EFFECTIVENESS OF FULLERENE-(TRIS-AMINOCAPRONIC ACID) HYDRATE IN THE MODEL OF EXPERIMENTAL VIRAL-BACTERIAL PNEUMONIA OF MICE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Грипп является острым респираторным инфекционным заболеванием, наносящим вред здоровью людей и приводящим к огромным экономическим потерям. Большая часть смертельных исходов от гриппа обусловлена вторичными бактериальными осложнениями, среди которых ведущую роль занимают пневмонии. Среди этиологических агентов вторичных пневмоний наиболее значимыми являются Streptococcus pneumoniae и Staphylococcus aureus, причем в последнее время увеличилась смертность в результате вторичной бактериальной пневмонии, вызванной S. aureus, развивающейся после гриппозной инфекции среди детей [9]. Предполагается, что профилактика и лечение гриппозной инфекции может быть лучшей стратегией для сокращения вторичных осложнений от гриппа. В частности, выявлено, что вакцинация против гриппа снижает количество госпитализаций по поводу пневмонии у пожилых людей, а использование противогриппозных препаратов для лечения гриппозной инфекции приводит к снижению количества дальнейших бактериальных осложнений. Такие же данные получены на экспериментальной модели вторичной бактериальной пневмонии, развивающейся после гриппозной инфекции. Показано, что применение ингибитора нейраминидазы озельтамивира у мышей, инфицированных вирусом гриппа А с последующим заражением S. pneumoniae, снижает смертность в результате вторичной бактериальной пневмонии, развивающейся после гриппозной инфекции, уменьшает проявление ее симптомов и облегчает протекание инфекции [7, 8]. Сходные данные были получены с лицензированным в 2011 г. новым ингибитором нейрами-нидазы перамивиром, а также препаратом флюдаза (NeoBix, США), находящемся на 3 стадии клинических испытаний [3], [Tanaka A. et al., 2014]. Несмотря на успехи химиотерапии гриппозной инфекции, круг противогриппозных препаратов, прошедших полное доклиническое изучение с доказанной эффективностью и безопасностью в клинических испытаниях, невелик. Кроме того, имеющиеся препараты имеют ряд ограничений в виде побочных эффектов и развития резистентности к ним. Поэтому разработка новых противогриппозных препаратов остается актуальной. На стадии доклинического изучения находится соединение фуллерен-(трис-аминокапроновой кислоты) гидрат (далее ФТАККГ) (ЗАО «ИНТЕЛФАРМ») [1]. Показано, что обладая низкой токсичностью, данное соединение подавляет репродукцию ряда вирусов [1, 2], включая вирусы гриппа А и В в культуре клеток, и эффективно на модели гриппозной пневмонии мышей. Целью настоящей работы являлось изучение эффективности различных лекарственных форм ФТАККГ на модели экспериментальной вирусно-бактериальной пневмонии мышей. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для внутрибрюшинного введения 7 мг ФТАККГ (синтезирован ЗАО «ИНТЕЛФАРМ») и 7 мг трисамина растворяли в 10 мл дистиллированной воды. 1% суп-позиторую массу ФТАККГ готовили, добавляя к 490 г суппозиторной основы 5 г ФТАККГ и 5 г трисамина. Субстанцию арбидола (ЦХЛС-ВНИХФИ) растворяли в 1% растворе крахмала. Для приготовления озельтамивира содержимое капсул тамифлю (Хоффман-ля-Рош) растворяли в дистиллированной воде. Дозы всех использованных препаратов готовили из расчета содержания чистой субстанции в лекарственной форме непосредственно перед проведением эксперимента. Животным вводили по 200 мкл раствора внутрибрюшинно, а также по 0,5 и 1 г суппозиторной массы рек-тально. Для моделирования гриппозной инфекции использовали штамм вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (H1N12009), полученный из ВОЗ и адаптированный к мышам. Культура штамма S. aureus (НИИВС им. И.И.Мечникова) хранилась в лиофилизиро-ванном состоянии. Для получения живой культуры ампулу в стерильных условиях вскрывали и добавляли 1 мл питательного бульона (ГРМ-бульон, ГНЦ ПМБ). Суспензию переносили в пробирку объемом 2 мл и инкубировали 4 ч при температуре 37°С. Затем осуществляли посев на скошенный питательный агар (ГРМ-агар, ГНЦ ПМБ). Пробирки с культурой инкубировали в течение 18 ч при температуре 37°С, по стандарту мутности определяли содержание бактерий в 1 мл объема и в этот же день использовали для заражения животных. Мышей BALB/с самок массой 12 - 14 г получали из питомника «Андреевка» (Московская обл.) и содержали в стандартных условиях. Взвешенных мышей инфицировали интраназально вирусом гриппа, затем через 4 дня - S. аureus. В день заражения вирусом начинали лечение животных противовирусными препаратами и продолжали его в течение 5 дней. ФТАККГ вводили внутрибрюшинно в концентрации 10 мг/кг/день, ректально 25 мг/кг/день и 50 мг/кг/ день, озельтамивир 10 мг/кг/день, арбидол 40 мг/кг/день. За леченными и контрольными животными вели ежедневное наблюдение, в первые 5 дней после инфицирования вирусом мышей взвешивали каждый день, далее через день. Химиотерапевтическую активность соединений на модели вирусно-бактериальной пневмонии мышей оценивали по выживаемости животных, увеличению средней продолжительности жизни и уменьшению снижения веса. Среднюю продолжительность жизни и уменьшение или увеличение веса рассчитывали по [5]. Животные контрольной группы были инфицированы вирусом гриппа и S. аureus и не получали никакого лечения. На 6 день после инфицирования вирусом гриппа (на 2 день после заражения S. aureus) в каждой группе под эфирным наркозом умервщляли по три мыши, в стерильных условиях извлекали легкие, гомогенизировали их и ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Суспензию осветляли от клеточного дебриса центрифугированием (2000 g 10 мин.), 0,1 мл супернатанта отбирали для определения бактериальной плотности, а оставшийся супернатант использовали для определения инфекционного титра вируса в культуре клеток MDCK. Определение титра вируса и плотности бактерий в легких мышей проводили по [5]. На 6 день после инфицирования вирусом гриппа в каждой группе умервщляли по три мыши, извлекали легкие, фиксировали их 10% забуференным формалином, обезвоживали в спирте восходящей концентрации и заключали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, просматривали в световом микроскопе Olympus-BS250 при увеличениях х10, 40, 100. РЕЗУЛ ЬТАТЫ В первой серии экспериментов изучена эффективность ФТАККГ в виде субстанции внутрибрюшинно и ректальных свечей на модели вирусно-бактериальной пневмонии мышей, при этом животных заражали S. аureus на 4 день после вирусного заражения внутрибрюшинно или интраназально. В контрольной группе животных, зараженных вирусом гриппа и S. aureus внутрибрюшинно, начиная с 7 дня после вирусного заражения, наблюдали гибель животных, а к 15 дню погибли все мыши. Снижение массы тела наблюдали, начиная с 5 дня после заражении вирусом (достигало 27 - 30% к 14 дню). Лечение ФТАККГ внутрибрюшинно и ректально, также, как и лечение арбидолом и озельтамивиром перорально, привело к увеличению выживаемости и средней продолжительности жизни. В этих же группах не отмечено снижения массы тела (табл. 1). Наибольшее подавление титра вируса в легких по сравнению с группой контроля наблюдали у животных, леченных субстанцией ФТАККГ внутрибрюшинно и озель-тамивиром перорально, в то время как применение ФТАККГ ректально в обеих изученных дозах не оказывало существенного влияния на титр вируса по сравнению с контрольной группой. Во второй серии экспериментов изучена эффективность различных лекарственных форм ФТАККГ при интраназальном заражении мышей S. aureus. В контрольной группе животных, зараженных интраназально S. aureus на 4 день после вирусного заражения и не получавших никакого лечения, начиная с 5 дня наблюдали гибель мышей, к 15 дню погибли 8 из 10 животных, а 2 оставшихся в живых стали набирать вес. Максимальная потеря веса (20%) в контрольной группе животных наблюдалась на 11 день после заражения. Лечение ФТАККГ внутрибрюшинно защищало от гибели 60% инфицированных животных, увеличивало среднюю продолжительность жизни в 1,16 раза и было сравнимо с лечением озельтамивиром перорально в дозе 10 мг/кг/день. Эффективность лечения ФТАККГ ректально зависела от дозы препарата, увеличива- Таблица 1. Средняя продолжительность жизни, выживаемость и титр вируса при внутрибрюшинном (в/б) и интраназальном (и/н) заражении S. aureus ясь с ее повышением, в дозе 50 мг/кг/ день она была сравнима с лечением ар-бидолом, и это лечение полностью пре- Группы Средняя продолжительность жизни, дни Выживаемость, % Титр вируса, lg ТЦИД50 в/б и/н в/б и/н в/б и/н дотвращало гибель А/Калифорния/04/ 09+S. аигеш Озельтамивир 10 мг/ кг/день 10,9 10,4 13,2 14,8 0 31 20 60 4,4+0,1 2,25+0,4 6,2+0,6 3,8+0,7 животных. Лечение всеми исследуемыми препаратами позволило предотвратить Арбидол 40 мг/кг/ 18,9 18,1 90 92 3±0 5,1+0,4 потерю мышами масдень ФТАККГ в/б 10 мг/ кг/день ФТАККГ ректально 25 мг/кг/день 18,6 15,4 90 60 1,9+1,6 4,9+0,5 сы тела. В отличие от мо- 18,7 17,6 90 80 4+0 4,8+0,6 дели вирусно-бактериальной пневмо- ФТАККГ ректально 18,8 >21 90 100 3,9+0,4 4,5+0,5 нии мышей, инду- 50 мг/кг/день цированной вирусом Таблица 2. Средняя продолжительность жизни, выживаемость и титр вируса при низкой и высокой дозе интраназального заражения S. аш^ш после заражения вирусом гриппа Группы Средняя продолжительность жизни, дни Выживаемость, % Титр вируса, lg ТЦИД50 Плотность бактерий, ^КОЕ/мл Низкая Высокая Низкая Высокая Низкая Высокая Низкая Высокая доза доза доза доза доза доза доза доза А/Калифорния/04/ 09+S. ашеш 13,5 9,5 25 0 8,7+0,3 6,7+1 4,5+0,5 >4 Озельтамивир 11,5 8,5 25 0 4,3+0,1 4,1+0,4 0,4+0,5 2+0 Арбидол 15,8 13 50 43 6,3+0,3 2+0,5 0,4+0,5 2+0 ФТАККГ в/б >21 15,4 100 63 7+0,5 5+0,5 1,2+0,7 1+0 ФТАККГ ректально 25 мг/кг/день >21 13,3 100 33 6±0 4,7+0,8 1,2+0,9 1,5+0,5 ФТАККГ ректально 50 мг/кг/день >21 15,6 100 74 6+0,5 5+0,5 1,1+0,5 0,5+0,5 с последующим внутрибрюшинным заражении S. aureus, при интраназальном заражении S. aureus результаты лабораторных исследований подтвердили данные клинических наблюдений (табл. 1). Титр вируса в легких при лечении ФТАККГ, а также озельтамивиром и арбидолом был ниже титра вируса в легких животных, не получавших лечения. Для более детального изучения эффективности ФТАККГ в следующей серии экспериментов для моделирования пневмонии использовали интраназальное заражение мышей культурой S. аureus в двух дозах: низкой (2х107 КОЕ/мл) и высокой (2х109 КОЕ/ мл). В соответствии с дозой заражения в контрольной группе животных, зараженных вирусом и низкой дозой S. aureus, не получавших лечения, к 15 дню погибло 75% животных. Наименее эффективным в этой серии экспериментов оказалось лечение озельтамивиром, которое защищало 25% животных от гибели и незначительно снижало потерю массы мышей. Лечение арбидолом защищало от смертности половину животных, снижая потерю веса в данной группе. Наиболее эффективным оказалось лечение всеми лекарственными формами и дозами ФТАККГ, полностью предотвращавшее гибель животных (табл. 2). Лечение всеми лекарственными формами ФТАККГ и арбидолом снижало титр вируса в легких животных. Кривая плотности бактерий в легких в группах, леченных всеми лекарственными формами ФТАККГ, оказалась сходной и незначительно отличалась от таковой в группах, леченных озельтамивиром и арбидолом, а также значительно ниже, чем в контрольной группе. В контрольной группе животных, инфицированных высокой дозой S. аureus ин-траназально на 4 день после вирусного заражения, погибли все животные, а максимальная потеря веса наблюдалась на 9 день и составила 21%. Наибольшая эффективность лечения отмечена в группах, леченных ФТАККГ внутрибрюшинно и ректально в дозе 50 мг/кг/день, в этих группах выжило 60 - 70% животных. Лечение арбидолом и ФТАККГ ректально в дозе 25 мг/кг/день было менее эффективно, защищая от гибели 30 - 40% животных и увеличивая продолжительность жизни в 1,4 раза по сравнению с контрольной группой. Лечение озельтамивиром перорально не защищало животных от гибели, но незначительно увеличивало среднюю продолжительность жизни. Лечение ФТАККГ, а также арбидолом приводило к снижению потери веса животными (табл. 2) Определение титра вируса и плотности бактерий в легких мышей показало, что лечение всеми препаратами подавляло размножение вируса и бактерий. Наибольшее влияние на снижение плотности бактерий оказало внутрибрюшинное и ректальное введение ФТАККГ в дозе 50 мг/кг/день. Важно отметить, что при обоих дозах заражения , несмотря на то, что лечение озельтамивиром не защищало от гибели животных, оно значительно подавляло титр вируса и плотность бактерий в их легких (табл. 1 и 2). При морфологическом изучении легких мышей с экспериментальной вируснобактериальной пневмонией выявлены распространенные деструктивные изменения воздухоносных путей в сочетании с обширными фокусами пневмонии в периброн-хиальной паренхиме. Отмечена характерная некротизация реснитчатого эпителия с массивными скоплениями полиморфно-ядерные лейкоцитов (ПЯЛ) в просвете крупных бронхов и заполнение гнойно-слизистым экссудатом более мелких (рис., А). Крупные участки бронхопневмонии консолидировались с обширными зонами пери-васкулярных и, особенно, субплевральных пневмонических фокусов (рис., В). Некротизация межальвеолярных перегородок сопровождалась крупными скоплениями ПЯЛ в этих зонах (рис., С). Сохраняющая воздушность легочная ткань у нелеченных мышей составляла не более 30% площади среза, межальвеолярные перегородки повсеместно утолщены за счет отека и инфильтрации клеточными элементами воспаления, в том числе ПЯЛ. При изучении морфологии легких экспериментальных мышей, получавших лечение ФТАККГ внутрибрюшинно, положительная динамика воспалительного процесса хорошо прослеживалась во всех отделах органов дыхания. Структурные изменения бронхов различного калибра были выражены, в основном, в виде очаговой инфильтрации эпителия и подслизистого слоя мононуклеарами с небольшой примесью ПЯЛ (рис., D), так что просвет воздухоносных путей оставался свободным. Крупные фокусы перибронхиального воспаления (рис., E) выявляли реже, чем в контрольной, нелеченной группе животных. Среди клеточных элементов воспаления преобладали мононуклеары (рис., F), что соответствовало характерной картине разрешающейся пневмонии. В периваскулярных, реже субплевральных, участках определяли небольшие зоны малоклеточного экссудативного воспаления с сохранением структуры альвеолярной паренхимы. Воздушная Изменения органов дыхания у мышей с сочетанной вирусно-бактериальной пневмонией (A-C) и морфологические признаки положительной динамики воспалительного процесса в легких подопытных мышей, леченных ФТАККГ внутрибрюшинно (D-F). A - гнойно-слизистый экссудат заполняет просвет бронха, х10; B - консолидация периброн-хиальных, периваскулярных и субплевральных пневмонических фокусов, х10; С - некроз межальвеолярных перегородок, х40; D - очаговый инфильтрат в стенке бронха, х10; Е - крупный фокус перибронхиального воспаления, х10; F - преобладание мононуклеаров в составе воспалительного инфильтрата, х40. паренхима у леченных мышей занимала до 70% площади гистологического среза. Межальвеолярные перегородки местами сохраняли умеренную инфильтрацию клеточными элементами воспаления, среди которых ПЯЛ определяются относительно редко. Таким образом, морфологическая картина органов дыхания у подопытных мышей, леченных ФТАККГ, коррелировала с данными вирусологического и микробиологического исследований и свидетельствовала о терапевтическом эффекте препарата, разрешении фокусов бронхопневмонии на модели сочетанной вируснобронхиальной инфекции. ОБСУЖДЕНИЕ Препарат ФТАККГ с выявленной противогриппозной активностью в культуре клеток и на модели гриппозной пневмонии мышей находится на стадии доклинического изучения. В настоящей работе изучена эффективность его различных лекарственных форм (инъекционная и ректальная в виде свечей) в стандартизированной экспериментальной модели сочетанной вирусно-бактериальной пневмонии. В экспериментах было использовано заражение вирусом гриппа с последующим заражением S. аureus внутрибрюшинно или интраназльно в высокой и низкой дозах. При всех схемах заражения лечение ФТАККГ внутрибрюшинно было эффективно по клиническим вирусологическим и микробиологическим критериям и по сравнительному патоморфологическому изучению легких контрольных и леченных животных. Эффективность лечения ФТАККГ ректально зависела от дозы, увеличиваясь с ее повышением. При интраназальном заражении S. аureus эффективность подтверждалась по клиническим признакам, вирусологическими и микробиологическими критериям, при внутрибрюшинном заражении применение ФТАККГ ректально снижало смертность животных и потерю их веса, увеличивало среднюю продолжительность жизни, но не оказывало существенного влияния на титр вируса по сравнению с контрольной группой. Эти данные в совокупности с ранее полученными данными при моделировании вирусно-бактериальной пневмонии позволяют предположить, что пневмония более выражена при интраназальном, чем при внутрибрюшинном заражении S. aureus. Для сравнения в экспериментах были использованы два противогриппозных препарата с различными механизмами действия - ингибитор нейраминидазы озельтамивир и ингибитор гемагглютинина арбидол [6, 8]. Эффективность ФТАККГ была сравнима с эффективностью арбидола и превышала значительно эффективность озельтами-вира. Причина низкой эффективности озельтамивира по клиническим характеристикам с выраженным подавляющим эффектом размножения вируса в легких в использованной нами модели требует дальнейшего изучения. Одна из возможных причин - использование вместо субстанции готовой лекарственной формы препарата, биодоступность которой из-за добавочных веществ значительно уменьшается у мышей. Следует отметить также, что высокая эффективность озельтамивира показана в нескольких международных исследованиях на модели вторичной бактериальной пневмонии после гриппа, вызванной S. pneumoniae, однако при наличии в этих лабораториях модели, индуцированной S. aureus, аналогичные данные отсутствуют [3, 4, 7, 8]. Таким образом, высокая эффективность ФТАККГ на модели сочетанной вирусно-бактериальной пневмонии мышей наряду с его низкой токсичностью и выявленной ранее противогриппозной активностью в культуре клеток и на животных дают основания для дальнейших доклинических и клинических исследований, при этом полученные данные могут быть использованы для разработки их дизайна при выборе схем и доз лечения. Л ИТЕРАТУРА

About the authors

I. N Falynskova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

E. I Leonova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

I. T Fedyakina

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

N. R Makhmudova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

L. N Lepekha

Central Research Institute of Tuberculosis

N. A Mikhailova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

L. D Rasnetsov

INTELFARM Company

V. V Zverev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

I. A Leneva

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

References

Supplementary files