей работе проведено исследование особенностей гуморального иммунного ответа у больных острым ГС (ОГС) с различными исходами заболевания на основе моделирования антигенных детерминант ВГС как относительно протяженными линейными синтетическими пептидами, так и еще более протяженными генноинженерными полипептидами. Полученные результаты позволяют провести сравнение с данными, полученными Кругловым И.В. и др. [10], сероконверсии антител у больных ГС с использованием синтетических пептидов, моделирующих иммунодоминантные антигенные детерминанты ВГС. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследование были включены 20 пациентов с желтушной формой ОГС при отсутствии тяжелых соматических и психических заболеваний, а также онкологических и аутоиммунных патологий, иммунодефицитных состояний и гепатитов иной этиологии. На основании клинико-биохимической картины и выявления РНК ВГС методом ПЦР в сыворотке крови в течение 12 месяцев от начала заболевания эти больные были разделены на 2 группы: у 14 (70%) из 20 больных заболевание приняло хроническое течение, у 6 (30%) пациентов заболевание закончилось спонтанной ре-конвалесценцией. Исследование методом ИФА, позволяющим раздельно выявлять IgM и IgG к различным антигенным детерминантам ВГС в сыворотках крови больных, проводилось в первые 10 дней желтушного периода и в течение 4 месяца заболевания (под началом заболевания здесь подразумевается начало желтушного периода). В качестве антигенов при проведении ИФА были использованы генноинженерные белки core, NS3, NS4, NS5 ВГС и синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям core-белка ВГС 1b а.о. 1 - 18, 13 - 33, 61 - 87. Генноинженерный белок core ВГС - это рекомбинантный полипептид, включающий первые 150 аминокислот HCcoreAg [12]. NS3, NS4 и NS5 ВГС - рекомбинантные белки, используемые в диагностической тест-системе фирмы «Диагностические системы» (Н.Нов-город). РЕЗУЛ ЬТАТЫ В результате проведенного исследования было установлено, что у больных ГС с последующей реконвалесценцией к 4 месяцу заболевания уровень IgG, взаимодействующих с участком 1 - 150 а.о. нуклекапсидного белка ВГС (anti-HCcore 1 - 150 IgG), был достоверно выше (рис. 1), чем у больных ГС с последующим развитием хронического гепатита (рис. 2) (р<0,05). Тоже самое можно сказать относительно IgG, взаимодействующих с участком 13 - 33 а.о. нуклекапсидного белка ВГС (anti-HCcore 13 - 33 IgG) (р<0,05). При этом, если говорить о частоте выявления anti-HCcore IgG, то она к 4 месяцу заболевания также становится достоверно выше у больных ГС с последующей реконвалесценцией, чем у больных ГС с последующим развитием хронического гепатита (р<0,01). Это характерно как для anti-HCcore 1 - 150 IgG, так и Рис. 1. Anti-HCV IgG. Реконвалесценция. По оси ординат - OD, по оси абсцисс столбики слева направо - anti-HCcore 1-150 IgG, anti-HCcore 1-18 IgG, anti-HCcore 13-33 IgG, anti-HCcore 67-81 IgG, anti-HCNS3 IgG, anti-HCNS4 IgG, anti-HCNS5 IgG, 3,0 ед. OD (здесь и на рис. 2). Рис. 2. Anti-HCV IgG. Хронизация. для IgG, взаимодействующих с участком 1-18 а.о. нуклекап-сидного белка ВГС (anti-HCcore 1-18 IgG) и anti-HCcore 13 - 33 IgG. Во всех этих трех случаях anti-HCcore IgG были выявлены у 100% пациентов с последующей реконвалесценцией и только у 58, 42 и 58 % больных с последующей хронизацией заболевания соответственно. Что касается anti-HCV IgM, то единственным маркером данного класса, частота выявления которого статистически достоверно различалась у больных ГС с различными исходами, были anti-HCcore 1 - 150 ^М. Частота их выявления на 4 месяце заболевания составила 100% у пациентов с предполагаемой реконвалес-ценцией и 67% у больных с последующей хронизацией процесса (р<0,01). В случае anti-NS5 IgG имеет место обратная тенденция, и тенденция эта также статистически достоверна (р<0,01), как в том, что касается частоты выявления anti-NS5 IgG на 4 месяце заболевания (75% у больных с последующей хронизацией и 0% у пациентов с последующей ре-конвалесценцией), так и в том, что касается уровня anti-NS5 IgG в этот период у больных с последующей хронизацией. Единственным маркером, частота выявления которого статистически достоверно (р<0,05) различалась у больных ОГС с различными исходами в первые 10 дней заболевания, были anti-NS4 IgG. В этот срок они были выявлены у 50% больных с последующей реконвалесценцией и не выявлены ни у одного больного с последующим развитием хронического гепатита. Рис. 3. Anti-HCV IgM. Реконвалесценция. По оси ординат - OD, по оси абсцисс столбики слева направо - anti-HCcore 1-150 IgM, anti-HCcore 1-18 IgM, anti-HCcore 13-33 IgM, anti-HCcore 67-81 IgM, anti-NS3 IgM, anti-NS4 IgM, anti-NS5 IgM, 3,0 ед. oD (здесь и на рис. 4). Рис. 4. Anti-HCV IgM. Хронизация. Аnti-NS3 IgG в первые 10 дней заболевания были выявлены у 83% пациентов с последующей реконвалесценцией и у 54% больных с последующей хрони-зацией заболевания. Аnti-NS3 IgM в первые 10 дней были выявлены у 17% пациентов с последующей реконвалесценцией и у 15% больных с последующей хронизацией. На 4 месяце заболевания аnti-NS3 IgG были выявлены у 100% пациентов с последующей реконвалесценцией и у 92% больных с последующей хронизацией заболевания. Anti-NS3 IgM в этот срок были выявлены у 50% пациентов с последующей реконвалесценцией и у 42% больных с последующей хронизацией. При этом, как по частоте выявления, так и по уровню данных маркеров не было выявлено статистически достоверных различий между двумя группами больных с различными исходами заболевания (рис. 3, 4). ОБСУЖДЕНИЕ Таким образом, при использовании относительно протяженных линейных синтетических пептидов и еще более протяженных генноинженерных полипептидов были получены результаты, позволяющие провести сравнение с данными, полученными в ходе предыдущего исследования сероконверсии антител у больных ГС с использованием синтетических пептидов, моделирующих иммунодоминантные антигенные детерминанты ВГС на участках аминокислотной последовательности 19 - 34 (ссге), 1921 - 1940 (NS4) и 2295 - 2317 (NS5) [10]. Anti-HCcore 1 - 150 IgM, anti-HCcore 1 - 18 Ig M, anti-HCcore 13 - 33 IgM, anti-HCcore 67 - 81 IgM выявляются в сыворотках крови, в том числе и пациентов с последующей реконвалесценцией на 4 месяце с начала заболевания, более того, частота выявления anti-HCcore 1 - 150 IgM при этом статистически достоверно выше у больных ГС с последующей реконвалесценцией. Поэтому среди спектра anti-HCcore IgM для клинического прогноза наибольшее значение имеют anti-HCcore 19 - 34 IgM, которые не удалось выявить в сыворотках крови больных после первого месяца заболевания в тех случаях, когда последующий исход заболевания был благоприятным [10]. Что касается аnti-core IgG, то можно говорить о сходных закономерностях сероконверсии, выявленных как для anti-HCcore 19 - 34 IgG, так и для anti-HCcore 1 - 150 IgG, anti-HCcore 1-18 IgG и anti-HCcore 13 - 33 IgG. Также как и при сероконверсии anti-HCcore 19 - 34 IgG, у больных ГС с последующей реконвалесценцией к 4 месяцу заболевания уровень anti-HCcore 1 - 150 IgG достоверно выше, чем у больных ГС с последующим развитием хронического гепатита. Тоже можно сказать относительно anti-HCcore 13 - 33 IgG. При этом, если говорить о частоте выявления anti-HCcore IgG, то она к 4 месяцу заболевания также становится достоверно выше у больных ГС с последующей реконвалесценцией, чем у больных ГС с последующим развитием хронического гепатита. Это характерно как для anti-HCcore 1 - 150 IgG, так и для anti-HCcore 1 - 18 IgG и anti-HCcore 13 - 33 IgG. Таким образом, при проведении исследования сероконверсии anti-HCcore IgG со всеми вышеперечисленными антигенами у больных ГС с различными исходами заболевания выявлены достоверные отличия гуморального иммунного ответа как на белок core ВГС, так и на различные фрагменты иммунодоминантного региона этого белка, что указывает на связь этих особенностей иммунного ответа с перспективой более или менее благоприятного развития заболевания в дальнейшем. Этого нельзя сказать относительно anti-HCcore 67 - 81 IgG, выявляемых при взаимодействии с синтетическим пептидом core 67 - 81, что можно объяснить тем, что данный фрагмент HCcoreAg не относится к иммунодоминантному региону этого белка. Выявленные при использовании генноинженерного антигена NS5 закономерности сероконверсии позволяют считать anti-NS5 IgG прогностическим маркером хронизации заболевания. Если же сравнить полученные данные с результатами предыдущего исследования [10], то можно сказать, что выявленная тенденция характерна также и для anti-NS5 2295-2317 IgG, но для них она была выявлена в более поздний срок - начиная с 6 месяца заболевания. Единственным маркером, частота выявления которого статистически достоверно (р<0,05) различалась у больных ОГС с различными исходами в первые 10 дней заболевания, были anti-NS4 IgG. Можно говорить о сходных тенденциях в сероконверсии anti-NS4 IgG в первые 4 месяца заболевания, выявленных как при использовании синтетического пептида NS4 1921-1940 [10], так и при использовании генноинженерного NS4. Сероконверсия а^ь№3 IgG исследовалась только с использованием соответствующего генноинженерного полипептида. При этом, как по частоте выявления, так и по уровню аnti-NS3 IgG и аnti-NS3 ^М не было выявлено статистически достоверных различий между двумя группами больных с различными исходами заболевания. Поэтому в данном случае можно говорить о значении этого антигена для диагностики в тех тест-системах, в которых он используется, но не для прогнозирования исходов заболевания. Кстати, выявленная особенность сероконверсии а^ь№3 IgG выглядит особенно интересно при сравнении полученных данных с результатами, ранее опубликованными другой исследовательской группой [13]. Согласно этим результатам, выявление антител только к core-антигену является характерным для ОГС (66% случаев). Эти результаты вполне сопоставимы с результатами настоящего исследования, однако только тогда, когда речь идет об IgM. Если же говорить об IgG, то в результате настоящего исследования удалось выявить anti-HCNS3 IgG в первые же дни заболевания в таком же или почти в таком же проценте случаев, как и enti-HCcore IgG. Это различие между получеными результатами и ранее опубликованными данными другой исследовательской группы [13], очевидно, является проявлением особенностей гуморального иммунного ответа по отношению к различным антигенным детерминантам HCNS3 протеина, использовавшегося в двух различных исследованиях. Пептиды а.о. 1-18, 13-33 и 61-87 были синтезированы М.Г.Исагулянц (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского), исследование сывороток крови больных на наличие РНК ВГС методом ПЦР было проделано И.Г.Мальковым (ГНЦ Институт иммунологии), серологический материал клинически охарактеризованных больных ГС был предоставлен К.Р.Дудиной и О.О.Знойко (Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И.Евдокимова). Л ИТЕРАТУРА

About the authors

I. V Kruglov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

References

Supplementary files