COLD-ADAPTED A/KRASNODAR/101/35/59 (H2N2) STRAIN - A PROMISING STRAIN-DONOR OF ATTENUATION FOR PROCURATION OF LIVE INFLUENZA VACCINES

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Имеющийся к настоящему времени опыт применения холодоадаптированной (ХА) живой гриппозной вакцины в России и США показал, что этот препарат обладает большой эффективностью при массовой вакцинации, особенно детей. В настоящее время для получения живой ХА гриппозной вакцины в России используют ХА штамм А/Ленинград/134/17/57 (Н2№), а в США - ХА штамм А/Энн Арбор/6/60 (Н2№) [1, 7].Эти штаммы - доноры аттенуации, полученные путем пассажей при пониженной температуре, обладают ts, ca и att-фенотипом, то есть не способны к репродукции при повышенной температуре, хорошо репродуцируются при пониженной температуре и аттенуированы для животных и людей. Генетическая стабильность ХА штаммов, а также мутации, которые отвечают за их фенотип, хорошо изучены [2, 6]. Однако применяемый в России ХА штамм-донор А/Ленинград/134/17/57 оказался генетически гетерогенным [4] и обнаруживал повышенную реактогенность для детей раннего возраста [1]. Учитывая это обстоятельство, в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова был получен новый ХА штамм-донор аттенуации А/ Краснодар/101/35/59(Н2№) и выявлены мутации в РНК-сегментах его генома, кодирующих «внутренние» белки. Данный штамм обладал приемлемыми фенотипическими характеристиками [3]. Однако возможность получения ХА реассортантов-кандидатов в живые гриппозные вакцины на базе ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2№), обладающих хорошими защитными свойствами, необходимыми для живых гриппозных вакцин, остается не исследованной. Всестороннее изучение биологических свойств реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/ Краснодар/101/35/59 (Н2№) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А, является необходимым условием для оценки перспективности данного штамма как эффективного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин. В данной работе мы исследовали биологические свойства реассортантов между ХА штаммом А/ Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентными штаммами вируса гриппа А/ Берн/07/95(НШ1) и А/Кумамото/102/02(Н3№). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали ХА штамм-донор аттенуации А/Краснодар/101/35/59(Н2№), эпидемические штаммы А/Кумамото/102/02(Н2№), А/Берн/07/95(НШ1), а/ Чили/1/83(Н1Ш), А/Москва/904/77(НШ1), штамм A/WSN/33(mN1). Также исследовали реассортанты, полученные при скрещивании штамма А/Краснодар/101/35/59 со штаммом А/Кумамото/102/02(Н3^): А/Кумамото/R!, А/Кумамото^2, А/ Кумамото^3, и реассортанты, полученные при скрещивании штамма А/ Краснодар/101/35/59 со штаммом А/Берн/07/95 (НШ1): А/Берн/R! и А/Берн/Я2. 9 - 11-дневные куриные эмбрионы заражали по стандартной методике 10-кратными разведениями вируса в аллантоисную полость (0,2 мл на 1 эмбрион), после чего инкубировали их 48 часов в термостате при температуре 36 - 34°C. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли по реакции гемагглютинации с 0,5% суспензией эритроцитов кур. Инфекционный титр вируса в ЭИД50/0,2 мл рассчитывали по методу Кербера. Для получения реассортантов применяли метод рекомбинации, описанный Полежаевым И.Ф. и др. [5] и модифицированный нами. Вируссодержащую аллантоисную жидкость из эмбрионов, инфицированных вирулентным штаммом, разводили средой Игла МЕМ в отношении 1:10 и вносили в чашки Петри. Инактивацию вируса осуществляли с помощью УФ-установки, снабженной УФ-лампой G8WT5, Germicidal, 288 mm. Инактивацию проводили с расстояния 25 см при облучении в течение 90 сек. Потеря инфекционного титра вируса наблюдалась в пределах 6,0 lg ЭИД50. Рекомбинацию проводили путем совместного инфицирования куриных эмбрионов родительскими вирусами в дозе 107,5 ЭИД50/0,2 мл. Инфицированные эмбрионы инкубировали в течение 18 часов при 32°C. Затем аллантоисную жидкость отсасывали и пассировали дважды в куриных эмбрионах в присутствии антисыворотки к штамму А/Краснодар/101/35/59(Н2№) при 25°C. Полученные реассортанты клонировали в куриных эмбрионах методом предельных разведений. Для определения ts и ca фенотипа исследуемых штаммов проводили титрование одновременно при оптимальной, пониженной и повышенной температуре(34^ и 38 - 40°C), пассаж проводили в течение 48 часов, а при пониженной температуре (26°C) - в течение 5 - 6 суток. Разницу в уровне репродукции вируса гриппа при разной температуре выражали величиной RCT (reproductive capacity at different temperature), которая определяется как разница между инфекционным титром вируса при оптимальной температуре 34°C и титром при исследуемой температуре, измеряемой в lg ЭИД50/0,2 мл. Для определения репродукции вируса в легких мышей ( att-фенотип) группы беспородных мышей (самки 10 - 12 гр, по 5 - 10 мышей на группу) заражали интраназально под легким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 107,5 ЭИД50/0,2 мл (по 50 мкл на мышь ). Через 72 часа после заражения у мышей извлекали легкие. Инфекционный титр вируса в 10% суспензии легких мышей определяли методом титрования в куриных эмбрионах и выражали в ЭИД5о/0,2 мл. Группы мышей иммунизировали интраназально под легким эфирным наркозом ХА-реассортантами в инфекционном титре 106 5 ЭИД50/0,2 мл ( по 50 мкл на мышь). Через 21 день мышей повторно иммунизировали теми же вирусами. Еще через 10 дней мышей инфицировали интраназально дикими вирулентными штаммами, и через 3 дня у мышей извлекали легочную ткань и определяли репродукцию вируса в легких. Для секвенирования использовали ПЦР-продукты, очищенные на колонках Wizard («Promega», США). Секвенирование проводилось фирмой «Евроген» на автоматическом секвенаторе MegaBACE-500. Для анализа нуклеотидных последовательностей, а также для подбора праймеров для ПЦР и секвенирования использовали пакеты программ VectorNTI 10.0. Синтез праймеров проводился фирмой «Литех» (Москва). Статистическая обработка проводилась с использованием среднего квадратического отклонения и коэффициента Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Наиболее оптимальным сочетанием родительских генов в геноме ХА реассортан-тов-кандидатов в живые гриппозные вакцины является формула 6+2, согласно которой геном ХА реассортанта содержит 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ХА штамма-донора аттенуации, и два гена, кодирующих поверхностные гликопротеины НА и NA от вирулентного эпидемического штамма. В этой связи, на первой стадии исследования был проведен анализ генома наших ХА реассортантов, полученных методом классической реассортации. Из множества доступных методов нами был выбран метод секвенирования. Предварительно был проведен подбор эффективных праймеров для каждого РНК-сегмента генома реассортантов, что позволило оптимизировать работу. Результаты анализа генома реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2№) и вирулентного штамма А/ Кумамото/102/02(Н3№), показали, что все исследованные реассортанты имели 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ХА штамма, и 2 гена, кодирующих гемаг-глютинин и нейраминидазу от вирулентного штамма А/Кумамото/102/02 (Н3№). Реассортанты, полученные при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2№) и вирулентного штамма А/Берн/07/95( Н1Ш), также унаследовали 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ХА штамма, и 2 гена, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу от вирулентного штамма А/Берн/07/95(НШ1). Полученные данные свидетельствовали о том, что ХА реассортанты, во-первых, имеют наиболее оптимальное сочетание генов и, во-вторых, имеют гены, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу от вирулентных штаммов. На начальной стадии работы были исследованы ts и ca фенотипы штаммов родительских вариантов. ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2№) полностью утратил способность размножаться при 40°С и 38°С, но хорошо размножался при 34°С и 26°С. При заражении куриных эмбрионов ХА штаммом инфекционные титры вируса при 34°С составляли 107,5 ЭИД50/0,2 мл, при 26°С - 105,5ЭИД50/0,2 мл и при 38°С - менее 1010 ЭИД50/0,2 мл. В то же время, титры вирулентного штамма А/Кумамото/102/02 (Н3Ш) составляли 106,5 ЭИД50/0,2 мл при 40°С, 107,5 ЭИД50/0,2мл при 34°С, а при 26° С этот штамм не размножался (табл.). Другой эпидемический штамм А/ Берн/07/95(НШ1) активно размножался при 38°С (титр> 106,5 ЭИД50/0,2 мл) и при 34°С (титр-107,5 ЭИД50/0,2 мл) и также не размножался при 26°С (табл.). Ts и са маркеры являются важнейшими маркерами аттенуации для ХА реассор-тантов - кандидатов в живые гриппозные вакцины. Поэтому на следующем этапе были исследованы данные генетические признаки у полученных нами ХА реассор-тантов. Как видно из табл., все реассортанты, полученные при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02 в отличие от своего вирулентного родителя утеряли способность размножаться при 40°С. С другой стороны, все полученные реассортанты приобрели способность к активному размножению при пониженной температуре (26°С). Реассортанты, полученные при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и вирулентного штамма А/ Берн/07/95 также практически утеряли способность к размножению при 38°С, однако приобрели способность к размножению при 26°С. Полученные факты свидетельствуют о том, что все изученные реассортанты обладают четко выраженным ts и ca-фенотипом. Реассортанты, полученные при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2№) и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02 (Н3№), активно реагировали в РЗГА с антисывороткой к Н3№ серотипу и не реагировали с антисывороткой к Н2№ серотипу. Титры сывороточных антител в РЗГА при взаимодействии реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2№) и вирулентного штамма А/Берн/07/95, с антисывороткой к НШ1 серотипу достигали высоких значений (1:640), в то время как ни один из полученных реассортантов не реагировал с антисывороткой к ^N2 серотипу. Полученные данные еще раз свидетельствовали о том, что ХА реассортанты унаследовали ген, кодирующий гемаг-глютинин, от вирулентных штаммов. Представляло интерес исследовать также иммуногенную активность полученных реассортантов при интраназальном введении вирусного материала мышам. При исследовании данных по изучению иммуногенности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2№) и вирулентного штамма А/ Берн/07/95 (НШ1), установлено, что титр антител в сыворотке крови мышей, имму- Результаты изучения ts и ca фенотипа ХА реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/ Краснодар/101/35/59(Н2№) и вирулентных штаммов А/Кумамото/102/02(Н2Ш) и А/Берн/07/95 (НШ1) Родительские варианты и реассортанты Титр вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах (lg ЭИД50/0,2 мл) RCT признак (lg ЭИД50/0,2мл) При 26°С При 34°С При 38°С При 40°С RCT26 RCT38 RCT40 А/Кумамото/R! 5.0+0.5 7.5±0.9 <1.0 2.5 7.5 А/Кумамото^2 6.0±0.4 8.0±0.7 <1.0 2.0 8.0 А/Кумамото^3 5.5+0.7 7.5±0.5 <1.0 2.0 7.5 А/Кумамото/102/02(Н3Ш) <1.0 7.5±1.0 6.5±0.5 7.5 1.0 А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) 5.5+0.3 7.5±0.5 <1.0 <1.0 2.0 7.5 А/Берн/R! 5.0±1.0 7.5±0.7 <1.0 2.5 7.5 А/Берн^2 5.0±1.0 >8.0 <1.0 3.0 8.0 А/Берн/07/95 ( H1N1) <1.0 7.5±0.7 >6.5 7.5 1.0 низированных диким штаммом А/Берн/07/95 (H1N1), равнялся 1:320. Титры антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных реассортантами А/Берн/R! и А/Берн/ R2, равнялись соответственно 1:213±84 и 1:266±54. Титр антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных интраназально реассортантами А/Кумамото/R!, А/ Кумамото/R2, A/Кумамото/R3 в дозе 6,5 lg ЭИД50 после двукратной иммунизации равнялся соответственно 213±84, 213±84 и 106±46. Полученные факты свидетельствуют о сравнительно высокой иммуногенности полученных ХА реассортантов на базе штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2№). На заключительном этапе нашей работы нами была исследована защитная эффективность ХА реассортантов А/Берн/R! и А/Берн/R2. Мышей вакцинировали дважды интраназально ХА реассортантами в дозе 6,5 lg ЭИД50/0,05 мл с последующим инфицированием различными дозами вирулентного родительского штамма А/ Берн/07/95 (H1N1) и дрейфовых вариантов А/Чили/1/83 (H1N1) и А/Москва/904/77 (H1N1). Титры вируса в легких при заражении невакцинированных мышей составляли: для штамма А/Берн/07/95 - 3,3±0,3 lg ЭИД50/0,2 мл, для штамма А/ Чили/1/83(НШ1) - 2,0±0,5 lg ЭИД50/ОД мл и для штамма А/Москва/904/77(Н1Ш) - 1,2±0,3 lg ЭИД50/0,2 мл. У вакцинированных мышей в легких не наблюдали вирусного размножения как при заражении родительским вариантом А/Берн/07/95(НШ1), так и при заражении дрейфовыми вариантами. Этот факт свидетельствует о том, что ХА реассортанты, полученные нами, обеспечивают защиту не только против родительского вируса, но и против дрейфовых вариантов вируса гриппа. Реассортанты, выступающие в качестве живых гриппозных вакцин, должны обладать определенным составом генома. Необходимо, чтобы гены, кодирующие поверхностные белки НА и NA, были унаследованы от эпидемического штамма вируса гриппа, а все остальные гены (кодирующие внутренние белки) - от ХА штамма-до-нора (формула генома 6:2). Анализ генома подтвердил, что у всех полученных нами ХА реассортантов гены, кодирующие НА и NA-белки, были унаследованы от диких штаммов А/Берн/07/95 (H1N1) и А/Кумамото/102/02(Н3№), а гены, кодирующие «внутренние» белки, унаследованы от ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2). Таким образом, классический метод рекомбинации, использованный в нашей работе, позволяет получить на базе ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) реассортанты с оптимальным набором родительских генов. При изучении полученных нами методом классической рекомбинации реассортантов было выяснено, что они обладают ярко выраженным ts и ca фенотипом. Все полученные нами реассортанты при температуре 26°С имели титр 5 - 6 lg ЭИД50/0,2 мл, титр 8,0 - 7,5 lg ЭИД50 /0,2 мл при 34°С (RCT26=2,5 - 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл) и практически не размножались при повышенной температуре. Полученные нами ХА реассортанты обладали антигенной специфичностью и достаточным уровнем иммуногенности. Изучение защитной эффективности ХА реассортантов А/Берн^1 и A/Берн/R2 показало, что они обеспечивали защиту не только против родительского вирулентного вируса, но и против дрейфовых вариантов вируса гриппа А/Чили/1/83(НШ1) и А/Москва/904/77 (H1N1). Все вышеперечисленное позволяет сделать вывод, что ХА штамм А/Крас-нодар/101/35/59 (H2N2) является перспективным штаммом-донором аттенуации для получения живых гриппозных вакцин. Л ИТЕРАТУРА

About the authors

S. G Markushin

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

T. M Tsfasman

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

A. V Terekhov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

K. V Lisovskaya

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

I. I Akopova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

References

Supplementary files